本發(fā)明涉及農(nóng)作物育種及制種領(lǐng)域，具體地說，涉及一種利用水稻隱性畸形穎殼恢復(fù)系制種混收并分離雜交種子的方法。

背景技術(shù)：

水稻是世界上最重要的糧食作物之一，全球一半以上的人口以大米為主食，稻谷的產(chǎn)量關(guān)系到世界的糧食安全。自1973年雜交水稻成功實(shí)現(xiàn)三系配套以來，雜交水稻的大面積推廣應(yīng)用為中國乃至世界糧食安全作出了重要貢獻(xiàn)(袁隆平.(2002).雜交水稻學(xué).中國農(nóng)業(yè)出版社.前言.)。但雜交水稻只能利用雙親雜交第一代(f1)，必須年年制種才能保證大田生產(chǎn)用種。傳統(tǒng)雜交水稻制種環(huán)節(jié)多、工序繁雜、勞動(dòng)強(qiáng)度大，屬于勞動(dòng)密集型產(chǎn)業(yè)。隨著社會(huì)的發(fā)展，中國農(nóng)村勞動(dòng)力日益缺乏，且價(jià)格不斷上漲，雜交水稻的制種成本也隨之上漲。業(yè)內(nèi)比較公認(rèn)的看法是，進(jìn)一步提高機(jī)械化水平、提高效率、降低成本是未來雜交水稻制種發(fā)展的趨勢。

目前，主要有3種可提高雜交水稻制種機(jī)械化水平的方法：一是恢復(fù)系、不育系分開種植，利用機(jī)械收集恢復(fù)系花粉為不育系授粉，可單獨(dú)收獲雜交種子。此種方法制種最自由，但水稻花粉保持活力的時(shí)間很短，技術(shù)難度極大，短時(shí)期內(nèi)難以實(shí)現(xiàn)；二是恢復(fù)系、不育系大廂種植，收割機(jī)可分開收獲雜交種子與恢復(fù)系。此種方法較為簡便，但恢復(fù)系所占比例過大，降低了不育系的比例，且恢復(fù)系、不育系距離較遠(yuǎn)授粉難度較大，制種產(chǎn)量較低；三是恢復(fù)系、不育系混種，利用機(jī)械混收雜交種子與恢復(fù)系種子，然后再通過機(jī)械將雜交種子分離出來。利用恢復(fù)系、不育系在某些性狀上的顯著差異，雜交種子和恢復(fù)系種子可實(shí)現(xiàn)分離。此種方法較為復(fù)雜，但不育系比例高，恢復(fù)系、不育系距離近且分布均勻，有利于提高制種產(chǎn)量，是目前提高雜交水稻機(jī)械化制種水平的較好途徑(王杰,鄧華鳳,張武漢,孫平勇,何強(qiáng).(2013).雜交水稻機(jī)械化制種技術(shù)的研究現(xiàn)狀與發(fā)展策略.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),41(13):5682-5683.)。

近年來，在實(shí)現(xiàn)雜交種子和恢復(fù)系種子可分離方面取得了較為豐碩的研究成果。比如，國內(nèi)科研人員提出了基于雙親在除草劑抗性、穎殼顏色等性狀上的差異實(shí)現(xiàn)雜交種子和恢復(fù)系種子分離的技術(shù)策略。但到目前為止，生產(chǎn)上大面積推廣應(yīng)用的尚未見報(bào)道。這主要是由于以下2個(gè)方面的原因：一是這些技術(shù)的配套要求高，短時(shí)間內(nèi)難以達(dá)到。比如，種子色選機(jī)需要較大的投入，相關(guān)技術(shù)研究需要一定的時(shí)間；二是技術(shù)本身存在一定的缺陷。比如，授粉后的恢復(fù)系對除草劑有一定的抗性，而且同一株水稻上籽粒成熟有先后，植株被殺死時(shí)可能有少量種子可以發(fā)芽，從而影響雜交種子純度。因此，迫切需要一種能夠與現(xiàn)有種子加工相結(jié)合、不需要增添新的機(jī)械就能完成雜交種子和恢復(fù)系種子分離的機(jī)械化制種技術(shù)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是解決現(xiàn)有技術(shù)存在的不足之處，提供一種制種混收雜交種子可分離的水稻恢復(fù)系選育方法及其應(yīng)用。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

