本發(fā)明屬于植物繁殖技術(shù)領域，涉及青岡樹組織培養(yǎng)的快速繁殖方法。

背景技術(shù)：

青岡樹(Cyclobalanopsis glauca(Thunb.) Oerst. ),屬殼斗科櫟屬植物，為落葉或常綠喬木，五月開黃綠色花，花單性，雌雄同株，雄花柔荑花序，細長下垂。堅果卵形或橢圓形，生于杯狀殼斗中，十月成熟。葉子會隨天氣的變化而變化，所以還稱為“氣象樹”。為亞熱帶樹種，是我國分布最廣的樹種之一。朝鮮、日本、印度也有分布。中性喜光，幼齡稍耐側(cè)方庇蔭。喜生于微堿性或中性的石灰?guī)r土壤上，在酸性土壤上也生長良好。深根性直根系，耐干燥，可生長于多石礫的山地。萌芽力強，可采用萌芽更新。木材質(zhì)地堅硬耐腐，一般用來做鐵道枕木，也用來制造家具和器皿等。組織培養(yǎng)能通過無性繁殖，遺傳樹種的優(yōu)良特性，能在短時間內(nèi)快速繁殖獲得大量優(yōu)質(zhì)的組培苗，為優(yōu)質(zhì)種源推廣提供可能。青岡樹組織培養(yǎng)困難主要是因為外植體消毒困難，還有在初始芽誘導培養(yǎng)過程中，易褐化、初始芽發(fā)生率低、芽苗不伸長、活性差等瓶頸問題，嚴重限制了青岡樹優(yōu)良無性系的推廣與應用。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對青岡樹組織培養(yǎng)過程中芽增殖系數(shù)低，生長緩慢等問題,提供一種生長效果好、擴繁快的青岡樹嫩枝組培繁殖方法。

為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

青岡樹組織培養(yǎng)的快速繁殖方法，包括外植體選擇、外植體處理、初始芽誘導培養(yǎng)、增殖培養(yǎng)、壯芽培養(yǎng)和生根培養(yǎng)工序，采集半木質(zhì)化、生長健壯的當年生青岡樹嫩枝作為外植體，對外植體進行修剪、滅菌消毒處理后接種于初始芽誘導培養(yǎng)基中獲取初始芽，再將初始芽接種于增殖培養(yǎng)基中經(jīng)過3-4個周期增殖培養(yǎng)，形成叢生芽，將叢生芽接入壯芽培養(yǎng)基中培養(yǎng)，最后將高≥2cm的單芽插入生根培養(yǎng)基中誘導生根，具體操作步驟如下：

（1）外植體選擇：采集半木質(zhì)化、生長健壯的當年生青岡樹嫩枝作為外植體；

（2）外植體處理：將外植體置于自來水下沖洗10-15 min，然后去除外植體葉片，再將外植體浸泡在體積濃度 0.1%的升汞溶液中，控制浸泡時間15-20 min，最后用純凈水洗凈藥物，將外植體裁成帶至少1個腋芽，1.5-3cm長的莖段，視莖段木質(zhì)化程度分類置放容器內(nèi)，備用；

（3）初始芽誘導培養(yǎng)：將步驟（2）得到的外植體接種于初始芽誘導培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)30-35 d，初始芽萌發(fā)、生長；

（4）增殖培養(yǎng)：將高≥1cm的初始芽接入增殖培養(yǎng)基中進行增殖培養(yǎng)，35-40 d轉(zhuǎn)接一次，循環(huán)往復，經(jīng)3-4個周期的培養(yǎng)，形成叢生芽；

（5）壯芽培養(yǎng)：將步驟（4）得到的叢生芽進行切割，4-5顆芽/叢，插入壯芽培養(yǎng)基中，培養(yǎng)35-40 d，形成壯芽；

（6）生根培養(yǎng)：將步驟（5）得到的高≥2cm的單芽插入生根培養(yǎng)基中誘導生根；余下小芽叢再次接種于步驟（4）的增殖培養(yǎng)基中繼續(xù)增殖，然后再重復步驟（5），循環(huán)往復，獲得大量壯芽。

以上所述的初始芽誘導培養(yǎng)基的配方為：1/2改良WPM培養(yǎng)基+IBA 2.0-3.0 mg/L+6-BA 1.0-2.0 mg/L+ZT 1.5-2.0 mg/L+ VC 15 mg/L+葉酸10mg/L+VB₂ 15 mg/+瓊脂3.0 g/L+卡拉膠25 g/L。

以上所述的增殖培養(yǎng)基的配方為：改良WPM培養(yǎng)基+6-BA 6.0-8.0 mg/L+IBA 2.0-3.0 mg/L+ZT 0.5-1.0 mg/L+VC 15 mg/L+VB₂ 15 mg+L-半胱氨酸 20 mg/L+瓊脂 3.6 g/L+卡拉膠 30 g/L。

