本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地說，涉及一種抗寒及瘦肉型轉(zhuǎn)基因豬及其制備方法。

背景技術(shù)：

在豬的現(xiàn)代育種工作中，減少脂肪過度沉積，增加瘦肉率，提高飼料轉(zhuǎn)化效率是育種工作者一直致力解決的問題。在我國也有較多的脂肪型地方品種，如廣西陸川豬，太湖豬等，均需要改良以提高瘦肉率及飼料轉(zhuǎn)化率。

目前豬的重要經(jīng)濟性狀的改良主要依賴遺傳育種的方法。育種工作已經(jīng)經(jīng)歷了依賴數(shù)量遺傳學(xué)的常規(guī)選育到依賴基因組學(xué)和分子生物學(xué)的分子標(biāo)記輔助選擇(mas)和基因型或數(shù)量性狀位點(qtl)直接選擇。雖然常規(guī)的選育方法已經(jīng)在豬生產(chǎn)性狀改良上取得了很大的進(jìn)展，但這一過程需要測定技術(shù)和育種方法具有相當(dāng)?shù)目茖W(xué)性和準(zhǔn)確性及可行性，并需要大量人力物力的投入，而且育種周期長。分子育種也面臨很大的難題，尤其是面對那些低遺傳力的數(shù)量性狀，鑒定性狀相關(guān)基因往往要很長時間，花費較高成本，而且許多研究最終都只停留在目標(biāo)基因的定位上，未進(jìn)一步走向育種應(yīng)用。

我國多數(shù)瘦肉型商品豬生產(chǎn)的主要途徑，大多采用引入外來優(yōu)良豬種與本地豬種進(jìn)行雜交獲得二元雜種的方法，如直接從國外原產(chǎn)地引進(jìn)的丹麥長白、英國大約克、美國杜洛克和漢普夏等世界著名瘦肉型豬種，雖然培育出了一批瘦肉型豬新品種(系)，然而，世界一流的品種和育種技術(shù)是買不到的，“拿來主義”只能導(dǎo)致我們陷入“引種→退化→再引種→再退化”的被動局面，更不可能使我國畜牧業(yè)生產(chǎn)水平與世界發(fā)達(dá)國家展開真正的競爭。

不僅如此，新出生仔豬的顫抖性產(chǎn)熱能力仍不健全，會因較差的產(chǎn)熱能力而降低存活率，現(xiàn)代養(yǎng)殖場中，都采用保溫?zé)魧ψ胸i進(jìn)行保暖以提高存活率。然而，保溫?zé)舻氖褂脽o疑增加了生產(chǎn)成本，而對一些寒冷地區(qū)卻沒有配備保溫?zé)舻酿B(yǎng)殖戶來說，仔豬存活率勢必要受到天氣寒冷的影響。

因此，亟需提供一種方法能夠既提高豬的瘦肉率及飼料轉(zhuǎn)化率，又能提高豬的抗寒能力。

有研究發(fā)現(xiàn)，解偶聯(lián)蛋白1(ucp1)是一種在棕色脂肪里特異表達(dá)，存在于線粒體內(nèi)膜上的一種蛋白，它能消除線粒體內(nèi)膜兩側(cè)因呼吸鏈的電子傳遞而建立的質(zhì)子濃度差，使這種電化學(xué)濃度勢能以熱量的形式散發(fā)，這種產(chǎn)熱也被稱為非顫抖性產(chǎn)熱。然而，豬并不含有棕色脂肪(jastroch,m.,&andersson,l.whenpigsfly,ucp1makesheat.molecularmetabolism,4(5),359-362.doi:10.1016/j.molmet.2015.02.005)。因此，尚未見到將該基因應(yīng)用在豬的改良方面的任何報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明的目的是提供一種抗寒及瘦肉型轉(zhuǎn)基因豬及其制備方法。

