本發(fā)明涉及一種黑果枸杞的快速繁殖方法，特別涉及一種適用于不同種源的黑果枸杞的高效快速繁殖方法，屬于植物組織培養(yǎng)
技術(shù)領(lǐng)域：
。
背景技術(shù)：
：黑果枸杞(lyciumruthenicummurr.)屬于茄科、枸杞屬多年生灌木，具有耐旱、耐鹽堿的特性，是集鹽堿地綠化價(jià)值、經(jīng)濟(jì)價(jià)值、藥用價(jià)值等為一體的野生灌木樹(shù)種，在生態(tài)建設(shè)和區(qū)域經(jīng)濟(jì)發(fā)展中有巨大的應(yīng)用前景。黑果枸杞主要分布在我國(guó)西部，集中在青海的柴達(dá)木盆地(格爾木、都蘭、德令哈等地區(qū))，甘肅河西走廊(瓜洲、玉門(mén)、靖遠(yuǎn)等地區(qū))以及內(nèi)蒙的額濟(jì)納旗、阿拉善左旗和右旗，各自然群體具有豐富的表型多樣性和遺傳多樣性。由于近年來(lái)野生黑枸杞高額利潤(rùn)帶來(lái)的野蠻采摘，黑果枸杞野生資源已瀕臨滅絕，保護(hù)和利用各地區(qū)野生資源迫在眉睫。利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)既可以保留原有植株的優(yōu)良性狀，又可將優(yōu)良單株快速繁殖成無(wú)性系，迅速在生產(chǎn)中推廣應(yīng)用。目前，黑果枸杞快速繁殖研究方面，有如下三個(gè)方面：(1)以嫩莖段為外植體的快速繁殖體系研究：浩仁塔本等人在《植物生理學(xué)通訊》(2005，41(5):631-631)中公開(kāi)的“黑果枸杞的組織培養(yǎng)”一文中，首次發(fā)表了有關(guān)黑果枸杞組織培養(yǎng)的研究報(bào)告，利用帶腋芽的嫩莖段進(jìn)行ms(ms培養(yǎng)基：murashigeandskoog培養(yǎng)基)+6-ba(6-芐氨基腺嘌呤)1.0mg/l+naa(萘乙酸)0.2mg/l+2.5％蔗糖+0.8％瓊脂和ms+6-ba(6-芐氨基腺嘌呤)0.5mg/l+naa0.2mg/l+2.5％蔗糖+0.8％瓊脂兩種誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基的比較，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞分裂素高時(shí)，易產(chǎn)生愈傷組織，不定芽數(shù)量少，且芽莖較短，葉片多，不適合繼代。兩種不定芽增殖培養(yǎng)基為ms+6-ba0.5mg/l+naa0.1mg/l和ms+6-ba0.5mg/l+naa0.2mg/l，但蔗糖瓊脂均減半(即蔗糖12.5％，瓊脂0.4％)；生根培養(yǎng)基為1/2ms+naa0.1mg/l，約20天后生根，生根率88％左右。杜敏智在2015年公開(kāi)的“大果黑果枸杞組培快繁技術(shù)體系的研究”一文中，以大果黑果枸杞為研究對(duì)象，采用嫩莖段器官為材料，比較了zt(異戊烯氨基嘌呤)和6-ba(6-芐氨基腺嘌呤)與iba(吲哚丁酸)不同濃度(0.5-1.75mg/l)組合下誘導(dǎo)分化的效果，得出6-ba(6-芐氨基腺嘌呤)玻璃化更嚴(yán)重，zt與iba組合更適合黑果枸杞增殖培養(yǎng)(瓊脂濃度5.5g/l)，iba激素1mg/l為該研究中得到的最適濃度。針對(duì)玻璃化現(xiàn)象對(duì)蔗糖含量、瓊脂含量以及光照強(qiáng)度進(jìn)行調(diào)整，該研究認(rèn)為隨著瓊脂含量增高，光照強(qiáng)度增加可一定程度減輕玻璃化，通過(guò)zt濃度循環(huán)調(diào)整，也可達(dá)到減輕繼代過(guò)程中更容易出現(xiàn)的玻璃化的目的。胡相偉等人在《甘肅農(nóng)業(yè)科技》(2015(5):73-74)發(fā)表的“黑果枸杞組織培養(yǎng)技術(shù)”一文中公開(kāi)：用一年生休眠枝帶一個(gè)芽的小莖段為材料得出，各階段培養(yǎng)基成分含量依次為：芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基：ms+0.5mg/l6-ba(6-芐氨基腺嘌呤)+30mg/g蔗糖+6mg/g瓊脂；繼代培養(yǎng)基：ms+0.3mg/l6-ba(6-芐氨基腺嘌呤)+0.05mg/lnaa+30mg/g蔗糖+6mg/g瓊脂；生根培養(yǎng)基：1/2ms+0.5mg/liaa(吲哚乙酸)+15mg/g蔗糖+6mg/g瓊脂。