本發(fā)明首先提供了一種利用水稻隱性畸形穎殼恢復(fù)系制種混收并分離雜交種子的方法，包括如下步驟：

(1)選育出綜合性狀優(yōu)良且具有畸形穎殼性狀的恢復(fù)系；

所述畸形穎殼性狀由隱性單基因或寡基因控制；

(2)以步驟(1)選育得到的恢復(fù)系為父本，以生產(chǎn)上大面積應(yīng)用或新選育的不育系為母本，進(jìn)行廣泛測交，選育出通過省級或國家審定的親本組合；

(3)以所述恢復(fù)系作父本，以步驟(2)得到的相應(yīng)不育系作母本，將二者種子進(jìn)行混播/混插/混拋，雜交種子成熟后和恢復(fù)系種子混收，在種子精選加工過程中去除畸形穎殼的恢復(fù)系種子。

進(jìn)一步地，步驟(1)所述恢復(fù)系為通過遺傳改良方法創(chuàng)制出，綜合性狀優(yōu)良，可直接在生產(chǎn)上應(yīng)用的的畸形穎殼恢復(fù)系。

其中，所述遺傳改良方法包括但不限于雜交、回交、誘變或基因組編輯。

作為優(yōu)選，當(dāng)步驟(1)中利用雜交或回交手段選育恢復(fù)系時(shí)，以隱性單基因或寡基因控制的畸形穎殼材料為供體，通過雜交或回交選育出綜合性狀優(yōu)良且具有畸形穎殼性狀的恢復(fù)系。

作為優(yōu)選，步驟(3)中，混播/混插/混拋的制種田穗數(shù)比例為優(yōu)良恢復(fù)系:不育系＝1:4～1:30。

進(jìn)一步地，步驟(3)中，待水稻抽穗揚(yáng)花后，利用人力、無人機(jī)或自然風(fēng)力由恢復(fù)系給不育系授粉。

本發(fā)明進(jìn)一步的提供了所述方法在制備水稻雜交種子方面的應(yīng)用。

本發(fā)明涉及到的操作如無特殊說明均為本領(lǐng)域常規(guī)操作。

在符合本領(lǐng)域常識的基礎(chǔ)上，上述各優(yōu)選條件，可以相互組合，得到具體實(shí)施方式。

本發(fā)明的有益效果在于：

(1)本發(fā)明采用的恢復(fù)系具有由隱性基因控制的畸形穎殼性狀，不會(huì)對雜交種子及商品糧的穎殼性狀產(chǎn)生影響。同時(shí)，在種子的正常精選加工過程中恢復(fù)系種子得以巧妙去除，不需要增加新的設(shè)備，可節(jié)約成本；

(2)本發(fā)明采用的畸形穎殼性狀由單基因或寡基因控制，有利于降低育種難度，提高育種效率；

(3)本發(fā)明可與現(xiàn)有制種技術(shù)體系無縫銜接，有利于簡化雜交種子和恢復(fù)系種子混收的制種技術(shù)體系。

附圖說明

圖1為隱性畸形穎殼突變體(bls1)穗及籽粒圖。

圖2為隱性畸形穎殼突變體(bls1)散粉圖。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式進(jìn)行詳細(xì)說明。需要理解的是以下實(shí)施例的給出僅是為了起到說明的目的，并不是用于對本發(fā)明的范圍進(jìn)行限制。本領(lǐng)域的技術(shù)人員在不背離本發(fā)明的宗旨和精神的情況下，可以對本發(fā)明進(jìn)行各種修改和替換。

下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

本發(fā)明優(yōu)選畸形穎殼水稻恢復(fù)系的選育及其在混收式水稻制種過程中的應(yīng)用，該應(yīng)用的具體方法為：首先通過雜交、回交或誘變、基因組編輯等遺傳改良方法，選育出綜合性狀優(yōu)良、具有由隱性基因控制的畸形穎殼恢復(fù)系，利用此恢復(fù)系與不育系廣泛測交，選育出通過省級或國家審定的組合。制種時(shí)，將選育組合的恢復(fù)系、不育系種子混播或混插(拋)，利用人力、無人機(jī)或自然風(fēng)力授粉，雜交種子成熟后和恢復(fù)系種子混收，在種子精選加工過程中去除具有畸形穎殼的恢復(fù)系種子，從而完成制種過程。

