本發(fā)明屬于飼養(yǎng)業(yè)的工藝技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及到一種酵母提取制備的豬精液稀釋液的制備方法。
背景技術(shù)：
豬精液冷凍技術(shù)雖已成功，但是程序復(fù)雜，設(shè)備昂貴、成本高，并且受胎率偏低，目前尚未廣泛推廣應(yīng)用。豬精液的常溫保存溫度為15~25℃。但是豬精子在長期的存放過程中會(huì)因?yàn)榛顒?dòng)減弱而出現(xiàn)沉淀聚集，造成精子缺氧環(huán)境，引起精子窒息死亡，近年來，懸浮劑如聚乙烯吡咯烷酮或聚乙烯醇在精液的保存中應(yīng)用較多，同時(shí)取得了相當(dāng)好的效果。
羧甲基纖維素鈉又名纖維素膠，具有獨(dú)特的懸浮、穩(wěn)定、增稠特性，且其來源豐富，價(jià)格便宜。具有是溶液形成均一、穩(wěn)定分散系的作用，根據(jù)cmc的性質(zhì)，在豬精液中加入一定量的cmc有可能減緩精子沉降的速度，延長沉?xí)r間，減少搖勻次數(shù)，提高保存質(zhì)量。
糖類在精液稀釋保存液中有多種作用。首先，糖類是精液稀釋保存液中重要的滲透壓保護(hù)劑，能夠在親水組織中替代水分子，防止精子膜結(jié)構(gòu)因滲透壓變化而造成損傷，有利于精子膜結(jié)構(gòu)的完整，從而提高精子活力；糖類可為精子補(bǔ)充能量，維持細(xì)胞基本代謝，減少精子自身能量消耗，延長精子在體外的存活時(shí)間，提高精子受精能力是采用凍精進(jìn)行人工授精，但受胎率較低，在60％左右且不穩(wěn)定，而用常規(guī)液態(tài)保存的精液進(jìn)行人工授精后效果比凍精好，且費(fèi)用低操作程序簡單，但是鮮精稀釋保存液大多數(shù)保存時(shí)間短，給生產(chǎn)帶來很多不便。目前，精液的保存方法主要是通過稀釋后置于15~25℃中進(jìn)行常溫保存，由于稀釋液提供的弱堿性環(huán)境，使得精子的運(yùn)動(dòng)能力和代謝效率受到一定的抑制，因此常溫保存只能在一定的時(shí)間范圍內(nèi)延長精子的存活時(shí)間和保持受精能力，稀釋好的精液置于22~25℃下1~2h后，平放入17℃恒溫箱內(nèi)閉光保存，保存的莖葉每隔4~8h搖動(dòng)一次，防止底層的精子被壓死。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
一種酵母提取制備的豬精液稀釋液的制備方法，
本發(fā)明的主要是通過培育酵母菌細(xì)胞，然后利用現(xiàn)代儀器對(duì)酵母細(xì)胞進(jìn)行破碎處理，釋放細(xì)胞內(nèi)容物，添加適量的其它活性成分配比而成的，具體是通過以下的方法實(shí)現(xiàn)的：
先配置濃度10~15%左右的葡萄糖水溶液500~1000ml，然后按20:1的質(zhì)量比例接種活性干酵母粉，與恒溫水浴鍋中30~35℃活化60~80min，并每隔15~25min輕輕搖晃一次，完成后將活化液按1:100~150的比例轉(zhuǎn)接到y(tǒng)pd液態(tài)培養(yǎng)基中，調(diào)整轉(zhuǎn)速200r/min，28~35℃培養(yǎng)30~40h，得到酵母擴(kuò)大培養(yǎng)液，富含豐富的酵母菌。
發(fā)明加入了一定量的絮凝劑羧甲基纖維素鈉至其濃度為15~20g/l，并調(diào)節(jié)ph為7~9的堿性環(huán)境，于恒溫水浴中保溫20min，在酸性條件下酵母細(xì)胞幾乎不發(fā)生絮凝現(xiàn)象，酵母細(xì)胞絮凝后，彼此吸附沉降有利于濃縮酵母細(xì)胞，細(xì)胞的沉降率經(jīng)檢測(cè)可達(dá)到驚人的70%以上，絮凝率則達(dá)到90%以上。而且根據(jù)背景技術(shù)所說，適量的加入羧甲基纖維素鈉可以增加溶液一定的粘稠度，可以提高稀釋液對(duì)精子的保護(hù)作用，有利于精子活率、活力的維持，同時(shí)明顯提高精子脂膜完成率和頂體完整率，原理是粘稠的稀釋液可以降低精子的運(yùn)動(dòng)能力，減少不必要的能量消耗。這里cmc的濃度至關(guān)重要，一定要滿足精子的需求，達(dá)到最好稀釋液保護(hù)精子的濃度，而酵母沉降的只是次要的，只要適當(dāng)起到沉降的效果即可，畢竟最終稀釋液是要用于豬精稀釋液的配置。