該研究下最適生根培養(yǎng)基在約20天長(zhǎng)出不定根。馬彥軍等人在《林業(yè)實(shí)用技術(shù)》(2015(6):26-28)中發(fā)表的“黑果枸杞組織培養(yǎng)快繁技術(shù)研究”，文中公開(kāi)了：采用1年生苗的莖段誘導(dǎo)愈傷，其中ms+6-ba1.0mg/l+naa1.0mg/l愈傷組織誘導(dǎo)率最高，質(zhì)量最好，愈傷組織培養(yǎng)30天左右，有叢生芽長(zhǎng)出；當(dāng)naa濃度為0.2mg/l，6-ba濃度在0.1-0.4mg/l之間時(shí)，隨著6-ba濃度增大，不定芽的出芽數(shù)量在減少，增殖系數(shù)降低，6-ba濃度為0.1mg/l時(shí)增殖系數(shù)最大，為3.58；6-ba濃度達(dá)到0.4mg/l時(shí)，增殖系數(shù)僅為1.93，而且在基部形成大量愈傷組織，不定芽短縮，透明、玻璃化現(xiàn)象嚴(yán)重。naa0.2mg/l+iba0.2mg/l的組合，黑果枸杞組培苗生根率、平均根數(shù)及平均根長(zhǎng)最大，依次分別為93.3％，12.5條，6.8cm。(2)利用葉片為外植體的快速繁殖體系研究：楊寧等人在《西北師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)》(2016年02：84-88)中發(fā)表的“黑果枸杞的組織培養(yǎng)和快速繁殖”一文中公開(kāi)了如下內(nèi)容：利用葉片誘導(dǎo)脫分化產(chǎn)生愈傷，篩選得到的最優(yōu)愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基：ms+0.5mg/l6-ba(6-芐氨基腺嘌呤)+0.1mg/l2,4-d(二氯苯氧乙酸)+10g/l蔗糖，出愈率達(dá)88％，愈傷組織生長(zhǎng)狀態(tài)良好；利用愈傷誘導(dǎo)不定芽分化，發(fā)現(xiàn)當(dāng)6-ba濃度為0.2mg/l時(shí)，黑果枸杞不定芽的增殖狀態(tài)最好。選用iba為誘導(dǎo)生根激素，當(dāng)iba濃度為0.1mg/l時(shí)，生根率50％；濃度達(dá)到0.2mg/l時(shí)，生根率達(dá)到95％。孫曉紅等人在《植物生理學(xué)報(bào)》(2016,52(5):653-658)中發(fā)表的“黑果枸杞的葉片分化與快速繁殖”一文中公開(kāi)了如下內(nèi)容：以黑果枸杞成熟葉片為外植體,誘導(dǎo)愈傷組織及不定芽的分化，獲得再生植株，建立了黑果枸杞組織培養(yǎng)和快速繁殖技術(shù)新體系。結(jié)果表明：誘導(dǎo)葉片脫分化形成愈傷組織的適宜培養(yǎng)基為ms+6-ba(6-芐氨基腺嘌呤)1.0mg/l+naa0.2mg/l,誘導(dǎo)率100％，愈傷組織綠色，致密團(tuán)狀，無(wú)玻璃化；誘導(dǎo)愈傷組織分化和生長(zhǎng)的適宜培養(yǎng)基為ms+zt(異戊烯氨基嘌呤)1.4mg/l+naa(萘乙酸)0.02mg/l,平均叢生芽數(shù)為23.7株；誘導(dǎo)生根的適宜培養(yǎng)基為ms+iba(吲哚丁酸)0.6mg/l+naa(萘乙酸)0.4mg/l。但研究中發(fā)現(xiàn)，在naa濃度固定的情況下,隨著6-ba濃度的增高，愈傷組織誘導(dǎo)率和分化率均增高，但愈傷組織玻璃化現(xiàn)象嚴(yán)重，有效不定芽數(shù)減少；培養(yǎng)基中只添加玉米素zt(異戊烯氨基嘌呤)一種激素時(shí)，隨著zt濃度的升高，叢生芽的平均高度和數(shù)目均增加，芽生長(zhǎng)狀態(tài)由弱到強(qiáng)，但都有不同程度的玻璃化；培養(yǎng)基中添加0.02mg/l的naa后再添加zt(異戊烯氨基嘌呤)，玻璃化程度大大減弱。