本發(fā)明屬于植物組織培養(yǎng)
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其涉及一種降低革葉衛(wèi)矛組培污染率的培養(yǎng)基及其方法。
背景技術(shù)：
：革葉衛(wèi)矛(EuonymuslecleriLévl.)灌木或小喬木，高1-7米，屬于衛(wèi)矛科衛(wèi)矛屬植物，是中國特有植物。分布于湖北、湖南、四川、貴州等地，生長于海拔1,300米至2,900米的地區(qū)，多生長于山地林蔭和溝邊。衛(wèi)矛屬植物在園林應(yīng)用中應(yīng)用較為普遍，多用于孤植、叢植及群植，是優(yōu)良的園林觀賞植物和綠化樹種。革葉衛(wèi)矛作為一種常綠樹種，耐蔭耐寒，抗逆性強(qiáng)，在北方地區(qū)具有很高的觀賞和應(yīng)用價值。隨著“南樹北引”的逐漸成熟，革葉衛(wèi)矛逐漸被廣泛應(yīng)用于園林景觀規(guī)劃中。植物組織培養(yǎng)技術(shù)作為現(xiàn)代生物技術(shù)的重要領(lǐng)域之一，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域和工廠化育苗方面應(yīng)用廣泛，對于植物優(yōu)良種質(zhì)資源保存、優(yōu)良品種的快速繁殖等方面也發(fā)揮著重要的作用。目前，革葉衛(wèi)矛的組培技術(shù)尚處在研究階段。在無菌培養(yǎng)中，由于種種原因使革葉衛(wèi)矛組培苗很容易受到污染，從而導(dǎo)致一些珍貴材料丟失，這無疑對于組培繁殖來說是致命的。而目前有關(guān)降低革葉衛(wèi)矛組培污染率的培養(yǎng)技術(shù)尚未有報道。因此，如何有效地減少污染對革葉衛(wèi)矛組培苗造成的損失，對于構(gòu)建革葉衛(wèi)矛植物組織培養(yǎng)快繁體系起到至關(guān)重要的作用。技術(shù)實現(xiàn)要素：有鑒于此，本發(fā)明提供一種降低革葉衛(wèi)矛組培污染率的培養(yǎng)基及其方法，該培養(yǎng)基能夠有效控制革葉衛(wèi)矛組培苗的污染率，同時保證較高的成活率。為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：本發(fā)明提供了一種降低革葉衛(wèi)矛組培污染率的培養(yǎng)基，為含有0.7-1.0mg/L6-BA、0.1-0.4mg/LNAA、50-80mg/L抱樸香桂精油、20～30g/L蔗糖和7～8g/L瓊脂的MS培養(yǎng)基，pH值為5.8～6.0。采用本發(fā)明提供的培養(yǎng)基配方可使得革葉衛(wèi)矛組培苗的污染率控制在10％以內(nèi)，同時保證成活率達(dá)95％以上，大大節(jié)省革葉衛(wèi)矛組培快繁生產(chǎn)成本，提高其組培快繁生產(chǎn)效率，適宜大規(guī)模應(yīng)用及推廣。優(yōu)選地，本發(fā)明提供的培養(yǎng)基為：含有1.0mg/L6-BA、0.1mg/LNAA、50mg/L、30g/L蔗糖和7g/L瓊脂的MS培養(yǎng)基，pH值為5.90。本發(fā)明還提供了一種降低革葉衛(wèi)矛組培污染率的方法，包括以下步驟：步驟1：將革葉衛(wèi)矛外植體接種到權(quán)利要求1或2所述的培養(yǎng)基上，獲得組培苗；步驟2：所述步驟1獲得的組培苗培養(yǎng)10～15d后，轉(zhuǎn)入含有0.7-1.0mg/L6-BA、0.1-0.4mg/LNAA、20～30g/L蔗糖和7～8g/L瓊脂的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。