為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

第一方面，本發(fā)明提供了一種抗寒及瘦肉型轉(zhuǎn)基因豬，其為在脂肪組織中過表達(dá)ucp1基因的轉(zhuǎn)基因豬。

所述ucp1基因可選自任意物種有功能的ucp1基因，如人、牛、羊、小鼠等動物。

進(jìn)一步地，所述ucp1基因為來自鼠的解偶聯(lián)蛋白1基因，由脂聯(lián)素啟動子特異性啟動過表達(dá)。

作為優(yōu)選，所述脂聯(lián)素啟動子為鼠源的脂聯(lián)素啟動子。

本發(fā)明供體質(zhì)粒中的ucp1基因和啟動子，由表達(dá)載體pcdna3.1酶切得到，其核苷酸序列分別如seqidno.2和seqidno.3所示。

第二方面，本發(fā)明還提供了前述轉(zhuǎn)基因豬的制備方法，包括如下步驟：

s1、構(gòu)建含有靶標(biāo)序列、脂聯(lián)素啟動子和ucp1基因的供體質(zhì)粒；

s2、構(gòu)建針對靶標(biāo)序列的cas9/grna載體；

s3、將構(gòu)建好的供體質(zhì)粒和cas9/grna載體對豬胎兒成纖維細(xì)胞進(jìn)行共轉(zhuǎn)染，通過有限稀釋法獲得單克隆細(xì)胞，進(jìn)一步通過pcr鑒定獲得打靶成功的陽性細(xì)胞；

s4、將篩選得到的陽性克隆細(xì)胞作為核移植供體細(xì)胞，離體的卵母細(xì)胞為核移植受體細(xì)胞，通過核移植技術(shù)進(jìn)行體細(xì)胞克隆，獲得轉(zhuǎn)基因豬。

所述供體質(zhì)粒的出發(fā)載體可為本領(lǐng)域常規(guī)使用的載體，在本發(fā)明的一個具體實施方式中，選擇plb載體作為出發(fā)載體。

所述供體質(zhì)粒中的靶標(biāo)序列位于啟動子序列前，ucp1基因位于啟動子序列后。所述靶標(biāo)序列采用麻省理工學(xué)院的zhangfeng教授開發(fā)的在線工具crisprdesigntool(http://crispr.mit.edu/)來設(shè)計并交由thermofisher公司合成，其核苷酸序列如seqidno.1所示，在豬基因組中位于豬解偶聯(lián)蛋白1假基因的2號外顯子。

所述cas9/grna載體按照本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)手段制備。包含cas9的px330質(zhì)粒購買自addgene。首先用bbsⅰ內(nèi)切酶切割px330質(zhì)粒，純化回收線性化的質(zhì)粒。接著將grna識別序列(即前述的靶標(biāo)序列)進(jìn)行變性復(fù)性處理，使其由單鏈核苷酸變成雙鏈寡核苷酸，再用t4dna連接酶將雙鏈dna與線性化的px330質(zhì)粒進(jìn)行連接。轉(zhuǎn)化，涂板，搖菌，進(jìn)一步測序鑒定陽性菌液，大提質(zhì)粒備用。

第三方面，本發(fā)明提供了前述方法在提高轉(zhuǎn)基因豬抗寒能力、和/或提高轉(zhuǎn)基因豬瘦肉率，和/或提高轉(zhuǎn)基因豬飼料轉(zhuǎn)化率方面的應(yīng)用。

本發(fā)明涉及到的原料或試劑均為普通市售產(chǎn)品，涉及到的操作如無特殊說明均為本領(lǐng)域常規(guī)操作。

在符合本領(lǐng)域常識的基礎(chǔ)上，上述各優(yōu)選條件，可以相互組合，得到具體實施方式。

本發(fā)明的有益效果在于：

本發(fā)明通過將鼠的解偶聯(lián)蛋白1基因轉(zhuǎn)到豬的基因組中獲得抵抗寒冷刺激和脂肪沉積減少瘦肉率增加的轉(zhuǎn)基因豬。

本發(fā)明提供了一種既能抵抗寒冷又能通過脂肪沉積減少來提高瘦肉率的轉(zhuǎn)基因豬。本發(fā)明通過定點單基因的操縱，同時改善豬兩個重要生產(chǎn)性狀，不僅為大動物基因編輯的應(yīng)用及其基礎(chǔ)研究打下基礎(chǔ)，也為育種工作者對家畜進(jìn)行性狀改良帶來新的思路。