(3)其他：王方琳等人在《干旱區(qū)資源與環(huán)境》(2016(10):104-109)公開(kāi)的“荒漠區(qū)藥用植物黑果枸杞(lyciumruthencium)的組織培養(yǎng)”一文中公開(kāi)了如下內(nèi)容：以黑果枸杞無(wú)菌苗的子葉、莖段、胚軸為外植體材料，研究不同激素配比的培養(yǎng)基對(duì)不同外植體愈傷組織培養(yǎng)、叢生芽增殖及生根培養(yǎng)的影響。比較得出，葉片是最適宜黑果枸杞進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)的外植體材料，篩選得到的培養(yǎng)基為ms+0.36-ba(6-芐氨基腺嘌呤)+1.02,4-d(二氯苯氧乙酸)；較高濃度的細(xì)胞分裂6-ba對(duì)叢生芽增殖具有明顯的促進(jìn)作用，在6-ba(6-芐氨基腺嘌呤)為3.0mg/l、kt(激動(dòng)素)0.3mg/l、naa(萘乙酸)0.5mg/l時(shí)叢生芽增殖率達(dá)到最大值90.2％，且叢生芽數(shù)量多、莖干健壯、生長(zhǎng)旺盛；最適宜的生根培養(yǎng)基為1/2ms+0.5naa+1/2mgso4，叢生芽4天時(shí)，開(kāi)始生根，生根率可達(dá)98.2％，平均生根數(shù)和根長(zhǎng)分別為5.19個(gè)和4.51cm，且根長(zhǎng)，粗壯，根毛發(fā)達(dá)。喬永旭在《中藥材》(2015(10):2031-2034)中“黑果枸杞高頻再生體系的建立”一文中公開(kāi)了如下內(nèi)容：試驗(yàn)中探討了子葉、下胚軸和胚根3種外植體誘導(dǎo)愈傷組織的情況，發(fā)現(xiàn)下胚軸誘導(dǎo)的愈傷組織最好。誘導(dǎo)愈傷組織的最佳培養(yǎng)基為ms+6-ba(6-芐氨基腺嘌呤)1.0mg/l+naa0.5mg/l，愈傷組織誘導(dǎo)率高達(dá)100％；叢生芽誘導(dǎo)和增殖的最佳培養(yǎng)基為ms+6-ba(6-芐氨基腺嘌呤)0.5mg/l+naa0.5mg/l，增殖系數(shù)為7.73；根誘導(dǎo)的最適培養(yǎng)基為1/2ms+iba1.0mg/l(1/2ms+iba0.1mg/l(50％))。但試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)各培養(yǎng)基均出現(xiàn)不同程度的玻璃化。冀菲等人在《北華大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)》(2016，17(4):537-539)中公開(kāi)的“黑果枸杞組培繁殖培養(yǎng)基選擇”一文中公開(kāi)了如下內(nèi)容：研究結(jié)果表明，無(wú)菌苗在0.1mg/liba濃度不變的情況下，在細(xì)胞分裂素含量較高的培養(yǎng)基中愈傷組織形成的量較大，得出ms+1.0mg/l6-ba(6-芐氨基腺嘌呤)+0.1mg/liba培養(yǎng)基中可以形成較好的愈傷組織；愈傷在ms+0.4mg/l6-ba(6-芐氨基腺嘌呤)+0.1mg/liba培養(yǎng)基中不定芽數(shù)量較多，繼代培養(yǎng)周期約為36天，在繼代培養(yǎng)過(guò)程中通過(guò)逐漸降低培養(yǎng)基細(xì)胞分裂素含量的方式，繼代培養(yǎng)效果較好；在iba濃度依次設(shè)置為0、1.0、1.5mg/l時(shí)，1/2ms+1.5mg/liba生根率最高，為98％，平均生根數(shù)為4條/株。目前，雖然已有部分關(guān)于黑果枸杞組織培養(yǎng)研究的報(bào)告，但目前研究報(bào)告都局限于單一種源(品種)培養(yǎng)條件探索，因此常出現(xiàn)在各階段培養(yǎng)基條件的摸索中，不同實(shí)驗(yàn)室即使使用了同一種激素，最終獲得最適培養(yǎng)基激素濃度不盡一致，給黑果枸杞的工廠化育苗帶來(lái)不便。此外，大部分報(bào)道中都提到不同程度的玻璃化的現(xiàn)象，說(shuō)明玻璃化問(wèn)題沒(méi)有得到根本解決。因此，提供一種適于不同種源的黑果枸杞種質(zhì)資源，具有普遍適用性且操作過(guò)程簡(jiǎn)單方便、成苗繁殖速度快、成活率高的黑果枸杞的高效快速繁殖方法就成為該
