本發(fā)明屬于組織培養(yǎng)領(lǐng)域，具體為一種三葉青快繁技術(shù)及用于三葉青組織培養(yǎng)的光觸媒誘導(dǎo)培養(yǎng)基。
背景技術(shù)：
三葉青是葡萄科多年生蔓生藤本植物，整株均可入藥，地下塊根藥效更加。三葉青塊根粗壯，一般常見(jiàn)有紡錘形、橢圓形或卵圓形。葉互生，葉柄2-4cm，掌狀復(fù)葉。小葉片呈狹橢圓形至狹卵狀橢圓形，長(zhǎng)約3-7cm，寬約1.5-3cm。中央小葉較兩側(cè)者略大，葉緣具刺狀疏齒，葉子兩面都無(wú)毛，或僅在下面中脈上被毛。由于傳統(tǒng)三葉青繁殖方式周期長(zhǎng)、收益低，因此尋找一種快速繁殖三葉青的方法是亟待解決的問(wèn)題。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明提供了一種三葉青快繁技術(shù)及用于三葉青組織培養(yǎng)的光觸媒誘導(dǎo)培養(yǎng)基，該光觸媒誘導(dǎo)培養(yǎng)基可明顯提高三葉青塊根組織的成活率。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案:
一種三葉青快繁技術(shù)，包括如下步驟：
(1)取三葉青外植體，將其用流水沖洗2～3小時(shí)；
(2)將沖洗后的三葉青外植體用體積分?jǐn)?shù)為60～70％的乙醇溶液浸泡1～3分鐘；
(3)將經(jīng)酒精溶液浸泡的三葉青外植體使用0.1％氯化汞溶液沖洗1～2分鐘；
(4)將經(jīng)氯化汞溶液消毒的三葉青外植體使用蒸餾水沖洗3～5次，并使用濾紙吸干其表面的水分；
(5)將經(jīng)上述消毒處理的三葉青外植體斜插入誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
更加具體的，步驟(1)中沖洗時(shí)間為2小時(shí)。
作為優(yōu)選，步驟(2)中乙醇溶液的體積分?jǐn)?shù)為65％。
本發(fā)明還提供了一種用于三葉青組織培養(yǎng)的誘導(dǎo)培養(yǎng)基，按重量計(jì)，該誘導(dǎo)培養(yǎng)基包括如下組分：硝酸銨0.8-1.2g、磷酸二氫鉀0.4-0.6g、氯化鈉0.8-1.2g、葡萄糖1.2-1.4g、抗菌劑0.1-0.5g、氯化鈣0.2-0.3g、甘氨酸0.04-0.06g、維生素0.04-0.08g、七水硫酸鎂0.2-0.4g、純凈水80-100g、蔗糖1-3g、生長(zhǎng)素0.01-0.02g、細(xì)胞分裂素0.03-0.05g、激動(dòng)素0.01-0.02g以及玉米素0.01-0.02g。
作為優(yōu)選，所述抗菌劑包括納米二氧化鈦、納米氧化鋅以及氨芐中的至少一種。
作為優(yōu)選，所述維生素包括維生素b1和維生素b6中的至少一種。
作為優(yōu)選，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基按重量計(jì)，包括如下組分：硝酸銨0.8-1.2g、磷酸二氫鉀0.4-0.6g、氯化鈉0.8-1.2g、葡萄糖1.2-1.4g、納米二氧化鈦0.2-0.3g、納米氧化鋅0.2-0.3g、氨芐0.01-0.03g、氯化鈣0.2-0.3g、甘氨酸0.04-0.06g、維生素b10.02-0.04g、維生素b20.02-0.04g、七水硫酸鎂0.2-0.4g、純凈水80-100g、蔗糖1-3g、生長(zhǎng)素0.01-0.02g、細(xì)胞分裂素0.03-0.05g、激動(dòng)素0.01-0.02g以及玉米素0.01-0.02g。
