本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其是植物組織培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用dna甲基化抑制劑構(gòu)建植物群體的方法。

背景技術(shù)：

作為育種工作的物質(zhì)基礎(chǔ)，育種資源的豐富度直接決定良種選育的效率。當(dāng)前，除了深入挖掘我國(guó)植物種質(zhì)資源、規(guī)?；M(jìn)我國(guó)十分短缺又迫切需要的基因資源外，利用人工方法創(chuàng)造新的種質(zhì)資源是解決育種資源匱乏、創(chuàng)造新的種質(zhì)資源的有效途徑。

目前人工方法創(chuàng)造新的植物種質(zhì)資源主要包括誘變技術(shù)和轉(zhuǎn)基因技術(shù)。與轉(zhuǎn)基因技術(shù)相比，誘變技術(shù)雖然具有變化性狀不可控、可能出現(xiàn)有害變化性狀等缺點(diǎn)，但其同時(shí)也具有變化群體大、性狀豐富等優(yōu)點(diǎn)，通過選擇，能夠從變化群體中獲得優(yōu)良的種質(zhì)資源。

誘變技術(shù)分物理誘變和化學(xué)誘變。物理誘變主要使用各種高能射線輻射誘導(dǎo)基因組發(fā)生變化?；瘜W(xué)誘變是使用各種化學(xué)藥劑誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生變化，具有簡(jiǎn)單、高效、安全的特點(diǎn)。

dna甲基化抑制劑是一種化學(xué)誘變劑，其中常用的為5-氮雜胞苷(5-azac)。5-azac是一類不改變基因組序列，但能使基因組甲基化水平降低的堿基類似物，能夠誘導(dǎo)生物發(fā)生變化。甲基化變化后，能夠?qū)е孪嚓P(guān)基因的表達(dá)發(fā)生變化，引起一系列生理生化變化，從而使植物發(fā)生各種性狀的變化(chanetal.,2005；zhang,2008)。研究發(fā)現(xiàn)，用甲基化抑制劑處理后，植物整體甲基化水平降低，能夠誘發(fā)出一些新的性狀。在小麥的研究中發(fā)現(xiàn)，用5-azac處理能夠促進(jìn)其開花(horváthetal.,2003)；5-azac處理的小麥植株在分蘗數(shù)、分蘗率和千粒重均比對(duì)照高(陳芳和王子成，2011)。5-azac處理的亞麻出現(xiàn)了矮化和早熟性狀(fiddesetal.,2005)。用5-azac處理水稻能使其對(duì)白葉枯病的抗性得到提高(akimotoetal.,2007)。

楊樹屬于楊柳科(salicacae)楊屬(populusl.)植物，為多年生木本喬木，是重要的造林綠化樹種和工業(yè)用材樹種。優(yōu)良的種質(zhì)資源是楊樹良種選育及雜交育種的必要材料。特別是歐洲黑楊(p.nigra)，僅在我國(guó)新疆北部地區(qū)有少量分布，基因資源相當(dāng)匱乏(丁明明等，2008)。因此，亟待開發(fā)出一種創(chuàng)造優(yōu)良楊樹基因資源的方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述缺陷，為進(jìn)一步豐富楊樹等林木種質(zhì)資源，提供了一種利用dna甲基化抑制劑構(gòu)建植物群體的方法。該方法不僅能夠創(chuàng)造新的種質(zhì)資源，還能夠?yàn)楸碛^遺傳學(xué)研究提供材料。

為此，本發(fā)明提供了一種利用dna甲基化抑制劑構(gòu)建植物群體的方法，其包括以下步驟：

1、外植體的選擇、消毒預(yù)處理和培養(yǎng)；

2、無菌苗的擴(kuò)繁；

3、無菌葉片的選擇及預(yù)處理；

4、無菌葉片甲基化抑制劑處理；

5、再生芽的生根培養(yǎng)；

6、再生植株的溫室移栽；

其中，所述dna甲基化抑制劑為5-氮雜胞苷(5-azac)。

在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，步驟1中外植體的選擇是剪取半木質(zhì)化的新發(fā)枝條，剪去葉片，清洗后，放入超凈工作臺(tái)；外植體的消毒預(yù)處理為剪取5cm左右的莖段，采用75％的酒精滅菌30秒，10％的次氯酸鈉消毒8-10分鐘，用無菌水沖洗外植體3次，滅菌濾紙吸干；外植體的培養(yǎng)是將消毒滅菌后的外植體接種在ms啟動(dòng)培養(yǎng)基中。

在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，步驟1中在對(duì)外植體進(jìn)行培養(yǎng)之前，還包括在無菌條件下將外植體材料上與消毒劑接觸過的界面進(jìn)行切除的步驟。