本發(fā)明首次針對減低革葉衛(wèi)矛的組培污染率的快繁技術(shù)進(jìn)行了研究，通過向培養(yǎng)基中添加適當(dāng)濃度的抱樸香桂精油，并結(jié)合雙誘導(dǎo)培養(yǎng)基法、外植體消毒、外植體前處理改良操作等，最終在保證組培苗成活率的前提下將組培苗污染率控制在10％以內(nèi)，同時保證成活率達(dá)95％以上，優(yōu)化了革葉衛(wèi)矛組培快繁體系的生產(chǎn)操作流程，大大降低了工廠化育苗的時間和成本。其中，雙誘導(dǎo)培養(yǎng)基法，是指采用兩種培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，首先，將革葉衛(wèi)矛外植體接種在含有0.7-1.0mg/L6-BA、0.1-0.4mg/LNAA、50-80mg/L、20～30g/L蔗糖和7～8g/L瓊脂的MS培養(yǎng)基，培養(yǎng)10d后，再轉(zhuǎn)入含有0.7-1.0mg/L6-BA、0.1-0.4mg/LNAA、20～30g/L蔗糖和7～8g/L瓊脂的MS培養(yǎng)基。作為優(yōu)選，步驟1所述外植體接種之前還包括外植體消毒，所述外植體消毒后再進(jìn)行前處理步驟。作為優(yōu)選，消毒具體為：取外植體采用流水沖洗30-40min，再用0.1％次氯酸鈉浸泡10min～15min。在本發(fā)明提供的實施例中，外植體的前處理為：取革葉衛(wèi)矛外植體→酒精浸泡30s→無菌水沖洗2次，每次2min→0.1％升汞浸泡8min→無菌水沖洗2次，每次2min→換杯→0.1％升汞浸泡8min→無菌水沖洗2次，每次2min→換杯→0.1％升汞浸泡8min→無菌水沖洗2min→換杯→無菌水沖洗3min→換杯→無菌水沖洗3min。優(yōu)選地，步驟1中的接種具體為：初次接種前酒精燈上烤兩把鑷子一把刀，一把鑷子處理外植體，一把鑷子用來接種；接種前，事先在酒精燈上烤另一把鑷子和刀，放置在培養(yǎng)皿上備用，待此盤接種完畢，再烤一把鑷子放置于培養(yǎng)皿上備用，并用事先高溫消毒的一把鑷子和刀處理下一盤外植體，以此類推，直到接種完畢。在本發(fā)明提供的實施例中，接種具體為：用蘸有75％酒精的脫脂棉將刀、鑷子和接種盤擦拭一遍，并在酒精燈上高溫烤一下，放置在接種盤上。待工具冷卻后，將處理好的燒杯中的外植體放入接種盤中，一次8-10個外植體，將外植體修剪成1～2cm小段。接入培養(yǎng)基前，用酒精脫脂棉再次擦拭鑷子，酒精燈上高溫烤過冷卻之后，接入事先準(zhǔn)備好的培養(yǎng)基中。在本發(fā)明中，選取帶腋芽的莖段、葉片或葉柄作為外植體。優(yōu)選地，外植體選自2～3年的實生苗健壯且無病蟲害的帶腋芽的莖段、葉片或葉柄。其中，外植體的采集為：選取2～3年生苗，采集當(dāng)年生健壯且無病蟲害的帶腋芽的莖段、葉片或葉柄作為組織培養(yǎng)的外植體，用加有洗滌劑的清水浸泡清洗，去除外植體上殘留的蟲卵、污漬等，轉(zhuǎn)入燒杯中，用潔凈紗布罩住杯口，在流水下沖洗30～50min。優(yōu)選地，本發(fā)明中，革葉衛(wèi)矛組織培養(yǎng)的培養(yǎng)溫度為24～26℃，光照時間為12～18h/d，光照強(qiáng)度為2500～3500lx，相對濕度為45％～50％。在本發(fā)明提供的實施例中，革葉衛(wèi)矛組織培養(yǎng)的培養(yǎng)溫度為25℃，光照時間為12h/d，光照強(qiáng)度為3500lx，相對濕度為48％。