經(jīng)上述應(yīng)用后混收得到的雜交種子純度一般在98％以上，可達(dá)我國規(guī)定的二級種子96％以上的基本要求。

實(shí)施例1恢復(fù)系的選育

通過雜交、回交或誘變、基因組編輯等遺傳改良方法，選育出綜合性狀優(yōu)良、具有由隱性基因控制的畸形穎殼優(yōu)良恢復(fù)系。水稻中畸形穎殼資源比較豐富，本發(fā)明優(yōu)選為單基因控制的隱性性狀，有利于降低育種難度。如本發(fā)明優(yōu)選的bls1三角穎突變體(xiaodingma等.beaklikespikelet1isrequiredforlateraldevelopmentoflemmaandpaleainrice.plantmolecularbiologyreporter,2013,31(1):98-108)，bls1突變體的特點(diǎn)是穎殼高度開裂、千粒重大幅降低(千粒重降至野生型的一半左右，約12g)，但花粉數(shù)量、活力以及散粉習(xí)性較好，對不育系的授粉能力較強(qiáng)。

以具有隱性畸形穎殼性狀的水稻資源作親本，與其它優(yōu)良恢復(fù)系(如華占、揚(yáng)稻6號等)、常規(guī)稻(如黃華占、五山絲苗等)或育種中間材料進(jìn)行雜交、回交，利用常規(guī)育種方法可從雜交、回交后代中選育出綜合性狀優(yōu)良但具有畸形穎殼的恢復(fù)系。

或者利用誘變方法，如物理誘變、化學(xué)誘變或物理化學(xué)誘變復(fù)合處理生產(chǎn)上大面積應(yīng)用的優(yōu)良恢復(fù)系(如華占、揚(yáng)稻6號等)，從大群體中篩選具有隱性畸形穎殼性狀的優(yōu)良恢復(fù)系。這種方法的缺點(diǎn)是突變方向和頻率不可控，只能依靠擴(kuò)大群體來增加獲得目標(biāo)突變體的可能性；優(yōu)點(diǎn)是一旦獲得目標(biāo)突變體，可快速在生產(chǎn)上推廣應(yīng)用。

也可利用基因組編輯的方法，選用優(yōu)良恢復(fù)系(如華占、揚(yáng)稻6號等)、常規(guī)稻(如黃華占、五山絲苗等)或育種中間材料，對本發(fā)明優(yōu)選的三角穎基因bls1(loc_os02g56610)進(jìn)行敲除。然后通過自交篩選或與野生型雜交、自交篩選去除轉(zhuǎn)基因成分，從而育成不攜帶轉(zhuǎn)基因成分，同時(shí)具有畸形穎殼性狀的優(yōu)良恢復(fù)系。該技術(shù)成熟高效，大部分從事生物技術(shù)研究的實(shí)驗(yàn)室均可順利完成。而且，目前已經(jīng)有生物技術(shù)公司提供此方面的商業(yè)服務(wù)，如武漢伯遠(yuǎn)生物科技有限公司等。

總之，本發(fā)明選育的恢復(fù)系除了具有隱性基因控制的畸形穎殼性狀外，與目前雜交水稻育種上主流的恢復(fù)系選育方法并無其它差異。因此，對本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員來說，實(shí)施本發(fā)明時(shí)可操作性強(qiáng)，而且可根據(jù)實(shí)際情況選用切實(shí)可行的技術(shù)路線。

實(shí)施例2組合選育過程

首先利用實(shí)施例1選育的恢復(fù)系進(jìn)行廣泛測交、品比，篩選出比對照(不同生態(tài)區(qū)、不同熟期的對照不同，一般以當(dāng)?shù)赝愋椭髟云贩N為對照)在產(chǎn)量、米質(zhì)、抗性上有改良、達(dá)到審定要求(每個(gè)省及生態(tài)區(qū)均有相關(guān)規(guī)定，并且不斷修正)的新組合。然后，經(jīng)過相應(yīng)程序后，進(jìn)入省級或國家級區(qū)域試驗(yàn)。經(jīng)2～3年試驗(yàn)并達(dá)到相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)后，通過省級或國家級審定。