附圖說明

圖1為本發(fā)明打靶載體構(gòu)建及基因敲入鑒定策略。

圖2為本發(fā)明陽性打靶細(xì)胞鑒定。

圖3為本發(fā)明轉(zhuǎn)基因豬基因型鑒定。

圖4為本發(fā)明冷凍條件下豬只肛溫變化。

圖5為本發(fā)明冷凍條件下豬只紅外照片及體表溫度顯示。

圖6為本發(fā)明野生型和轉(zhuǎn)基因豬的屠宰指標(biāo)檢測。

具體實施方式

下面將結(jié)合實施例對本發(fā)明的優(yōu)選實施方式進(jìn)行詳細(xì)說明。需要理解的是以下實施例的給出僅是為了起到說明的目的，并不是用于對本發(fā)明的范圍進(jìn)行限制。本領(lǐng)域的技術(shù)人員在不背離本發(fā)明的宗旨和精神的情況下，可以對本發(fā)明進(jìn)行各種修改和替換。

鼠脂聯(lián)素啟動子啟動的解偶聯(lián)蛋白1表達(dá)載體pcdna3.1由中國科學(xué)院動物研究所金萬洙饋贈。序列測定和引物合成由thermofisher公司完成。taq酶、t4dna連接酶、內(nèi)切酶均購自北京neb公司，體細(xì)胞核移植所用試劑均購自sigma公司。酶切、連接、回收、轉(zhuǎn)化、pcr擴增等常規(guī)實驗操作步驟參照《分子克隆(第三版)》。

下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

實施例1轉(zhuǎn)基因豬的制備

按照圖1所述的策略進(jìn)行打靶載體的構(gòu)建及外源基因的敲入。

1、cas9/grna打靶載體的構(gòu)建

grna的識別序列采用麻省理工學(xué)院的zhangfeng教授開發(fā)的在線工具crisprdesigntool(http://crispr.mit.edu/)來設(shè)計并交由thermofisher公司合成，該序列位于豬解偶聯(lián)蛋白1假基因的2號外顯子。包含cas9的px330質(zhì)粒購買自addgene。首先用bbsⅰ內(nèi)切酶切割px330質(zhì)粒，純化回收線性化的質(zhì)粒。接著將grna識別序列進(jìn)行變性復(fù)性處理，使其由單鏈核苷酸變成雙鏈寡核苷酸，再用t4dna連接酶將雙鏈dna與線性化的px330質(zhì)粒進(jìn)行連接。轉(zhuǎn)化，涂板，搖菌，進(jìn)一步測序鑒定陽性菌液，大提質(zhì)粒備用。

2、解偶聯(lián)蛋白1供體質(zhì)粒的構(gòu)建

首先，用kpnⅰ和xhoⅰ內(nèi)切酶對pcdna3.1質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，跑膠回收脂聯(lián)素啟動子-解偶聯(lián)蛋白1元件。將脂聯(lián)素啟動子-解偶聯(lián)蛋白1片段利用plb零背景快速克隆試劑盒(天根生化科技有限公司)連接到plb載體上，鑒定陽性質(zhì)粒，大提備用。最后，用bspeⅰ酶對得到的新質(zhì)粒進(jìn)行單酶切，純化回收，再將帶有bspeⅰ酶切位點的grna識別序列即靶標(biāo)序列(baitsequence)用t4dna連接酶連到線性化的質(zhì)粒上，得到供體質(zhì)粒。

3、ucp1轉(zhuǎn)基因成纖維細(xì)胞的獲得

3.1豬胎兒成纖維細(xì)胞的建立

1)取妊娠35天的巴馬母豬，處死后取子宮，1h內(nèi)運回實驗室，從子宮內(nèi)取出胎兒，用含抗生素的dpbs清洗，轉(zhuǎn)移到超凈臺內(nèi)，用眼科剪去掉頭、四肢和內(nèi)臟。將剩余部分用dpbs反復(fù)沖洗，直至干凈。在100mm培養(yǎng)皿中用眼科剪將剩余部分盡量剪碎。