優(yōu)選地，革葉衛(wèi)矛組織培養(yǎng)的過程中還包括組培室滅菌步驟，所述組培室滅菌具體為：每天早上或者晚上開紫外燈殺菌30min，每周打開臭氧發(fā)生器，殺菌15min。相比傳統(tǒng)的培養(yǎng)方式，本發(fā)明通過向培養(yǎng)基中添加適當(dāng)濃度的抱樸香桂精油，并結(jié)合雙誘導(dǎo)培養(yǎng)基法、外植體消毒和外植體前處理改良操作等，最終使得革葉衛(wèi)矛組培苗的污染率控制在10％以內(nèi)，同時保證成活率達(dá)95％以上，大大節(jié)省革葉衛(wèi)矛組培快繁生產(chǎn)成本，提高其組培快繁生產(chǎn)效率，適宜大規(guī)模應(yīng)用及推廣。具體實施方式本發(fā)明公開了一種降低革葉衛(wèi)矛組培污染率的方法及培養(yǎng)基，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通過較佳實施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動或適當(dāng)變更與組合，來實現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。對所公開的實施例的說明，使本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員能夠?qū)崿F(xiàn)或使用本發(fā)明。對這些實施例的多種修改對本領(lǐng)域的專業(yè)技術(shù)人員來說將是顯而易見的，本文中所定義的一般原理可以在不脫離本發(fā)明的精神或范圍的情況下，在其它實施例中實現(xiàn)。因此，本發(fā)明將不會被限制于本文所示的這些實施例，而是要符合與本文所公開的原理和新穎特點相一致的最寬的范圍。本發(fā)明MS培養(yǎng)基(單位為mg/L)包含：大量元素：NH4NO31650，KNO31900，KH2PO41700，MgSO4·7H2O3700，CaCl2664.4；微量元素：KI83，MnSO4H2O1690，ZnSO4.7H2O860，H3BO3620，Na2MoO4.2H2O25，CuSO4.5H2O2.5CoCl2.6H2O2.5；鐵鹽：FeSO4.7H2O2780，Na2.EDTA3730；有機(jī)成分：肌醇2000，IVB煙酸10，VB610，VB12，甘氨酸40。所述培養(yǎng)基需經(jīng)過高壓滅菌鍋滅菌15-25min，高壓滅菌鍋工作溫度121℃，壓強(qiáng)115kPa。所述的6-BA為6-芐基嘌呤，所述NAA為萘乙酸，抱樸香桂精油是一種由河南紅楓種苗股份有限公司從樟科月桂屬植物抱樸香桂中提取得到的具有抑菌作用的精油。本發(fā)明提供的革葉衛(wèi)矛組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基及其方法中所用培養(yǎng)基組分均可由市場購得。下面結(jié)合實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明：實施例1革葉衛(wèi)矛的組織培養(yǎng)1.生長環(huán)境：組培室，光照時間12h/d，光照強(qiáng)度3500lx，培養(yǎng)溫度為25℃，相對濕度48％；每天早上或者晚上開紫外燈殺菌30min，每周打開臭氧發(fā)生器，殺菌15min。2.外植體的處理(1)選取2～3年的實生苗，當(dāng)年采集生長健康無病蟲害幼嫩帶芽的莖段、作為外植體。(2)采集完成后，用加有洗滌劑的清水浸泡清洗，去除外植體上殘留的蟲卵、污漬等，轉(zhuǎn)入燒杯中，用潔凈紗布罩住杯口。