技術(shù)領(lǐng)域：
急需解決的技術(shù)難題。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種適于不同種源的黑果枸杞種質(zhì)資源，具有普遍適用性且操作過(guò)程簡(jiǎn)單方便、成苗繁殖速度快、成活率高的黑果枸杞的高效快速繁殖方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取以下技術(shù)方案：一種適用于不同種源的黑果枸杞的高效快速繁殖方法，其步驟如下：(1)無(wú)菌苗制備：收集不同種源的黑果枸杞種子，消毒處理后，接種于ms培養(yǎng)基上，長(zhǎng)出的小苗待用；(2)嫩莖段誘導(dǎo)不定芽分化培養(yǎng)基的篩選：利用莖段誘導(dǎo)叢生芽中激素種類(lèi)及梯度設(shè)置，進(jìn)行嫩莖段誘導(dǎo)不定芽的分化培養(yǎng)，篩選培養(yǎng)基條件，得到嫩芽；(3)生根培養(yǎng)基的篩選：利用步驟(2)得到的嫩芽進(jìn)行誘導(dǎo)生根，設(shè)計(jì)生根培養(yǎng)基，篩選培養(yǎng)基條件。優(yōu)選地，所述步驟(1)中，所述消毒處理的具體過(guò)程如下：放進(jìn)2ml離心管后，先用75％酒精消毒30秒，蒸餾水沖洗2-3次，然后用70％的84消毒液消毒6分鐘，蒸餾水再?zèng)_洗3-4次，吸干水分后，用殺過(guò)菌的鑷子接種于ms培養(yǎng)基上。優(yōu)選地，所述步驟(2)中，培養(yǎng)基條件為ms+蔗糖30g/l+瓊脂7g/l+肌醇100mg/l+6-ba0.1mg/l。優(yōu)選地，所述步驟(2)中，所述嫩芽為2cm左右，優(yōu)選1-3cm。優(yōu)選地，所述步驟(3)中，培養(yǎng)基條件為：ms+蔗糖30g/l+瓊脂7.5g/l+iba0.2mg/l。本發(fā)明所提供的黑果枸杞無(wú)菌快速繁殖技術(shù)，適于不同種源的黑果枸杞種質(zhì)資源，具有普遍適用性，且操作過(guò)程簡(jiǎn)單方便、成苗繁殖速度快、成活率高。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：本發(fā)明在考慮組織快速繁殖的快速性、高效性、經(jīng)濟(jì)性的同時(shí)，把激素成本和激素使用的方便程度考慮進(jìn)去，選取不同種源地收集的不同黑果枸杞種質(zhì)，同時(shí)進(jìn)行各階段共性培養(yǎng)基的篩選，以獲得穩(wěn)定、高效適應(yīng)所有黑果枸杞種質(zhì)生長(zhǎng)的培養(yǎng)基條件。本發(fā)明對(duì)已有的有關(guān)黑果枸杞莖段組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基的關(guān)鍵條件進(jìn)行了篩查檢驗(yàn)，在此基礎(chǔ)上摸索出一套簡(jiǎn)潔有效、適合不同種源黑果枸杞快速繁育的方法，為以后黑果枸杞無(wú)菌快繁工作提供了方向，為未來(lái)黑果枸杞的大規(guī)模工廠化育苗奠定基礎(chǔ)。下面通過(guò)具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明，但并不意味著對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制。