沉降過后去除酵母培養(yǎng)液上層1/3以上的清液，將下層增稠的沉降液進(jìn)行細(xì)胞的破碎及細(xì)胞活性成分的萃取，將剩余培養(yǎng)液置于微波功率為600~800w的電磁作用環(huán)境下2~5min，微波是通過波場(chǎng)中介質(zhì)的擺動(dòng)摩擦作用產(chǎn)生能量，具有很好的選擇性、瞬時(shí)性和高效性，細(xì)胞內(nèi)不同位置的物質(zhì)，對(duì)于微波的吸收能力存在差異，從而導(dǎo)致為波場(chǎng)中的細(xì)胞局部受熱，細(xì)胞在一定的強(qiáng)度下出現(xiàn)缺口而破碎，起到充分裂解酵母細(xì)胞的功能。
微波不僅可以快速使酵母細(xì)胞裂解，同時(shí)微波局部加熱的方式還可以迅速的是酵母細(xì)胞中的海藻糖酶失活，導(dǎo)致海藻糖酶并不會(huì)酶解海藻糖，同時(shí)此加入一定量事先配置的乙醇，調(diào)制溶液的乙醇濃度為5~10%，乙醇對(duì)有機(jī)物具有溶解性，提高細(xì)胞內(nèi)容物的溶出速率，畢竟最后需要對(duì)剩余的殘?jiān)M(jìn)行過濾，殘?jiān)焕谪i精子的活動(dòng)，尤其是頂體的完整性，乙醇的加入也可以提高海藻糖的產(chǎn)率，其它溶出的物質(zhì)還包括：蛋白質(zhì)、低分子肽、氨基酸、核酸降解物、微量元素和b族維生素等各種活性成分，只要適量的控制濃度，基本模擬了酵母細(xì)胞的內(nèi)環(huán)境，屬于天然的細(xì)胞存活內(nèi)環(huán)境，特別適于精子的存活。
通過減壓蒸餾回收乙醇并濃縮酵母提取液，真空度0.08mpa的條件下，升溫至60~70℃沸騰回流回收乙醇并濃縮提取液至60~80%，采用抽濾純化提取液。
由于精子的運(yùn)動(dòng)需要耗能，而酵母裂解液中糖類及其它必要物質(zhì)含量不足，需要添加一些輔料10~16%，其它的輔料包括葡萄糖30~55%、edta5~15%、檸檬酸檸檬酸三鈉5~10%、氯化鉀15~25、碳酸氫鈉3~6%、tris-半管氨酸14~17%。
本發(fā)明的有益效果：采用酵母細(xì)胞培養(yǎng)液的精華提取液，適量配比添加成分用于豬精液的稀釋液，對(duì)于豬精子的保存起到非常好的效果，成本低，延長豬精液的保存期50%以上，同時(shí)可以利用啤酒釀酒酵母來制備，更加節(jié)省成本，同時(shí)保護(hù)環(huán)境。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1：
（1）先配置濃度10%左右的葡萄糖水溶液1000ml，然后按20:1的質(zhì)量比例接種活性干酵母粉，與恒溫水浴鍋中32℃活化60min，并每隔20min輕輕搖晃一次，完成后將活化液按1:120的比例轉(zhuǎn)接到y(tǒng)pd液態(tài)培養(yǎng)基中，調(diào)整轉(zhuǎn)速200r/min，30℃培養(yǎng)38h，得到酵母擴(kuò)大培養(yǎng)液，富含豐富的酵母菌。
（2）加入了一定量的絮凝劑羧甲基纖維素鈉至其濃度為15g/l，并調(diào)節(jié)ph為8的堿性環(huán)境，于恒溫水浴中保溫20min，沉降過后去除酵母培養(yǎng)液上層1/3以上的清液。
（3）將下層增稠的沉降液進(jìn)行細(xì)胞的破碎及細(xì)胞活性成分的萃取，將剩余培養(yǎng)液置于微波功率為650w的電磁作用環(huán)境下3min，同時(shí)此加入一定量事先配置的乙醇，調(diào)制溶液的乙醇濃度為8%。
（4）通過減壓蒸餾回收乙醇并濃縮酵母提取液，真空度0.08mpa的條件下，升溫至60℃沸騰回流回收乙醇，采用抽濾純化提取液。
（5）加入提取液10%的輔料，包括葡萄糖40%、edta10%、檸檬酸檸檬酸三鈉10%、氯化鉀20%、碳酸氫鈉5%、tris-半管氨酸15%。