(3)先在流水下沖洗30～50min，然后用軟毛刷蘸取含有0.1％NaClO的溶液清洗外植體，對外植體進(jìn)行消毒。(4)消毒完成后，在超凈工作臺內(nèi)進(jìn)行接種前的前處理，依次進(jìn)行如下操作：用75％酒精浸泡30s→無菌水2次2min→0.1％升汞浸泡8min→無菌水沖洗2次2min→換杯(預(yù)先滅菌)→0.1％升汞浸泡8min→無菌水沖洗2次2min→換杯→0.1％升汞浸泡8min→無菌水沖洗2min→換杯→無菌水沖洗3min→換杯→無菌水沖洗3min。3.雙誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)(1)打開超凈工作臺紫外燈殺菌15min。(2)接種前用75％的酒精噴灑消毒。(3)在超凈工作臺內(nèi)，用蘸有75％酒精的脫脂棉將刀、鑷子和接種盤擦拭一遍，并在酒精燈上高溫烤一下，放置在接種盤上。待工具冷卻后，將處理好的燒杯中的外植體放入接種盤中，一次8-10個外植體。將外植體修剪成1～2cm。(4)用酒精脫脂棉再次擦拭鑷子，酒精燈上高溫烤過冷卻之后，將修建好的外植體接種到分裝好的含有1.0mg/L6-BA、0.1mg/LNAA、50mg/L抱樸香桂精油、30g/L蔗糖和7g/L瓊脂的MS培養(yǎng)基的培養(yǎng)基中，1瓶接種給一個。(5)將接種好的組培苗立即轉(zhuǎn)入上述培養(yǎng)條件的組培室的無菌組培架上進(jìn)行培養(yǎng)，進(jìn)出組培室更換干凈的白大褂和拖鞋。(6)培養(yǎng)10d后，將組培苗轉(zhuǎn)入含有1.0mg/L6-BA、0.1mg/LNAA、30g/L蔗糖和7～8g/L瓊脂的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)35d后，統(tǒng)計組培苗的誘導(dǎo)成活率和污染率。實施例2革葉衛(wèi)矛的組織培養(yǎng)1.生長環(huán)境：組培室，光照時間12h/d，光照強(qiáng)度3500lx，培養(yǎng)溫度為25℃，相對濕度48％；每天早上或者晚上開紫外燈殺菌30min，每周打開臭氧發(fā)生器，殺菌15min。2.外植體的處理(1)選取2～3年的實生苗，當(dāng)年采集生長健康無病蟲害幼嫩帶芽的莖段、作為外植體。(2)采集完成后，用加有洗滌劑的清水浸泡清洗，去除外植體上殘留的蟲卵、污漬等，轉(zhuǎn)入燒杯中，用潔凈紗布罩住杯口。(3)先在流水下沖洗30～50min，然后用軟毛刷蘸取含有0.1％NaClO的溶液清洗外植體，對外植體進(jìn)行消毒。(4)消毒完成后，在超凈工作臺內(nèi)進(jìn)行接種前的前處理，依次進(jìn)行如下操作：用75％酒精浸泡30s→無菌水2次2min→0.1％升汞浸泡8min→無菌水沖洗2次2min→換杯→0.1％升汞浸泡8min→無菌水沖洗2次2min→換杯→0.1％升汞浸泡8min→無菌水沖洗2min→換杯→無菌水沖洗3min→換杯→無菌水沖洗3min。3.雙誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)(1)打開超凈工作臺紫外燈殺菌15min。(2)接種前用75％的酒精噴灑消毒。(3)在超凈工作臺內(nèi)，用蘸有75％酒精的脫脂棉將刀、鑷子和接種盤擦拭一遍，并在酒精燈上高溫烤一下，放置在接種盤上。待工具冷卻后，將處理好的燒杯中的外植體放入接種盤中，一次8-10個外植體。將外植體修剪成1～2cm。(4)用酒精脫脂棉再次擦拭鑷子，酒精燈上高溫烤過冷卻之后，將修建好的外植體接種到分裝好的含有1.0mg/L6-BA、0.1mg/LNAA、60mg/L抱樸香桂精油、30g/L蔗糖和7g/L瓊脂的MS培養(yǎng)基中，1瓶接種給一個。