具體實(shí)施方式實(shí)施例1一種適用于不同種源的黑果枸杞的高效快速繁殖方法，其步驟如下：(1)無(wú)菌苗制備從新疆(庫(kù)爾勒、巴楚、沙雅)、青海(格爾木、諾木洪、德令哈)、內(nèi)蒙(阿拉善左旗)、甘肅(瓜洲、永靖)地區(qū)收集到9個(gè)不同種源的黑果枸杞種子，挑選飽滿個(gè)兒大的種子，放進(jìn)2ml離心管后，先用75％酒精消毒30秒，蒸餾水沖洗2-3次，然后用70％的84消毒液消毒6分鐘，蒸餾水再?zèng)_洗3-4次，吸干水分后，用殺過(guò)菌的鑷子接種于ms培養(yǎng)基上，長(zhǎng)出的小苗待用；(2)嫩莖段誘導(dǎo)不定芽分化培養(yǎng)基的篩選1)方法：種子萌發(fā)后，待幼苗長(zhǎng)至5-6cm時(shí)，將其剪切成1cm長(zhǎng)左右的小莖段，去掉葉片，分別轉(zhuǎn)接至含不同濃度的6-ba與iaa的ms分化培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)分化叢生芽，培養(yǎng)溫度23-25℃，光周期16小時(shí)/8小時(shí)(晝/夜)，光照強(qiáng)度3klx。每28天繼代1次。利用嫩莖段誘導(dǎo)叢生芽中培養(yǎng)基條件以及激素種類(lèi)和梯度設(shè)置為：i、ms+蔗糖30g/l+瓊脂6g/l+6-ba0.1mg/l+iaa0.2mg/l；ii、ms+蔗糖30g/l+瓊脂6g/l+6-ba0.1mg/l+iaa0.4mg/l；iii、ms+蔗糖30g/l+瓊脂6g/l+6-ba0.05mg/l+iaa0.2mg/l；iv、ms+蔗糖30g/l+瓊脂7g/l+100mg/l肌醇+6-ba0.1mg/l；v、ms+蔗糖30g/l+瓊脂7g/l+100mg/l肌醇+6-ba0.2mg/l；vi、ms+蔗糖30g/l+瓊脂7g/l+100mg/l肌醇+6-ba0.3mg/l。i、ms+蔗糖30g/l+瓊脂6g/l+6-ba0.1mg/l+iaa0.2mg/l：接種4天時(shí)，觀察發(fā)現(xiàn)所有莖段上有褐色或綠色小芽出現(xiàn)；10天左右，可以看出，小芽已明顯長(zhǎng)成很小的不定芽，并無(wú)愈傷生成，但大多已經(jīng)明顯有玻璃化傾向；兩個(gè)月后，幾乎所有莖段分化的不定芽均嚴(yán)重玻璃化，葉片肥厚，水分含量大，后期生長(zhǎng)停滯。ii、ms+蔗糖30g/l+瓊脂6g/l+6-ba0.1mg/l+iaa0.4mg/l：通過(guò)增加iaa濃度的方式，達(dá)到降低6-ba在培養(yǎng)基中激素比例的目的，莖段誘導(dǎo)分化出的不定芽仍然嚴(yán)重玻璃化，不定芽后期停止長(zhǎng)大。iii、ms+蔗糖30g/l+瓊脂6g/l+6-ba0.05mg/l+iaa0.2mg/l：將6-ba濃度由0.1mg/l降低至0.05mg/l的方式，達(dá)到降低6-ba濃度，相應(yīng)增加iaa比例的目的；10天時(shí)觀察，發(fā)現(xiàn)所有莖段表面分化出的不定芽小葉正常，后期的30天以及45天兩個(gè)時(shí)間段觀察發(fā)現(xiàn)，不定芽與前期相比，大小保持在剛分化狀態(tài)，生長(zhǎng)緩慢，但不玻璃化。iv、ms+蔗糖30g/l+瓊脂7g/l+100mg/l肌醇+6-ba0.1mg/l：8天左右，芽點(diǎn)已繼續(xù)分化為小的成形的不定芽，所有基因型也無(wú)玻璃化出現(xiàn)，培養(yǎng)基穩(wěn)定，后期可以長(zhǎng)成正常的叢生芽。v、ms+蔗糖30g/l+瓊脂7g/l+100mg/l肌醇+6-ba0.2mg/l：能誘導(dǎo)出不定芽，但又都存在不同程度的玻璃化現(xiàn)象，因此，莖段誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基不穩(wěn)定。vi、ms+蔗糖30g/l+瓊脂7g/l+100mg/l肌醇+6-ba0.3mg/l：能誘導(dǎo)出不定芽，但又都存在不同程度的玻璃化現(xiàn)象，莖段誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基不穩(wěn)定。