2)將剪碎的組織轉(zhuǎn)移到新的100mm培養(yǎng)皿中，加10ml消化液在37℃，5％co2培養(yǎng)箱中消化4-6h。消化液的成分：dmem高糖培養(yǎng)基(gibco)添加15％胎牛血清(hyclone)，0.032％膠原酶ⅳ(sigma)，25kunitzunits/mldnaseⅰ(sigma)和40μg/ml慶大霉素(sigma)。消化完畢后，收集消化產(chǎn)物，置于離心管中3000rpm離心10min，棄上清，用培養(yǎng)基重懸后再離心。最后將重懸后的組織鋪在25cm²的培養(yǎng)皿中。培養(yǎng)基成分：dmem高糖培養(yǎng)基(gibco)添加15％胎牛血清(hyclone)和40μg/ml慶大霉素(sigma)。

3)待細(xì)胞生長至80％匯合度時，進(jìn)行傳代培養(yǎng)或冷凍保存。

3.2打靶載體轉(zhuǎn)染胎兒成纖維細(xì)胞

轉(zhuǎn)染前兩天復(fù)蘇胎兒成纖維細(xì)胞至25cm2培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞長至70％左右時即可進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染前4h更換培養(yǎng)基。用0.25％的胰蛋白酶(invitrogen)消化細(xì)胞，用電轉(zhuǎn)液重懸，向重懸細(xì)胞中加入cas9/grna質(zhì)粒和供體質(zhì)粒。用核電轉(zhuǎn)儀(nucleofector2bdevice，lonza)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，采用u-023程序。轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入60mm培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)48h。

3.3細(xì)胞篩選及鑒定

用0.25％的胰蛋白酶(invitrogen)消化細(xì)胞，終止消化反應(yīng)后用手持式自動細(xì)胞計數(shù)儀(millpore)進(jìn)行細(xì)胞密度檢測，根據(jù)細(xì)胞密度使用有限稀釋法，將細(xì)胞接種到96孔板中，每個孔添加100ul培養(yǎng)基，并使每100ul培養(yǎng)基中僅含一個細(xì)胞。3-4天后換液，待細(xì)胞在96孔板中長滿時傳至24孔板中，24孔板中長滿的細(xì)胞一部分傳至6孔板，另一小部分在24孔板中繼續(xù)培養(yǎng)，用于基因型鑒定。最后共獲得26個細(xì)胞克隆，進(jìn)行pcr鑒定，發(fā)現(xiàn)同時在5’連接端和3’連接端擴出條帶的為轉(zhuǎn)基因陽性克隆，其中8、14、17號為陽性克隆(圖2)，用于后續(xù)實驗。

4、核移植胚胎及克隆豬的制備

4.1豬卵母細(xì)胞的成熟培養(yǎng)：

從屠宰場收集豬的卵巢放于37℃含有青霉素和鏈霉素的生理鹽水的保溫瓶中，1小時內(nèi)運送回實驗室。用生理鹽水洗卵巢3-5遍后，抽取卵巢表面直徑為3～8mm的卵泡，將含有卵母細(xì)胞的卵泡液收集在50ml離心管中，用tl-hepes洗卵液洗滌3遍，在體視顯微鏡下挑取含有三層以上卵丘細(xì)胞、致密且胞質(zhì)均勻的卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合物(cocs)，移入體外成熟培養(yǎng)液中，在39.0℃，5％co2條件下培養(yǎng)42～44h。