在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，步驟2中無菌苗的擴(kuò)繁是切取上述莖段外植體上生長(zhǎng)的1-1.5cm高的芽，接種在生根培養(yǎng)基中，所述生根培養(yǎng)基為1/2ms+iba0.01mg/l+naa0.01mg/l+蔗糖25g/l+植物凝膠2.5g/l。

在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，步驟3中無菌葉片的選擇是選擇中上部完全展開的葉片；無菌葉片的預(yù)處理是在無菌條件下，用醫(yī)用手術(shù)刀切去0.2mm左右的葉片邊緣，并垂直于葉脈劃3-4個(gè)0.5cm左右的傷口。

在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，步驟4中無菌葉片甲基化抑制劑處理是將劃傷的葉片放置在添加不同濃度5-azac的分化培養(yǎng)基上進(jìn)行處理，5-azac的濃度分別為0μmol/l、100μmol/l、200μmol/l、400μmol/l、600μmol/l、800μmol/l和1000μmol/l，分化培養(yǎng)基為ms+ba0.5mg/l+naa0.03mg/l+蔗糖30g/l+植物凝膠2.5g/l。

在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，步驟5中再生芽的生根培養(yǎng)是將0.5-1.0cm的再生芽切下，接種到生根培養(yǎng)基中，所述生根培養(yǎng)基為1/2ms+iba0.01mg/l+naa0.01mg/l+蔗糖25g/l+植物凝膠2.5g/l。

在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，步驟6中再生植株的溫室移栽是將生根良好、苗高5cm左右的再生植株根系上的培養(yǎng)基徹底清洗，移栽到全自動(dòng)溫室中，營(yíng)養(yǎng)缽?fù)寥琅浞綖楦惩?份、珍珠巖2份、河沙2份。

在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，培養(yǎng)外植體和處理后葉片的環(huán)境條件為光周期16h/8h、光照強(qiáng)度2500lux、溫度27℃/21℃。

在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，外植體為楊樹外植體，更加優(yōu)選為歐洲黑楊外植體。

由上述描述可知，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具備如下優(yōu)點(diǎn)：

1、本發(fā)明提供了一種利用dna甲基化抑制劑5-azac創(chuàng)造植物群體的方法。該方法不改變植物基因組序列，僅改變基因組甲基化水平，具有安全、高效的特點(diǎn)。

2、本發(fā)明提供了一種利用dna甲基化抑制劑構(gòu)建植物群體的方法，其通過在植物組織培養(yǎng)過程中，在分化培養(yǎng)基中添加不同濃度的dna甲基化抑制劑5-azac，從而獲得再生植株群體。該方法簡(jiǎn)單易行，能夠在短時(shí)間內(nèi)創(chuàng)造出類型豐富的群體。

3、本發(fā)明提供了一種利用dna甲基化抑制劑構(gòu)建植物群體的方法，其不僅能夠創(chuàng)造新的種質(zhì)資源，而且獲得的各種變化類型為深入研究甲基化調(diào)控機(jī)理提供了珍貴材料。

綜上所述，本發(fā)明通過在楊樹葉片組織培養(yǎng)的分化培養(yǎng)階段，將不同濃度的5-azac添加在分化培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)再生植株發(fā)生改變，獲得生長(zhǎng)及生理生化等表型性狀產(chǎn)生廣泛變化的群體。本發(fā)明可用于楊樹等林木種植資源創(chuàng)新及新品種創(chuàng)制，也可用于構(gòu)建植物表觀遺傳學(xué)研究的突變體庫，具有廣闊的應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1：不同濃度5-azac對(duì)歐洲黑楊n46再生芽的影響。

a：未添加5-azac處理，分化11天的狀況；

b：添加400μmol/l5-azac，分化38天的狀況。

圖2：歐洲黑楊5-azac誘導(dǎo)群體中葉片形狀的代表性變化類型。

a：600μmol/l5-azac處理群體中葉片性狀變化株系；

b：800μmol/l5-azac處理群體中葉片性狀變化株系；

c：1000μmol/l5-azac處理群體中葉片性狀變化株系；

d：0μmol/l、600μmol/l、800μmol/l和1000μmol/l5-azac處理群體中葉片性狀變化類型。

具體實(shí)施方式

下面通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明，旨在用于說明本發(fā)明而非限定本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行若干改進(jìn)和修飾，這些改進(jìn)和修飾也同樣落入本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

實(shí)施例1：利用dna甲基化抑制劑5-azac構(gòu)建歐洲黑楊群體

1、外植體采集植株培養(yǎng)