2)結(jié)果討論：在6-ba0.1mg/l+iaa0.2mg/l組合中，十天左右開(kāi)始有芽點(diǎn)長(zhǎng)出，但已經(jīng)明顯有玻璃化傾向，葉片肥厚，水分含量大，后期生長(zhǎng)停滯不前，許多研究中均提到細(xì)胞分裂素6-ba是極其容易導(dǎo)致玻璃化的激素，且濃度越高玻璃化越嚴(yán)重，因此，解除玻璃化可以采取降低6-ba濃度的方法，使其濃度不過(guò)高；此外，解除玻璃化還可以通過(guò)增加蔗糖濃度，降低培養(yǎng)基的滲透壓，來(lái)達(dá)到減少植株吸收水分減輕玻璃化的目的；適當(dāng)提高瓊脂含量，減少培養(yǎng)基含水量，也可減輕甚至解除玻璃化；因此，針對(duì)培養(yǎng)基為ms+蔗糖30g/l+瓊脂6g/l+6-ba0.1mg/l+iaa0.2mg/l中存在的玻璃化問(wèn)題，本研究過(guò)程中相應(yīng)的采取了以下五種措施：①降低6-ba(由0.1mg/l降至0.05mg/l)濃度，其他成分不變；②iaa濃度由0.2增加到0.4mg/l，6-ba濃度不變，從而提高iaa的相對(duì)比例，其他成分不變；③增加蔗糖濃度(由30g/l增加到45g/l)，其他成分不變；④增加瓊脂濃度(6g/l增加到7.5g/l)，其他成分不變；⑤同時(shí)增加兩者濃度(30g/l蔗糖+6g/l瓊脂改為45g/l蔗糖+7.5g/l瓊脂)，其他成分不變。結(jié)果顯示：采用降低6-ba濃度的方法一定程度上對(duì)玻璃化的減輕有一定效果，但是，莖段誘導(dǎo)分化產(chǎn)生芽的時(shí)間明顯延遲，并且，芽后期很難繼續(xù)長(zhǎng)大；而其他四種措施對(duì)莖段誘導(dǎo)叢生芽玻璃化問(wèn)題均無(wú)得到緩解甚至玻璃化加重；因此，該6-ba和iaa激素濃度組合并不適合作為莖段誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基的選擇。分別單獨(dú)添加0.2mg/l6-ba和0.3mg/l6-ba的情況下，均能誘導(dǎo)出不定芽，但又都存在不同程度的玻璃化現(xiàn)象，培養(yǎng)基不穩(wěn)定。0.1mg/l6-ba時(shí)，8天左右，有芽點(diǎn)長(zhǎng)出，沒(méi)有愈傷，也無(wú)玻璃化問(wèn)題，培養(yǎng)基穩(wěn)定，重復(fù)性好，因此，該濃度適合莖段誘導(dǎo)叢生芽，培養(yǎng)基條件為：ms+蔗糖30g/l+瓊脂7g/l+肌醇100mg/l+6-ba0.1mg/l。(3)生根培養(yǎng)基的篩選：1)方法：利用步驟(2)得到的2cm左右的嫩芽誘導(dǎo)生根，選取生長(zhǎng)一致的種源和株系，逐步設(shè)計(jì)生根培養(yǎng)基；培養(yǎng)基條件及激素種類(lèi)和梯度設(shè)置為：i、1/2ms+蔗糖30g/l+植物凝膠(1.5-2.5g/l)+iba0.6mg/l+naa0.4mg/l；ii、1/2ms+蔗糖30g/l+植物凝膠(1.5-2.5g/l)iba(0.2、0.25、0.4、0.5、0.75、0.8mg/l)；iii、1/2ms+蔗糖30g/l+瓊脂7.5g+iba1mg/l；iv、1/2ms+蔗糖30g/l+瓊脂7.5g+iba(0.1、0.2、0.25mg/l)。i、1/2ms+蔗糖30g/l+植物凝膠(1.5-2.5g/l)+iba0.6mg/l+naa0.4mg/l組合，在接種20天時(shí)統(tǒng)計(jì)，如下表1所示，所有的黑果枸杞植株基部只膨大，不生根。表1種源接種個(gè)數(shù)生根率(％)生長(zhǎng)狀態(tài)aks-l3(阿克蘇株系3)240只長(zhǎng)愈傷不生根sy(沙雅)240只長(zhǎng)愈傷不生根dgl(大格勒)240只長(zhǎng)愈傷不生根kel(庫(kù)爾勒)240只長(zhǎng)愈傷不生根aks-l1(阿克蘇株系1)240只長(zhǎng)愈傷不生根ii、對(duì)于1/2ms+蔗糖30g/l+植物凝膠(1.5-2.5g/l)+iba(0.2、0.25、0.4、0.5、0.75、0.8mg/l)，在添加不同濃度梯度iba(0.2、0.25、0.4、0.5、0.75、0.8mg/l)做誘導(dǎo)激素的情況下，以阿克蘇株系1aks-l1(阿克蘇)、阿克蘇株系3aks-l3以及sy(沙雅)、dgl(大格勒)種源為材料，10天后統(tǒng)計(jì)生根情況，如下表2所示，接種的所有莖段只有在個(gè)別iba濃度下生根，且生根率都不高，莖段基部有膨大成的愈傷組織。