4.2重構(gòu)胚胎的獲得：

將體外成熟培養(yǎng)42～44h的卵母細(xì)胞用0.1％透明質(zhì)酸酶(購自sigma公司)消化，去除卵母細(xì)胞周圍的卵丘細(xì)胞，在體視顯微鏡下挑取胞質(zhì)均勻，卵周隙明顯并已排出第一極體的卵母細(xì)胞，即mii期卵母細(xì)胞，置于顯微操作滴中，用固定管固定成熟卵母細(xì)胞，使極體位于3點鐘方向，用外徑20μm的去核針將第一極體和周圍約1/8的細(xì)胞質(zhì)(包含細(xì)胞核)吸除出去；將ucp1轉(zhuǎn)基因的成纖維細(xì)胞注入去核的卵母細(xì)胞卵周隙中，使供體細(xì)胞與卵母細(xì)胞膜接觸；然后利用電激活方法(btxelectro-cellmanipulator200)使卵母細(xì)胞與供體細(xì)胞融合，獲得重構(gòu)胚胎。將重構(gòu)胚胎置于pzm3液中，在39.0℃，5％co2條件下培養(yǎng)14～16小時，然后進(jìn)行胚胎移植。

4.3胚胎移植：

將體外培養(yǎng)14-16小時的重構(gòu)胚胎移入同期發(fā)情的假孕母豬輸卵管中，平均每頭母豬移植約180枚胚胎。28天后通過超聲波檢測母豬是否懷孕。如果懷孕，則每兩周超聲波監(jiān)測一次懷孕情況。本發(fā)明得到3頭受孕母豬，順利產(chǎn)下12頭小豬。

5、ucp1基因敲入豬的鑒定

豬出生后，取耳朵組織，用基因組dna提取試劑盒(天根生化科技有限公司)提取dna，進(jìn)行pcr鑒定(圖3)。

實施例2仔豬抗寒能力的檢測

將1月齡轉(zhuǎn)基因豬和野生型豬放在4°冰箱中，冷凍4h。從0h開始，每隔1h用電子溫度計(天津今明儀器公司)測量豬肛溫(圖4)，由圖4可知，冷刺激1h-4h之間，轉(zhuǎn)基因豬的肛溫顯著高于野生型豬。同時用紅外相機(flir)對豬照相，記錄豬體表溫度變化(圖5)。由圖5可知，冷刺激后，轉(zhuǎn)基因豬體表紅外顯示顏色要明顯強于野生型，即白色線標(biāo)記區(qū)域內(nèi)的溫度轉(zhuǎn)基因豬高于野生型的。

實施例3屠宰指標(biāo)檢測

待豬到6月齡時進(jìn)行屠宰實驗。屠宰前24h禁食。宰前稱重，麻醉放血處死。去頭，蹄，尾和內(nèi)臟(保留腎臟和板油)，稱重，記為胴體重。胴體重占宰前重的比例即為屠宰率。將豬胴體從中間分開，針對左側(cè)胴體，分離瘦肉，脂肪，皮和骨，分別稱重，計算各個部分占總和的比例(見圖6)。由圖6可知，野生型和轉(zhuǎn)基因豬的屠宰率無差異，轉(zhuǎn)基因豬的瘦肉率顯著高于，脂肪率顯著低于野生型。

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進(jìn)，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。