(5)將接種好的組培苗立即轉(zhuǎn)入上述培養(yǎng)條件的組培室的無菌組培架上進(jìn)行培養(yǎng)，進(jìn)出組培室更換干凈的白大褂和拖鞋。(6)培養(yǎng)10d后，將組培苗轉(zhuǎn)入含有1.0mg/L6-BA、0.1mg/LNAA、25g/L蔗糖和8g/L瓊脂的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)35d后，統(tǒng)計組培苗的誘導(dǎo)成活率和污染率。實施例3革葉衛(wèi)矛的組織培養(yǎng)1.生長環(huán)境：組培室，光照時間12h/d，光照強(qiáng)度3500lx，培養(yǎng)溫度為25℃，相對濕度48％；每天早上或者晚上開紫外燈殺菌30min，每周打開臭氧發(fā)生器，殺菌15min。2.外植體的處理(1)選取2～3年的實生苗，當(dāng)年采集生長健康無病蟲害幼嫩帶芽的莖段、作為外植體。(2)采集完成后，用加有洗滌劑的清水浸泡清洗，去除外植體上殘留的蟲卵、污漬等，轉(zhuǎn)入燒杯中，用潔凈紗布罩住杯口。(3)先在流水下沖洗30～50min，然后用軟毛刷蘸取含有0.1％NaClO的溶液清洗外植體，對外植體進(jìn)行消毒。(4)消毒完成后，在超凈工作臺內(nèi)進(jìn)行接種前的前處理，依次進(jìn)行如下操作：用75％酒精浸泡30s→無菌水2次2min→0.1％升汞浸泡8min→無菌水沖洗2次2min→換杯→0.1％升汞浸泡8min→無菌水沖洗2次2min→換杯→0.1％升汞浸泡8min→無菌水沖洗2min→換杯→無菌水沖洗3min→換杯→無菌水沖洗3min。3.雙誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)(1)打開超凈工作臺紫外燈殺菌15min。(2)接種前用75％的酒精噴灑消毒。(3)在超凈工作臺內(nèi)，用蘸有75％酒精的脫脂棉將刀、鑷子和接種盤擦拭一遍，并在酒精燈上高溫烤一下，放置在接種盤上。待工具冷卻后，將處理好的燒杯中的外植體放入接種盤中，一次8-10個外植體。將外植體修剪成1～2cm。(4)用酒精脫脂棉再次擦拭鑷子，酒精燈上高溫烤過冷卻之后，將修建好的外植體接種到分裝好的含有0.8mg/L6-BA、0.2mg/LNAA、60mg/L抱樸香桂精油、30g/L蔗糖和7g/L瓊脂的MS培養(yǎng)基中，1瓶接種給一個。(5)將接種好的組培苗立即轉(zhuǎn)入上述培養(yǎng)條件的組培室的無菌組培架上進(jìn)行培養(yǎng)，進(jìn)出組培室更換干凈的白大褂和拖鞋。(6)培養(yǎng)10d后，將組培苗轉(zhuǎn)入含有0.8mg/L6-BA、0.2mg/LNAA、25g/L蔗糖和8g/L瓊脂的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)35d后，統(tǒng)計組培苗的誘導(dǎo)成活率和污染率。實施例4革葉衛(wèi)矛的組織培養(yǎng)1.生長環(huán)境：組培室，光照時間12h/d，光照強(qiáng)度3500lx，培養(yǎng)溫度為25℃，相對濕度48％；每天早上或者晚上開紫外燈殺菌30min，每周打開臭氧發(fā)生器，殺菌15min。2.外植體的處理(1)選取2～3年的實生苗，當(dāng)年采集生長健康無病蟲害幼嫩帶芽的莖段、作為外植體。(2)采集完成后，用加有洗滌劑的清水浸泡清洗，去除外植體上殘留的蟲卵、污漬等，轉(zhuǎn)入燒杯中，用潔凈紗布罩住杯口。