以上所述的壯芽培養(yǎng)基的配方為：改良WPM培養(yǎng)基+6-BA 3.0-4.0 mg/L+IBA 1.0-1.5 mg/L+VC 15 mg/L+VB₂ 15 mg+L-半胱氨酸 20 mg/L+瓊脂 3.5 g/L+卡拉膠 25 g/L。

以上所述的生根培養(yǎng)基的配方為：1/2改良WPM培養(yǎng)基+6-BA 1.5-2.5 mg/L+IBA 1.0-1.5 mg/L+瓊脂 3.5 g/L+卡拉膠 30 g/L。

以上所述改良WPM培養(yǎng)基的組分和體積重量比為：NH₄NO₃ 230mg/L，CaCl₂·2H₂O 76 mg/L，MgSO₄·7H₂0 340 mg/L，KH₂PO₄ 170 mg/L，Ca(NO₃)₂·4H₂O 180 mg/L，KI 0.83 mg/L，MnSO₄·H₂O 22.4 mg/L，ZnSO₄·7H₂O 8.6 mg/L，Na₂MoO₄·2H₂O 0.25 mg/L，CuSO₄·5H₂O 0.025 mg/L，Na₂·EDTA 37.4 mg/L，F(xiàn)eSO₄·7H₂O 25.2 mg/L，肌醇200 mg/L，煙酸0.5 mg/L，鹽酸吡哆醇0.5 mg/L，鹽酸硫胺素1.0 mg/L，甘氨酸2.0 mg/L。

以上步驟（3）所述的初始芽誘導培養(yǎng)的培育控制條件為：光培養(yǎng)、光照500-1000 lx，培養(yǎng)溫度20±1℃；步驟（4）所述的增殖培養(yǎng)、步驟（5）所述的壯芽培養(yǎng)、步驟（6）所述的生根培養(yǎng)的培育控制條件均為：光培養(yǎng)，光照2500-4000 lx，每日光照16 h，培養(yǎng)溫度25-28℃。

相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有的優(yōu)點和有益效果如下：

1、本發(fā)明以青岡樹當年生嫩枝作為外植體，經(jīng)過初始芽培養(yǎng)基培養(yǎng)，初始芽萌動率90%以上；經(jīng)過3-4個周期增殖培養(yǎng)，形成叢生芽，芽增殖系數(shù)5/30d-7/30d，再將叢生芽接入壯芽培養(yǎng)基中培養(yǎng)，最后將高≥2cm的單芽插入生根培養(yǎng)基中誘導生根，從而縮短了青岡樹的育苗周期，節(jié)省育苗材料，克服了傳統(tǒng)育苗方法中存在的育苗所需材料多、周期長等問題，大大降低了生產(chǎn)成本，提高了生產(chǎn)效率。

2、本發(fā)明將高≥2cm的單芽插入生根培養(yǎng)基中誘導生根，余下小芽叢繼續(xù)增殖培養(yǎng)，使得材料能夠多次繼代，實現(xiàn)大量增殖，規(guī)?；a(chǎn)壯芽，實現(xiàn)黃樟油素型樟樹的擴繁。

3、本發(fā)明對WPM基本培養(yǎng)基進行了改良，同時重點調(diào)整了與青岡樹出芽壯芽相關(guān)元素，使得培養(yǎng)基更科學，更有針對性，更易促使青岡樹芽誘導的發(fā)生、增殖和壯芽，效果顯著。

4、本發(fā)明操作過程簡便，培養(yǎng)周期短，繼代芽產(chǎn)量大,并且質(zhì)量優(yōu)，增殖系數(shù)達到5以上的組培苗產(chǎn)業(yè)化技術(shù)要求，具有很好的經(jīng)濟效益、生態(tài)效益和社會效益。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步說明。

實施例1：

（1）外植體選擇：采集半木質(zhì)化、生長健壯的當年生青岡樹嫩枝作為外植體；

（2）外植體處理：將外植體置于自來水下沖洗10 min，然后去除外植體葉片，再將外植體浸泡在體積濃度 0.1%的升汞溶液中，控制浸泡時間15 min，最后用純凈水洗凈藥物，將外植體裁成帶至少1個腋芽，1.5-3cm長的莖段，視莖段木質(zhì)化程度分類置放容器內(nèi)，備用；