大部分都還沒(méi)生根，莖段基部只膨大長(zhǎng)成愈傷。30天后再統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)期間只有個(gè)別濃度個(gè)別株有新生根，具有明顯的偶然性。0.2、0.25、0.4、0.5、0.75、0.8mg/liba濃度下，此時(shí)的生根率依次為8.33％、4.16％、4.16％、4.16％、4.16％、25％。總的來(lái)說(shuō)在這幾類(lèi)培養(yǎng)基條件下黑果枸杞生根啟動(dòng)時(shí)間明顯延遲，即使生根，數(shù)量也稀少。因此，影響生根的可能的因素仍需要進(jìn)一步深入探究。表2iii、1/2ms+蔗糖30g/l+瓊脂7.5g+iba1mg/l組合，第13天時(shí)統(tǒng)計(jì)生根率，如下表3所示，各種源或同一種源的不同株系無(wú)菌苗均有生根，但生根率不高，在12％-30％之間。表3種源接種個(gè)數(shù)生根率(％)生長(zhǎng)狀況aks-l12425.00根3-4條，根長(zhǎng)2mm左右aks-l2248.30根長(zhǎng)1-2cm，3-4條aks-l32412.50根3-4條，根長(zhǎng)2mm左右aks-l72429.17根3-4條，根長(zhǎng)2mm左右dgl246.67根3-4條，根長(zhǎng)2mm左右sy2420.00根長(zhǎng)1cm左右，3-4條iv、1/2ms+蔗糖30g/l+瓊脂7.5g+iba(0.1、0.2、0.25mg/l)三種組合下，將生長(zhǎng)健壯的不定芽移栽至新的誘導(dǎo)生根培養(yǎng)基中，培養(yǎng)過(guò)程中共觀察發(fā)現(xiàn)植株地上部分開(kāi)始逐漸長(zhǎng)高，第5天從植株底部也開(kāi)始生根；第14天統(tǒng)計(jì)生根情況，如下表4、表5及表6所示，接種的幾個(gè)種源植株均生根，根長(zhǎng)在0.2cm-1cm不等。第21天時(shí)，根明顯伸長(zhǎng)，且有明顯的根毛。無(wú)論0.1mg/liba(表4)、0.2mg/liba(表5)還是0.25mg/liba(表6)的情況下，各種質(zhì)苗莖段基部均沒(méi)有膨大，直接生根，但相比較而言，iba含量為0.25mg/l時(shí)生根率更高，效果更好，且生根早，5天左右即開(kāi)始生根，20天后，幾乎所有接種莖段均能生根。表4表5種源接種個(gè)數(shù)生根率(％)生長(zhǎng)狀況als2480基部無(wú)膨大，根3‐5條，根長(zhǎng)2mm左右sy2475基部無(wú)膨大，根3‐5條，根長(zhǎng)1cm左右bc2480基部無(wú)膨大，根長(zhǎng)2mm‐1cm不等aks‐l324100基部無(wú)膨大，根4‐6條，根長(zhǎng)1cm左右表6種源接種個(gè)數(shù)生根率(％)生長(zhǎng)狀況als2483基部無(wú)膨大，根3‐5條，根長(zhǎng)2－5mmsy2480基部無(wú)膨大，根3‐5條，根長(zhǎng)1cm左右bc2492基部無(wú)膨大，根長(zhǎng)0.5‐1cmaks‐l324100基部無(wú)膨大，根4‐6條，根長(zhǎng)1cm左右2)結(jié)果討論：為方便觀察生根情況，最先選用透明植物凝膠作為ms培養(yǎng)基中的凝固劑，在已有文獻(xiàn)報(bào)道的生根培養(yǎng)基激素組合iba0.6mg/l+naa0.4mg/l的基礎(chǔ)上，對(duì)不同種源嫩莖段進(jìn)行生根培養(yǎng)，結(jié)果觀察到，iba0.6mg/l+naa0.4mg/l組合在接種20天時(shí)，幾乎所有種源的黑果枸杞植株基部只膨大，不生根；然后，仍以植物凝膠做凝固劑，以不同濃度梯度iba(0.2、0.25、0.4、0.5、0.75、0.8mg/l)做誘導(dǎo)激素繼續(xù)摸索誘導(dǎo)生根的條件，結(jié)果顯示，設(shè)置不同濃度iba梯度后，依然是大多數(shù)只出現(xiàn)基部膨大，少數(shù)種源可以生根，但帶有偶然性，根的數(shù)量也稀少。