需要說明的是，品種審定制度本身在不斷的更新、完善。2014年，國家農(nóng)作物品種審定委員會(huì)下發(fā)了《國家級水稻玉米品種審定綠色通道試驗(yàn)指南》，符合相關(guān)資質(zhì)的種子企業(yè)可以自行開展自有品種區(qū)域試驗(yàn)、生產(chǎn)試驗(yàn)，進(jìn)一步拓展了品種審定的渠道，更有利于滿足市場需求。對本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員來說，這是眾所周知和必須遵循的，本發(fā)明并沒有例外和特殊之處。

總之，本發(fā)明的組合選育與目前主流的組合選育方法及程序并無差異。由于水稻是中國主要農(nóng)作物之一，國家規(guī)定必須通過審定才能在生產(chǎn)上應(yīng)用。因此，本步驟也是必不可少的，但對本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員來說，實(shí)施本步驟并無新的技術(shù)難題，故本實(shí)施例對此不再詳細(xì)說明。

實(shí)施例3制種過程

以恢復(fù)系作為父本，不育系作為母本。

一、恢復(fù)系、不育系混播混收型

當(dāng)恢復(fù)系、不育系播差期＜3天時(shí)，可通過水分調(diào)節(jié)、催芽控制等措施達(dá)到雙親花期理想相遇。水分調(diào)節(jié)主要是針對恢復(fù)系、不育系對缺水的敏感性存在差異進(jìn)行。若恢復(fù)系早于不育系，可在1期至3期控水曬田，控制恢復(fù)系發(fā)育；若不育系早于恢復(fù)系，則在此1期至3期灌水，促進(jìn)恢復(fù)系生長發(fā)育。一般可調(diào)節(jié)推遲或提早2～3d。催芽控制采取生育期短的親本不催芽、生育期長的親本催芽等措施，可以微調(diào)雙親在播始?xì)v期上存在的差異。如果恢復(fù)系、不育系抽穗揚(yáng)花完美相遇，不需要進(jìn)行花期調(diào)節(jié)，是最理想的?；謴?fù)系和不育系在育秧或直播時(shí)就可均勻混播，一方面可省工節(jié)本，另一方面可使恢復(fù)系在不育系群體中的分布更加均勻，有利于授粉提高結(jié)實(shí)率。栽培方面，接近普通水稻栽培。如果是通過育秧方式，利用機(jī)械插秧技術(shù)可降低成本；如采用直播方式，注意苗期草害的防治，勤曬田扎深根防倒伏。注意氮磷鉀肥的配合使用，不要過多施用氮肥。根據(jù)恢復(fù)系、不育系特征特性和當(dāng)?shù)厣鷳B(tài)條件，有針對性防治病蟲草害。恢復(fù)系、不育系抽穗揚(yáng)花后，分1～3次噴施“920”。每天10:00-13:00趕粉2～4次，每次趕粉能觀察到較為明顯的“粉霧”。本類型較為理想，省工節(jié)本，尤其是采用直播-自然風(fēng)力趕粉-機(jī)械混收分離模式，成本接近于普通水稻種植。

二、恢復(fù)系、不育系混插(拋)混收型

當(dāng)10天＞恢復(fù)系、不育系播差期＞3天時(shí)，必須通過錯(cuò)期播種才能達(dá)到雙親花期理想相遇，但可以混插或混拋。恢復(fù)系、不育系錯(cuò)期育秧，選擇合適的時(shí)機(jī)插秧或拋秧。人工插秧，較容易實(shí)現(xiàn)混插；機(jī)械插秧，需要對機(jī)械進(jìn)行一定的改良，使機(jī)械能栽插20～30天的秧苗。另一方面，根據(jù)需要在插秧時(shí)放置合適比例(恢復(fù)系:不育系為1:1～24)的恢復(fù)系秧苗，使其在制種群體中比例適宜、分布均勻。混插(拋)可使恢復(fù)系在不育系群體中的分布均勻，有利于授粉提高結(jié)實(shí)率。栽培方面，注意氮磷鉀肥的配合使用，不要過多施用氮肥。根據(jù)恢復(fù)系、不育系特征特性和當(dāng)?shù)厣鷳B(tài)條件，有針對性防治病蟲草害。恢復(fù)系、不育系抽穗揚(yáng)花后，分1～3次噴施“920”。每天10:00-13:00趕粉2～4次，每次趕粉能觀察到較為明顯的“粉霧”。