本發(fā)明所提供的培養(yǎng)基內(nèi)含有植物組織培養(yǎng)過(guò)程中需要的無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)物：七水硫酸鎂、氯化鈣、硝酸銨、磷酸二氫鉀、氯化鈉；碳源：葡萄糖；有機(jī)附加物：甘氨酸和維生素；生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑。上述五大類(lèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)是植物組織生長(zhǎng)過(guò)程中不可或缺的；
同時(shí)，0.8-1.2g硝酸銨為三葉青組織生長(zhǎng)提供了充足的氮源，可以有效促進(jìn)植物細(xì)胞中蛋白質(zhì)、葉綠素以及核酸的生成；0.4-0.6g磷酸二氫鉀也為三葉青組織細(xì)胞中生物膜、核苷酸以及核酸的形成提供了充足的磷元素，并且磷酸二氫鉀所提供的鉀元素可以促進(jìn)氮素代謝以及碳水化合物的轉(zhuǎn)移，從而加快了三葉青組織細(xì)胞的生長(zhǎng)；0.2-0.3g氯化鈣為三葉青組織細(xì)胞壁的生長(zhǎng)提供了充足的鈣元素；此外，該培養(yǎng)基還添加了七水硫酸鎂作為鎂源，加快葉綠素的形成；培養(yǎng)基內(nèi)添加的有機(jī)附加物和生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑可以促進(jìn)三葉青組織快速生長(zhǎng)。
更加具體地，上述誘導(dǎo)培養(yǎng)基，按重量計(jì)，包括如下組分：硝酸銨1.0g、磷酸二氫鉀0.5g、氯化鈉1.0g、葡萄糖1.3g、納米二氧化鈦0.25g、納米氧化鋅0.25g、氨芐0.02g、氯化鈣0.25g、甘氨酸0.05g、生長(zhǎng)素0.015g、細(xì)胞分裂素0.04g、激動(dòng)素0.015g、玉米素0.015g、維生素b10.03g、維生素b20.03g、七水硫酸鎂0.3g、蔗糖2g以及純凈水90g。
作為優(yōu)選，上述誘導(dǎo)培養(yǎng)基還包括瓊脂。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：
本發(fā)明提供的三葉青快繁技術(shù)可快速得到三葉青的藥效部位，縮短了三葉青生長(zhǎng)周期，也可應(yīng)用于三葉青大面積種植，有利于保護(hù)野生三葉青種質(zhì)資源。
具體實(shí)施方式
下面采用具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。
實(shí)施例1
本實(shí)施例提供一種用于三葉青組織培養(yǎng)的光觸媒誘導(dǎo)培養(yǎng)基，按重量比計(jì)，由以下物質(zhì)組成：
硝酸銨0.8g、磷酸二氫鉀0.4g、氯化鈉0.8g、葡萄糖1.2g、納米二氧化鈦0.8g、納米氧化鋅0.2g、氨芐0.01g、氯化鈣0.2g、甘氨酸0.04g、生長(zhǎng)素0.01g、細(xì)胞分裂素0.03g、激動(dòng)素0.01g、玉米素0.01g、維生素b10.02g、維生素b20.02g、七水硫酸鎂0.2g、蔗糖1g以及純凈水80g。
對(duì)比例1-1
本實(shí)施例提供一種用于三葉青組織培養(yǎng)的光觸媒誘導(dǎo)培養(yǎng)基，按重量比計(jì)，由以下物質(zhì)組成：
硝酸銨0.8g、磷酸二氫鉀0.4g、氯化鈉0.8g、葡萄糖1.2g、氯化鈣0.2g、甘氨酸0.04g、納米二氧化鈦0.2g、納米氧化鋅0.2g、維生素b10.02g、維生素b20.02g、七水硫酸鎂0.2g、蔗糖1g以及純凈水80g。