（3）初始芽誘導培養(yǎng)：將步驟（2）得到的外植體接種于初始芽誘導培養(yǎng)基中培養(yǎng)，置于光培養(yǎng)、光照500 lx，培養(yǎng)溫度20±1℃的環(huán)境中培養(yǎng)30-35 d，初始芽萌發(fā)、生長；所述的初始芽誘導培養(yǎng)基的配方為：1/2改良WPM培養(yǎng)基+IBA 2.0 mg/L+6-BA 1.0 mg/L+ZT 1.5 mg/L+ VC 15 mg/L+葉酸10mg/L+VB₂ 15 mg/+瓊脂3.0 g/L+卡拉膠25 g/L；

（4）增殖培養(yǎng)：將高≥1cm的初始芽接入增殖培養(yǎng)基中進行增殖培養(yǎng)，置于光培養(yǎng)，光照2500 lx，每日光照16 h，培養(yǎng)溫度25-28℃的環(huán)境中，35-40 d轉(zhuǎn)接一次，循環(huán)往復，經(jīng)3-4個周期的培養(yǎng)，形成叢生芽；所述的增殖培養(yǎng)基的配方為：改良WPM培養(yǎng)基+6-BA 6.0 mg/L+IBA 2.0 mg/L+ZT 0.5 mg/L+VC 15 mg/L+VB₂ 15 mg+L-半胱氨酸 20 mg/L+瓊脂 3.6 g/L+卡拉膠 30 g/L；

（5）壯芽培養(yǎng)：將步驟（4）得到的叢生芽進行切割，4-5顆芽/叢，插入壯芽培養(yǎng)基中，置于光培養(yǎng)，光照2500 lx，每日光照16 h，培養(yǎng)溫度25-28℃的環(huán)境中培養(yǎng)35-40 d，形成壯芽；所述的壯芽培養(yǎng)基的配方為：改良WPM培養(yǎng)基+6-BA 3.0 mg/L+IBA 1.0 mg/L+VC 15 mg/L+VB₂ 15 mg+L-半胱氨酸 20 mg/L+瓊脂 3.5 g/L+卡拉膠 25 g/L；

（6）生根培養(yǎng)：將步驟（5）得到的高≥2cm的單芽插入生根培養(yǎng)基中，余下小芽叢再次接種于步驟（4）的增殖培養(yǎng)基中繼續(xù)增殖，然后再重復步驟（5），循環(huán)往復，獲得大量壯芽；生根培養(yǎng)是置于光培養(yǎng)，光照2500 lx，每日光照16 h，培養(yǎng)溫度25-28℃的環(huán)境中誘導生根，生根率為95%；所述的生根培養(yǎng)基的配方為：1/2改良WPM培養(yǎng)基+6-BA 1.5 mg/L+IBA 1.0 mg/L+瓊脂 3.5 g/L+卡拉膠 30 g/L。

以上所述改良WPM培養(yǎng)基的組分和體積重量比為：NH₄NO₃ 230mg/L，CaCl₂·2H₂O 76 mg/L，MgSO₄·7H₂0 340 mg/L，KH₂PO₄ 170 mg/L，Ca(NO₃)₂·4H₂O 180 mg/L，KI 0.83 mg/L，MnSO₄·H₂O 22.4 mg/L，ZnSO₄·7H₂O 8.6 mg/L，Na₂MoO₄·2H₂O 0.25 mg/L，CuSO₄·5H₂O 0.025 mg/L，Na₂·EDTA 37.4 mg/L，F(xiàn)eSO₄·7H₂O 25.2 mg/L，肌醇200 mg/L，煙酸0.5 mg/L，鹽酸吡哆醇0.5 mg/L，鹽酸硫胺素1.0 mg/L，甘氨酸2.0 mg/L。

實施例2：

（1）外植體選擇：采集半木質(zhì)化、生長健壯的當年生青岡樹嫩枝作為外植體；

（2）外植體處理：將外植體置于自來水下沖洗15 min，然后去除外植體葉片，再將外植體浸泡在體積濃度 0.1%的升汞溶液中，控制浸泡時間20 min，最后用純凈水洗凈藥物，將外植體裁成帶至少1個腋芽，1.5-3cm長的莖段，視莖段木質(zhì)化程度分類置放容器內(nèi)，備用；

（3）初始芽誘導培養(yǎng)：將步驟（2）得到的外植體接種于初始芽誘導培養(yǎng)基中培養(yǎng)，置于光培養(yǎng)、光照1000 lx，培養(yǎng)溫度20±1℃的環(huán)境中培養(yǎng)30-35 d，初始芽萌發(fā)、生長；所述的初始芽誘導培養(yǎng)基的配方為：1/2改良WPM培養(yǎng)基+IBA 3.0 mg/L+6-BA 1.5 mg/L+ZT 1.5 mg/L+ VC 15 mg/L+葉酸10mg/L+VB₂ 15 mg/+瓊脂3.0 g/L+卡拉膠25 g/L；