序列表

<110>中國科學(xué)院動物研究所

<120>一種抗寒及瘦肉型轉(zhuǎn)基因豬及其制備方法

<130>khp171112007.0

<160>3

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>23

<212>dna

<213>靶標(biāo)序列

<400>1

cctccggtaccattcggtacaaa23

<210>2

<211>924

<212>dna

<213>ucp1

<400>2

atggtgaacccgacaacttccgaagtgcaacccaccatgggggtcaagatcttctcagcc60

ggagtttcagcttgcctggcagatatcatcaccttcccgctggacactgccaaagtccgc120

cttcagatccaaggtgaaggccaggcttccagtaccattaggtataaaggtgtcctaggg180

accatcaccaccctggcaaaaacagaaggattgccgaaactgtacagcggtctgcctgcg240

ggcattcagaggcaaatcagctttgcctcactcaggattggcctctacgactcagtccaa300

gagtacttctcttcagggagagaaacacctgcctctctcggaaacaagatctcagccggc360

ttaatgactggaggtgtggcagtgttcattgggcagcctacagaggtcgtgaaggtcaga420

atgcaagcccagagccatctgcatgggatcaaaccccgctacacggggacctacaatgct480

tacagagttatagccaccacagaaagcttgtcaacactttggaaagggacgacccctaat540

ctaatgagaaatgtcatcatcaattgtacagagctggtaacatatgacctcatgaagggg600

gcccttgtaaacaacaaaatactggcagatgacgtcccctgccatttactgtcagctctt660

gttgccgggttttgcaccacactcctggcctctccagtggatgtggtaaaaacaagattc720

atcaactctctgccaggacagtacccaagcgtaccaagctgtgcgatgtccatgtacacc780

aaggaaggaccgacggcctttttcaaagggtttgtggcttcttttctgcgactcgggtcc840

tggaacgtcatcatgtttgtgtgctttgaacagctgaaaaaagagctgatgaagtccaga900

cagacagtggattgtaccacataa924

<210>3

<211>6716

<212>dna

<213>promoter

<400>3

cgctagtgtatgcaatggtgtcagcgtttggaagctgattatgggatggatccctggata60

tggcaatcactagatggtctatccttttgtcacagctccaaattttgtctctgtaactcc120

ttccatgggtgttttgttcccatttctaagaaggggcaaagtgtccacactttggtcttt180

gttcttcttgagtttcatgcgtttagcaaattgtatcttatatcttgggtattctaaatg240

tctgggctaatatccacttatcagtgagtacatattgtgtgagttcctttgtgattgggt300

tacctcactcaggatgatgccctccaggtctatccatttgcctaggaatttcataaattc360

attctttttaatagctgagtagtactccattgtgtaaatgtaccacatttctgtatccat420

tcctctgttgaggggcatctgggttctttccagcttctggctattataaataaggctgct480

atgaacatagtggagcatgtgtccttcttactggttgggacatcttctggatatatgccc540

aggagaggtattgtgggatcctccggtagtactatgtccaattttctgaggaaccgccag600

actgatttccagagtggttgtacaagcttgcaatcccaccaacaatggaggagtattcct660

ctttctccacatcctcgccagcatctgctgtcacctgaatttttgatcttagccattctg720

actggtgtgaggtggaatctcagggttgttttgatttgcatttccctgaaggtccctact780

atttatctaacattttgaatgcaacattctttcctttgtacatagtcatatgccatgtgc840

attagtaatctgctataatacagacccaacgatgagacgactcagacaaaagagtgtatt900

tgtatctcttgtgacatctaggatataggggaagaaacactccacacagttatgcagggc960

tctctgttttgttttgtttttaaagatttattttatttcatttattttatgtatataaaa1020

tacatgaaatgagtacactgtagctatactgatggttgtgagccatcatgtggtttctgg1080

gaattagaattcagggcctctgcttgctctagttggctccagttgctccagtctaaagat1140

ttatttattattagatctaagtacattgtagctgtcttcaaacacaccagaagagggcat1200

aggatcccattacagatggttgtgagccaccatgtggttgctgggatttgaactcaggac1260

ctctggaagagcagtcagtgctcttaactgctgagccatctctccagcccttagcctgct1320

ctcttatatcatctatgagcacctgtctatggtaacagcaccacaatgggctggacctta1380

cctcctcaatcatcaagcaagaaaacgtcccataggcttgcccacagggcagtctggtgg1440

gagcatttccccaactgatgttctctccccaaatgacttatctgatacactggccttcgg1500

agaaaagcaagtcaacacctcattgtgatcccattttacccagtcagaatgtcataagaa1560

aacaaataacattttcataagaaaataaacaacaatacattctgtcaaggatgtagacag1620

atgggatgcacttgattcactgctggtgggaatgataactagtccaatctcagtggaagt1680

cagtctggagtgttctcagaaaatgaaaaaatagctgggcagtggtggcagatgccttta1740

atcccagcacttgggaggcagaggcaggtggatttctgagtttgaggccagccttgtcta1800

cagagtgagttccaggacagccaaggctacacagagaaaccctgtctcaaaaaaccaaaa1860

aaaagccggacgtggtggcgcacgcctttaatcccagcactcgggaggcagaggcaggcg1920

gatttctgagttcgaggccagcctggtctacagagtgagtttcaggacagccagggctac1980

acagagaaaccctgtctcgaaaaaccaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaggaagtgaa2040