對(duì)比例1-2
本實(shí)施例提供一種用于三葉青組織培養(yǎng)的光觸媒誘導(dǎo)培養(yǎng)基，按重量比計(jì)，由以下物質(zhì)組成：
硝酸銨0.8g、磷酸二氫鉀0.4g、氯化鈉0.8g、葡萄糖1.2g、納米二氧化鈦0.2g、納米氧化鋅0.2g，氯化鈣0.2g、甘氨酸0.04g、生長(zhǎng)素0.01g、細(xì)胞分裂素0.03g、激動(dòng)素0.01g、玉米素0.01g、維生素b10.02g、維生素b20.02g、七水硫酸鎂0.2g以及純凈水80g。
對(duì)比例1-3
本實(shí)施例提供一種用于三葉青組織培養(yǎng)的光觸媒誘導(dǎo)培養(yǎng)基，按重量比計(jì)，由以下物質(zhì)組成：
硝酸銨0.8g、磷酸二氫鉀0.4g、氯化鈉0.8g、葡萄糖1.2g、氨芐0.01g、氯化鈣0.2g、甘氨酸0.04g、生長(zhǎng)素0.01g、細(xì)胞分裂素0.03g、激動(dòng)素0.01g、玉米素0.01g、維生素b10.02g、維生素b20.02g、七水硫酸鎂0.2g、蔗糖1g以及純凈水80g。
實(shí)施例2
本實(shí)施例提供一種用于三葉青組織培養(yǎng)的光觸媒誘導(dǎo)培養(yǎng)基，按重量比計(jì)，由以下物質(zhì)組成：
硝酸銨1.0g、磷酸二氫鉀0.5g、氯化鈉1.0g、葡萄糖1.3g、納米二氧化鈦0.25g、納米氧化鋅0.25g、氨芐0.02g、氯化鈣0.25g、甘氨酸0.05g、生長(zhǎng)素0.015g、細(xì)胞分裂素0.04g、激動(dòng)素0.015g、玉米素0.015g、維生素b10.03g、維生素b20.03g、七水硫酸鎂0.3g、蔗糖2g以及純凈水90g。
對(duì)比例2-1
本實(shí)施例提供一種用于三葉青組織培養(yǎng)的光觸媒誘導(dǎo)培養(yǎng)基，按重量比計(jì)，由以下物質(zhì)組成：
硝酸銨1.0g、磷酸二氫鉀0.5g、氯化鈉1.0g、葡萄糖1.3g、氯化鈣0.25g、甘氨酸0.05g、納米二氧化鈦0.25g、納米氧化鋅0.25g、維生素b10.03g、維生素b20.03g、七水硫酸鎂0.3g、蔗糖2g以及純凈水90g。
對(duì)比例2-2
本實(shí)施例提供一種用于三葉青組織培養(yǎng)的光觸媒誘導(dǎo)培養(yǎng)基，按重量比計(jì)，由以下物質(zhì)組成：
硝酸銨1.0g、磷酸二氫鉀0.5g、氯化鈉1.0g、葡萄糖1.3g、納米二氧化鈦0.25g、納米氧化鋅0.25g，氯化鈣0.25g、甘氨酸0.05g、生長(zhǎng)素0.015g、細(xì)胞分裂素0.04g、激動(dòng)素0.015g、玉米素0.015g、維生素b10.03g、維生素b20.03g、七水硫酸鎂0.3g以及純凈水90g。
對(duì)比例2-3
本實(shí)施例提供一種用于三葉青組織培養(yǎng)的光觸媒誘導(dǎo)培養(yǎng)基，按重量比計(jì)，由以下物質(zhì)組成：
硝酸銨1.0g、磷酸二氫鉀0.5g、氯化鈉1.0g、葡萄糖1.3g、氨芐0.02g、氯化鈣0.25g、甘氨酸0.05g、生長(zhǎng)素0.015g、細(xì)胞分裂素0.04g、激動(dòng)素0.015g、玉米素0.015g、維生素b10.03g、維生素b20.03g、七水硫酸鎂0.3g、蔗糖2g以及純凈水90g。
實(shí)施例3
本實(shí)施例提供一種用于三葉青組織培養(yǎng)的光觸媒誘導(dǎo)培養(yǎng)基，按重量比計(jì)，由以下物質(zhì)組成：