針對(duì)莖段基部只膨大不生根的問(wèn)題，推斷一種可能性是培養(yǎng)基中使用的植物凝膠影響了培養(yǎng)基的凝固狀態(tài)，從而影響到植株生根。因此，改用瓊脂粉代替植物凝膠，仍然只用iba激素，參照已有文獻(xiàn)，擴(kuò)大iba濃度至1mg/l，結(jié)果顯示，各種源均有不同比率的生根(如表3所示)，為12％-30％之間，但生根率很低。研究表明，較低濃度iba對(duì)植株有一定的誘導(dǎo)作用，因此，又以iba0.1mg/l、iba0.2mg/l和iba0.25mg/l三個(gè)濃度作為比較，在三種情況下，各種源均可以在莖段基部直接生根，且生根率較高，iba含量為0.25mg/l時(shí)生根率更高(表6)，且生根更早，5天左右即開(kāi)始生根，20天后各種源接種莖段生根率均接近100％，說(shuō)明使用iba0.25mg/l誘導(dǎo)生根效果更好，因此具有不同種源誘導(dǎo)生根普適性的培養(yǎng)基為：ms+蔗糖30g/l+瓊脂7.5g/l+iba0.25mg/l。本發(fā)明的有益效果：(1)現(xiàn)有技術(shù)中，研究都是針對(duì)特定種源的黑果枸杞種質(zhì)或某特定種，如大果黑果枸杞進(jìn)行無(wú)菌快繁培養(yǎng)基的篩選，因不同種源之間基因型差異較大，一種類(lèi)型的培養(yǎng)基可能并不一定適合所有來(lái)源及基因型的黑果枸杞；給黑果枸杞的組織培養(yǎng)生產(chǎn)帶來(lái)了不便，本發(fā)明選取不同種源地優(yōu)良種質(zhì)黑果枸杞種子經(jīng)無(wú)菌消毒后滅菌，獲得的不同種質(zhì)不同基因型無(wú)菌苗，利用其莖段進(jìn)行各階段培養(yǎng)基配方的篩選，更具有說(shuō)服力。(2)與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的目的不同，高效培養(yǎng)體系的建立過(guò)程也不同，本發(fā)明通過(guò)條件摸索，是利用莖段直接獲取叢生芽，最后誘導(dǎo)生根，高效快捷。(3)已有文獻(xiàn)信息顯示，黑果枸杞組織培養(yǎng)中普遍存在的玻璃化的現(xiàn)象并未得到很好的解決，這給實(shí)際生產(chǎn)帶來(lái)了困難。本發(fā)明得到的黑果枸杞組織培養(yǎng)快速繁殖大大降低了叢生芽的玻璃化概率，基本解決了玻璃化現(xiàn)象。(4)組織培養(yǎng)體系建立的過(guò)程中，激素的選擇起至關(guān)重要的作用。根據(jù)已經(jīng)發(fā)表的研究報(bào)告，發(fā)現(xiàn)黑果枸杞各階段培養(yǎng)基的篩選中，即使使用同一種激素得到激素的最適宜濃度不一樣，缺乏重復(fù)性。本發(fā)明綜合了這些研究結(jié)果，在深入研究的基礎(chǔ)上驗(yàn)證了部分結(jié)論，增強(qiáng)了其可靠性。(5)針對(duì)特定激素比如細(xì)胞分裂素zt，生長(zhǎng)素iaa，存在不耐高溫、易分解、不穩(wěn)定、配制培養(yǎng)基過(guò)程中，需要過(guò)濾滅菌的缺點(diǎn)，會(huì)給實(shí)際生產(chǎn)帶來(lái)不便的問(wèn)題。本發(fā)明選擇了幾種滅菌過(guò)程簡(jiǎn)單、使用方便，效果明顯的幾種植物激素。(6)本發(fā)明解決誘導(dǎo)生根過(guò)程中莖段僅僅基部只膨大或大部分膨大，影響正常生根的問(wèn)題。以上所述實(shí)施例的各技術(shù)特征可以任意組合，為使描述簡(jiǎn)潔，未對(duì)以上所述實(shí)施例的各技術(shù)特征所有可能的組合進(jìn)行描述，然而，只要這些技術(shù)特征的組合不矛盾，都應(yīng)該被認(rèn)為是本說(shuō)明書(shū)記載的范圍。當(dāng)前第1頁(yè)12