gaatagctgtggataacacagcttttcttttctttatatttcaggcatcagggatagagg2100

tcaggtgtcaatgtaaatcactctaccactgagttacacttctaaattaaagacattttt2160

cctttcttgaatgcccaaaaatttggagtactgcaggacaggctcactcttctgcagtta2220

gtgttatgtctcaaaatttgatttgaggtttagttgtttcagtaaattgtctttttaaag2280

tcatgactaaacaataatatacagtgaaatttaaccacattcaggaaacactgaggaaac2340

tcaggcctgtggggaaatctggccttttgtttaagtatctcacttcgcatgtaggcgaga2400

attgagatgtgaacatgagctcctgaaggaaaggaccacgtttctgtggctgcttcactc2460

tgggcagtaacacatctgtccaggtaaacccagccttgctgaacgtcaatctcagcactt2520

gggaggcagaggtgagagtttgaggccagtctgatctatagagcaagttccaggatagct2580

tgggctacactgaaaaaacactgtcttgaaaaacaaaacaaaacaaaacaaaacaaaaca2640

aaacaaaacaaaacaccaaaaaccaaaaaagaaaaaaaaaaacaggaaaagaaaagaaaa2700

aaatcaaaataaaacaaagccaaaaacaaagcaaaaaaaaaaaccacccagcaaaaaacc2760

aaaccgcctagcctcaagacatgtgtggttgaatgtttttcacttctagtcgctaagcaa2820

gtgtgtgtttttacacaatgccctctgtggtgagtggcggattcccctgagagttcacca2880

aatgataggctttcacaatgctcccgggtgtctaccagacccagcaaagtattgatgtgg2940

ttttggggtgaaagtcactctgtcttgtgcaatagttagaatctgctgaaaccagcagtg3000

ttcctatatgggacaggggtccagagctaacccggaggctataactgagcagaggtgaag3060

accacgaggcattggggagcgtatgccctttgtggtcagagagatctagcttcgtgcctt3120

gggtctgtgtctctccctcttactggcttctggcttcttcattaagtgggagacaaccac3180

aggtatctgtatgggaagactcgactaccccttgactcaacattgcttgttacttacttt3240

gtacaagatactacttagtctaggggttatggagcataacctcaagtaggtaaagcccct3300

gctccagcgtgtttgcattccagtaagaagcgaaagacagtaacacacatacaaaataag3360

taagaaaatgcaacaacagcaacaacaacaacacacacacacaaagtaagcaaaacgcta3420

agggaaagatagagagtgatacagctttgagttgctgtagttcttctctctcctttgctt3480

catacagtttgcttgggaagtgtccagggccatggggtcacaactaacagcccttggaaa3540

tgagcttgtgtccttaatcttcatgacctaacgtgatttctctagaaacatcagtgcatt3600

aacaggaagacaagatggaagatcatattttggctctccttccttggtgggttgacactg3660

ctggtcctatccactagtaaaagcatgactcttaggctctgtgtggccagtggaaggtgg3720

cagttggaggaagcagatgcttggccagcctttgcctgggagcagtctagctctgagtgt3780

cttattggagcagctgctggcatccagagttctttttggattcacgatttaattcaaaag3840

ctttgtgctcccgagaatcagctctggtctttcaaaaataagatgtgagtccgccgagag3900

gctcccaaggtattgccttgccaactgcaagccttttaggagcagtttagtgagtggtga3960

ctgctagttgcagttggctgttagcccagagctaataatagatagaaaaggtatatactt4020

aaggagtctggaaactgaggtttatctactcacagaaaatgagtttctaaaaaactagct4080

tgaaacttacccagaaaaatcttagaacatggttctccaatgtcaaggtaagtgttctgt4140

gacactgggcttgaattatgtagggaccacagattttagaatttggacccctgaacttgc4200

ttcacaccccaccaggaaccttcctgtacaacagccctcagaattcatctacatggtctt4260

ttctcagtatgggatccggtctagcaagtggagcacaccttctattgcttaaagatttgt4320

ttatgtatatgggtattttggctgcatgcatatttgcacaccaaaagaaggcagcggatc4380