三、恢復(fù)系、不育系分插混收型

當(dāng)恢復(fù)系、不育系播差期＞10天時(shí)，必須通過錯(cuò)期播種、分開栽插才能達(dá)到雙親花期理想相遇?；謴?fù)系、不育系分開栽插，接近常規(guī)雜交水稻制種技術(shù)。但考慮到本技術(shù)可實(shí)現(xiàn)混收分離，恢復(fù)系可均勻分布于制種田中。如常規(guī)制種技術(shù)中，恢復(fù)系在不育系廂面的兩側(cè)；利用本發(fā)明制種，可將恢復(fù)系移栽至母本廂面中間均勻分布。栽培方面，注意氮磷鉀肥的配合使用，不要過多施用氮肥。根據(jù)恢復(fù)系、不育系特征特性和當(dāng)?shù)厣鷳B(tài)條件，有針對性防治病蟲草害?；謴?fù)系、不育系抽穗揚(yáng)花后，分1～3次噴施“920”，每天10:00-13:00趕粉2～4次，每次趕粉能觀察到較為明顯的“粉霧”。

由于本發(fā)明的恢復(fù)系種子穎殼畸形、裂穎，種子發(fā)育不良，發(fā)芽率、成苗率均不及普通種子。這一方面有利于防雜，即使有少量恢復(fù)系種子混雜在雜交種子中，發(fā)芽成苗率低；但另一方面，在制種時(shí)容易導(dǎo)致恢復(fù)系苗數(shù)不夠。因此，要盡量使用新收獲恢復(fù)系種子，同時(shí)加大用量2～3倍。為了防止?fàn)€種，播種時(shí)使用多菌靈等內(nèi)吸性殺菌劑浸種。少浸多露，直播時(shí)田間不淹水，保持透氣性良好，提高恢復(fù)系發(fā)芽率、成苗率。由于不育系的千粒重、發(fā)芽率在不同組合、不同年份間存在差異，因此，以制種田恢復(fù)系、不育系的穗數(shù)比例來研究是恰當(dāng)?shù)?。研究表明，一般混?混插/混拋的制種田穗數(shù)比例為優(yōu)良恢復(fù)系:不育系＝1:4～1:30。本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)恢復(fù)系、不育系的千粒重、發(fā)芽率及小面積試驗(yàn)結(jié)果選用最佳比例。

實(shí)施例3雜交種子的分離

待制種田不育系上所結(jié)雜交種子成熟后即可收獲。種子收獲后利用種子精選設(shè)備去除穎殼開裂、畸形的恢復(fù)系種子，如一次篩選后還有少量殘余，可通過增加分選次數(shù)提高雜交種子純度。

水稻種子精選設(shè)備主要根據(jù)其籽粒的形狀和比重的原理，分為風(fēng)篩選和比重選兩種精選設(shè)備，一般加工過程中先經(jīng)過風(fēng)篩選設(shè)備去除雜質(zhì)和空癟粒，再經(jīng)過比重選設(shè)備去除比重不一致的雜質(zhì)。風(fēng)篩選設(shè)備一般設(shè)置三層篩片，因恢復(fù)系種子穎殼開裂，籽粒發(fā)育不正常，形狀較正常種子小，所以在經(jīng)過篩片時(shí)正常種子可以在篩片上面振動(dòng)精選下來，畸形恢復(fù)系種子就被篩片漏掉，然后作為雜質(zhì)篩選出來。如果不能完全清選干凈，再經(jīng)過比重選設(shè)備。比重選設(shè)備主要根據(jù)種子的比重原理，通過振動(dòng)將比重不一致的雜質(zhì)選出。因恢復(fù)系種子穎殼開裂，籽粒發(fā)育不正常，比重明顯小于正常種子，所以再經(jīng)過比重選設(shè)備就可以完全將這部分畸形恢復(fù)系種子選出。

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進(jìn)，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。