硝酸銨1.2g、磷酸二氫鉀0.6g、氯化鈉1.2g、葡萄糖1.4g、納米二氧化鈦0.3g、納米氧化鋅0.3g、氨芐0.03g、氯化鈣0.3g、甘氨酸0.06g、生長(zhǎng)素0.02g、細(xì)胞分裂素0.05g、激動(dòng)素0.02g、玉米素0.02g、維生素b10.04g、維生素b20.04g、七水硫酸鎂0.4g、蔗糖3g以及純凈水100g。
對(duì)比例3-1
本實(shí)施例提供一種用于三葉青組織培養(yǎng)的光觸媒誘導(dǎo)培養(yǎng)基，按重量比計(jì)，由以下物質(zhì)組成：
硝酸銨1.2g、磷酸二氫鉀0.6g、氯化鈉1.2g、葡萄糖1.4g、氯化鈣0.3g、甘氨酸0.06g、納米二氧化鈦0.3g、納米氧化鋅0.3g、維生素b10.04g、維生素b20.04g、七水硫酸鎂0.4g、蔗糖3g以及純凈水100g。
對(duì)比例3-2
本實(shí)施例提供一種用于三葉青組織培養(yǎng)的光觸媒誘導(dǎo)培養(yǎng)基，按重量比計(jì)，由以下物質(zhì)組成：
硝酸銨1.2g、磷酸二氫鉀0.6g、氯化鈉1.2g、葡萄糖1.4g、納米二氧化鈦0.3g、納米氧化鋅0.3g，氯化鈣0.3g、甘氨酸0.06g、生長(zhǎng)素0.02g、細(xì)胞分裂素0.05g、激動(dòng)素0.02g、玉米素0.02g、維生素b10.04g、維生素b20.04g、七水硫酸鎂0.4g以及純凈水100g。
對(duì)比例3-3
本實(shí)施例提供一種用于三葉青組織培養(yǎng)的光觸媒誘導(dǎo)培養(yǎng)基，按重量比計(jì)，由以下物質(zhì)組成：
硝酸銨1.2g、磷酸二氫鉀0.6g、氯化鈉1.2g、葡萄糖1.4g、氨芐0.03g、氯化鈣0.3g、甘氨酸0.06g、生長(zhǎng)素0.02g、細(xì)胞分裂素0.05g、激動(dòng)素0.02g、玉米素0.02g、維生素b10.04g、維生素b20.04g、七水硫酸鎂0.4g、蔗糖3g以及純凈水100g。
實(shí)施例4
本實(shí)施例在上述光觸媒誘導(dǎo)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，提供一種三葉青快繁技術(shù)，包括如下步驟：
(1)取三葉青外植體，將其用流水沖洗2～3小時(shí)；
(2)將沖洗后的三葉青外植體用體積分?jǐn)?shù)為60～70％的乙醇溶液浸泡1～3分鐘；
(3)將經(jīng)酒精溶液浸泡的三葉青外植體使用0.1％氯化汞溶液沖洗1～2分鐘；
(4)將經(jīng)氯化汞溶液消毒的三葉青外植體使用蒸餾水沖洗3～5次，并使用濾紙吸干其表面的水分；
(5)將經(jīng)上述消毒處理的三葉青外植體斜插入誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
測(cè)試?yán)?
將實(shí)施例1-實(shí)施例3編號(hào)為1～3，對(duì)比例1-1～1-3、對(duì)比例2-1～2-3以及對(duì)比例3-1～3-3所提供的培養(yǎng)基編號(hào)為a1～a3、b1～b3、c1～c3，將取自浙江農(nóng)林大學(xué)實(shí)驗(yàn)基地的三葉青塊根按照實(shí)施例4所提供的步驟處理后，分別接種至上述培養(yǎng)基上，每組分別設(shè)置20個(gè)對(duì)照實(shí)驗(yàn)組；
接種后將各培養(yǎng)基在26±1℃微光條件下培養(yǎng)20天，觀察比較各培養(yǎng)基內(nèi)三葉青塊根組織細(xì)胞的生長(zhǎng)情況統(tǒng)計(jì)如表1所示：
表1三葉青塊根組織細(xì)胞生長(zhǎng)情況統(tǒng)計(jì)表