ccatggaattactgtgggtgctgggaattgaactcaggacctctggaagaatagccagtg4440

ctcttaaccactgagccatgcctgcagtccatctattttttattctagtacagcccctct4500

tcattcttactgaaatagtaatgcctgaaccacacagcttcacatttagttacaaagaaa4560

gagtgggagtatcatgtgacaattagtgttgttgactctccaggacaaacttatgggaaa4620

gggaggtctcctgacccctgaacaatcattttacttgaggataattttcattgcactcag4680

aaacatgctgaattattgtccttacccttgccccatctcttgctctggtagagaatggcc4740

aaagcctggaaacaggatggcttgacagaagctctacttggcttcccagacccaagctgg4800

attaaaccaggttccctaaggagtcttaaggcagctgccaggagcaaggggcccactcat4860

tggctattggccttgactgggttggccaatggtaagctggggtctgcctgtccccatgag4920

taccagactaatgagacctggccactttctcctcatttctgtctgtacgattgtcagtgg4980

atctgacgacaccaaaaggtaagaacaattctatattctcggctggctgggtatgaatgc5040

agaatcccacttgggctgtgttcagattttgctctctgcagcagtgtgaaggtagatgtt5100

gagaaaactcaggccttggaaacatggttggggcagataagctttggggcttttctttaa5160

ctcttcaaagctctaagaaagaaacaataacctttcggtccacaagcttgagcctaacgg5220

tgtctgttcacagcagtaaaaccccaactaagacactgatgaagacctcctgggagagtg5280

agggctgggtagccactgaaggctctctgggagaggcgagtatgtagatgcagatctttg5340

gagtggattccacttagctatataggacatgatgcaggtcctgattggatgtgccatgtg5400

agtctgcctttcccatgactattcacctgtcaatttcagggctcaggatactactgttgc5460

aagctctcctgttcctcttaactcgacggtatcgataccaccccatcgataagcttgata5520

tcgaattcctgcagcccgggggatcctgagaacttcagggtgagtttggggacccttgat5580

tgttctttctttttcgctattgtaaaattcatgttatatggagggggcaaagttttcagg5640

gtgttgtttagaatgggaagatgtcccttgtatcaccatggaccctcatgataattttgt5700

ttctttcactttctactctgttgacaaccattgtctcctcttattttcttttcattttct5760

gtaactttttcgttaaactttagcttgcatttgtaacgaatttttaaattcacttttgtt5820

tatttgtcagattgtaagtactttctctaatcacttttttttcaaggcaatcagggtata5880

ttatattgtacttcagcacagttttagagaacaattgttataattaaatgataaggtaga5940

atatttctgcatataaattctggctggcgtggaaatattcttattggtagaaacaactac6000

accctggtcatcatcctgcctttctctttatggttacaatgatatacactgtttgagatg6060

aggataaaatactctgagtccaaaccgggcccctctgctaaccatgttcatgccttcttc6120

tctttcctacagctcctgggcaacgtgctggttgttgtgctgtctcatcattttggcaaa6180

ggattcactcctcaggtgcaggctgcctatcagaaggtggtggctggtgtggccaatgcc6240

ctggctcacaaataccactgagatctttttccctctgccaaaaattatggggacatcatg6300

aagccccttgagcatctgacttctggctaataaaggaaatttattttcattgcaatagtg6360

tgttggaattttttgtgtctctcactcggaaggacatatgggagggcaaatcatttaaaa6420

catcagaatgagtatttggtttagagtttggcaacatatgcccatatgctggctgccatg6480

aacaaaggttggctataaagaggtcatcagtatatgaaacagccccctgctgtccattcc6540

ttattccatagaaaagccttgacttgaggttagattttttttatattttgttttgtgtta6600

tttttttctttaacatccctaaaattttccttacatgttttactagccagatttttcctc6660

ctctcctgactactcccagtcatagctgtccctcttctcttatggagatccctcga6716