將冬眠的歐洲黑楊無性系n46穗條剪成15cm長(zhǎng)度，插入直徑6cm的營(yíng)養(yǎng)缽中，營(yíng)養(yǎng)土為草炭土、珍珠巖和河沙混合配制(6:2:2)，放置于控溫自動(dòng)化日光溫室中，溫度25-28℃，期間進(jìn)行日常的肥水管理和病蟲害防治。

2、外植體選擇

扦插30天后，選取生長(zhǎng)健壯、無病蟲害、腋芽飽滿的歐洲黑楊n46半木質(zhì)化新發(fā)枝條，剪去幼嫩的尖端及葉片，保留2mm葉柄，作為外植體。

3、外植體消毒滅菌

(1)清洗

用流動(dòng)的自來水進(jìn)行外植體清洗，時(shí)間為30分鐘，之后用濾紙吸干表面水分，放入超凈臺(tái)中。

(2)酒精滅菌

將上述莖段移入無菌培養(yǎng)皿中，加入75％酒精，輕輕晃動(dòng)，約30秒后，迅速取出。

(3)次氯酸鈉滅菌

將上述莖段移入無菌培養(yǎng)皿中，倒入50-80ml10％的次氯酸鈉溶液，消毒8-10分鐘，期間輕輕晃動(dòng)2-3次。

(4)無菌水清洗

將上述莖段移入無菌培養(yǎng)皿中，用無菌水沖洗外植體3次，用滅菌的濾紙吸干外植體表面水分。

4、外植體培養(yǎng)

將上述處理的莖段置于無菌培養(yǎng)皿中，用滅菌過的醫(yī)用手術(shù)剪刀，將與消毒劑接觸過的莖段兩端界面切除1-1.5mm，之后接種在ms啟動(dòng)培養(yǎng)基中。

將培養(yǎng)瓶移入組織培養(yǎng)箱，設(shè)置培養(yǎng)箱的培養(yǎng)條件為光周期16h/8h，光照強(qiáng)度2500lux，培養(yǎng)溫度為27℃/21℃。

5、無菌苗培養(yǎng)及擴(kuò)繁

莖段外植體培養(yǎng)20天左右，無菌條件下，切取1-1.5cm高的芽，接種在添加iba0.01mg/l、naa0.01mg/l、蔗糖25g/l、植物凝膠2.5g/l的1/2ms生根培養(yǎng)基中，30天左右擴(kuò)繁一次，培養(yǎng)環(huán)境同上。

6、無菌葉片預(yù)處理

選取無菌苗為中上部完全展開葉片，在無菌條件下，用醫(yī)用手術(shù)刀切去0.2mm左右的葉片邊緣，并垂直于葉脈劃3-4個(gè)0.5cm左右傷口。

7、無菌葉片5-azac處理

將預(yù)處理的葉片放置在添加不同濃度dna甲基化抑制劑5-azac的ms分化培養(yǎng)基(ba0.5mg/l、naa0.03mg/l、蔗糖30g/l、植物凝膠2.5g/l)上，移入組織培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)，5-azac的濃度分別為0μmol/l、100μmol/l、200μmol/l、400μmol/l、600μmol/l、800μmol/l和1000μmol/l。

8、再生芽生根培養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，dna甲基化抑制劑5-azac處理會(huì)導(dǎo)致葉片分化時(shí)間延遲，分化芽減少，處理濃度越高，延遲時(shí)間越長(zhǎng)、分化芽數(shù)越少，參見說明書附圖1。當(dāng)分化出的再生芽生長(zhǎng)到0.5-1.0cm時(shí)，將再生芽從基部切下，接種到生根培養(yǎng)基(1/2ms+iba0.01mg/l+naa0.01mg/l+蔗糖25g/l+植物凝膠2.5g/l)中。

9、再生植株溫室移栽

將生根良好、苗高5cm左右的再生植株根系上的培養(yǎng)基徹底清洗，移栽到全自動(dòng)溫室中，營(yíng)養(yǎng)缽?fù)寥琅浞綖楦惩?份、珍珠巖2份，河沙2份。

10、變化群體表型測(cè)定

移栽成活后，對(duì)其葉片形態(tài)進(jìn)行觀測(cè)，參見附圖2。期間進(jìn)行常規(guī)肥水管理，但不噴灑農(nóng)藥。并于移栽成活3個(gè)月后，進(jìn)行株高、葉綠素、光合生理及保護(hù)酶活性的測(cè)定，以確定群體的變化范圍，具體見表1-4。

表15-azac誘導(dǎo)歐洲黑楊n46群體生長(zhǎng)性狀變化情況

表25-azac誘導(dǎo)歐洲黑楊n46群體的葉綠素含量變化情況

表35-azac誘導(dǎo)歐洲黑楊n46群體的光合特性變化情況

表45-azac誘導(dǎo)歐洲黑楊n46群體的保護(hù)酶活性的變化情況