(3)先在流水下沖洗30～50min，然后用軟毛刷蘸取含有0.1％NaClO的溶液清洗外植體，對外植體進(jìn)行消毒。(4)消毒完成后，在超凈工作臺內(nèi)進(jìn)行接種前的前處理，依次進(jìn)行如下操作：用75％酒精浸泡30s→無菌水2次2min→0.1％升汞浸泡8min→無菌水沖洗2次2min→換杯→0.1％升汞浸泡8min→無菌水沖洗2次2min→換杯→0.1％升汞浸泡8min→無菌水沖洗2min→換杯→無菌水沖洗3min→換杯→無菌水沖洗3min。3.雙誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)(1)打開超凈工作臺紫外燈殺菌15min。(2)接種前用75％的酒精噴灑消毒。(3)在超凈工作臺內(nèi)，用蘸有75％酒精的脫脂棉將刀、鑷子和接種盤擦拭一遍，并在酒精燈上高溫烤一下，放置在接種盤上。待工具冷卻后，將處理好的燒杯中的外植體放入接種盤中，一次8-10個外植體。將外植體修剪成1～2cm。(4)用酒精脫脂棉再次擦拭鑷子，酒精燈上高溫烤過冷卻之后，將修建好的外植體接種到分裝好的含有0.8mg/L6-BA、0.4mg/LNAA、50mg/L抱樸香桂精油、30g/L蔗糖和7g/L瓊脂的MS培養(yǎng)基中，1瓶接種給一個。(5)將接種好的組培苗立即轉(zhuǎn)入上述培養(yǎng)條件的組培室的無菌組培架上進(jìn)行培養(yǎng)，進(jìn)出組培室更換干凈的白大褂和拖鞋。(6)培養(yǎng)10d后，將組培苗轉(zhuǎn)入含有0.8mg/L6-BA、0.4mg/LNAA、25g/L蔗糖和8g/L瓊脂的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)35d后，統(tǒng)計組培苗的誘導(dǎo)成活率和污染率。實施例5革葉衛(wèi)矛組織培養(yǎng)方法對比試驗對照組1：外植體接種的培養(yǎng)基為含有1.0mg/L6-BA、0.1mg/LNAA、30g/L蔗糖和7～8g/L瓊脂的MS培養(yǎng)基，不添加抱樸香桂精油；同時，前處理采用如下操作：75％酒精浸泡30s→無菌水沖洗2次每次2min→0.1％升汞浸泡8min→無菌水沖洗5-6次。除此以外，其他培養(yǎng)條件與實施例1相同。對照組2：外植體接種的培養(yǎng)基為含有1.0mg/L6-BA、0.1mg/LNAA、30g/L蔗糖和7～8g/L瓊脂的MS培養(yǎng)基，不添加抱樸香桂精油，除此之外，其他培養(yǎng)條件與實施例1相同。對照組3：外植體接種的培養(yǎng)基為含有1.0mg/L6-BA、0.1mg/LNAA、200mg/LCef、30g/L蔗糖和7～8g/L瓊脂的MS培養(yǎng)基，除此之外，其他培養(yǎng)條件與實施例1相同。對照組4：外植體接種的培養(yǎng)基為含有1.0mg/L6-BA、0.1mg/LNAA、150mg/LCb、30g/L蔗糖和7～8g/L瓊脂的MS培養(yǎng)基，除此之外，其他培養(yǎng)條件與實施例1相同。分別統(tǒng)計實施例1～4、對照組1～4的培養(yǎng)方法獲得的組培苗的污染率和誘導(dǎo)成活率，結(jié)果如表1所示。表1革葉衛(wèi)矛污染率和誘導(dǎo)成活率的統(tǒng)計分析組別污染率(％)誘導(dǎo)成活率(％)實施例1896實施例21095實施例3995實施例41097對照組16954對照組24540對照組31530對照組41535以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。當(dāng)前第1頁1 2 3