（4）增殖培養(yǎng)：將高≥1cm的初始芽接入增殖培養(yǎng)基中進行增殖培養(yǎng)，置于光培養(yǎng)，光照3000 lx，每日光照16 h，培養(yǎng)溫度25-28℃的環(huán)境中，35-40 d轉(zhuǎn)接一次，循環(huán)往復，經(jīng)3-4個周期的培養(yǎng)，形成叢生芽；所述的增殖培養(yǎng)基的配方為：改良WPM培養(yǎng)基+6-BA 7.0 mg/L+IBA 2.5 mg/L+ZT 1.0 mg/L+VC 15 mg/L+VB₂ 15 mg+L-半胱氨酸 20 mg/L+瓊脂 3.6 g/L+卡拉膠 30 g/L；

（5）壯芽培養(yǎng)：將步驟（4）得到的叢生芽進行切割，4-5顆芽/叢，插入壯芽培養(yǎng)基中，置于光培養(yǎng)，光照3000 lx，每日光照16 h，培養(yǎng)溫度25-28℃的環(huán)境中培養(yǎng)35-40 d，形成壯芽；所述的壯芽培養(yǎng)基的配方為：改良WPM培養(yǎng)基+6-BA 3.5 mg/L+IBA 1.0 mg/L+VC 15 mg/L+VB₂ 15 mg+L-半胱氨酸 20 mg/L+瓊脂 3.5 g/L+卡拉膠 25 g/L；

（6）生根培養(yǎng)：將步驟（5）得到的高≥2cm的單芽插入生根培養(yǎng)基中，余下小芽叢再次接種于步驟（4）的增殖培養(yǎng)基中繼續(xù)增殖，然后再重復步驟（5），循環(huán)往復，獲得大量壯芽；生根培養(yǎng)是置于光培養(yǎng)，光照3000 lx，每日光照16 h，培養(yǎng)溫度25-28℃的環(huán)境中誘導生根，生根率為91%；所述的生根培養(yǎng)基的配方為：1/2改良WPM培養(yǎng)基+6-BA 2.0 mg/L+IBA 1.5 mg/L+瓊脂 3.5 g/L+卡拉膠 30 g/L。

以上所述改良WPM培養(yǎng)基的組分和體積重量比為：NH₄NO₃ 230mg/L，CaCl₂·2H₂O 76 mg/L，MgSO₄·7H₂0 340 mg/L，KH₂PO₄ 170 mg/L，Ca(NO₃)₂·4H₂O 180 mg/L，KI 0.83 mg/L，MnSO₄·H₂O 22.4 mg/L，ZnSO₄·7H₂O 8.6 mg/L，Na₂MoO₄·2H₂O 0.25 mg/L，CuSO₄·5H₂O 0.025 mg/L，Na₂·EDTA 37.4 mg/L，F(xiàn)eSO₄·7H₂O 25.2 mg/L，肌醇200 mg/L，煙酸0.5 mg/L，鹽酸吡哆醇0.5 mg/L，鹽酸硫胺素1.0 mg/L，甘氨酸2.0 mg/L。

實施例3：

（1）外植體選擇：采集半木質(zhì)化、生長健壯的當年生青岡樹嫩枝作為外植體；

（2）外植體處理：將外植體置于自來水下沖洗15 min，然后去除外植體葉片，再將外植體浸泡在體積濃度 0.1%的升汞溶液中，控制浸泡時間20 min，最后用純凈水洗凈藥物，將外植體裁成帶至少1個腋芽，1.5-3cm長的莖段，視莖段木質(zhì)化程度分類置放容器內(nèi)，備用；

（3）初始芽誘導培養(yǎng)：將步驟（2）得到的外植體接種于初始芽誘導培養(yǎng)基中培養(yǎng)，置于光培養(yǎng)、光照1000 lx，培養(yǎng)溫度20±1℃的環(huán)境中培養(yǎng)30-35 d，初始芽萌發(fā)、生長；所述的初始芽誘導培養(yǎng)基的配方為：1/2改良WPM培養(yǎng)基+IBA 2.5 mg/L+6-BA 2.0 mg/L+ZT 2.0 mg/L+ VC 15 mg/L+葉酸10mg/L+VB₂ 15 mg/+瓊脂3.0 g/L+卡拉膠25 g/L；

（4）增殖培養(yǎng)：將高≥1cm的初始芽接入增殖培養(yǎng)基中進行增殖培養(yǎng)，置于光培養(yǎng)，光照4000 lx，每日光照16 h，培養(yǎng)溫度25-28℃的環(huán)境中，35-40 d轉(zhuǎn)接一次，循環(huán)往復，經(jīng)3-4個周期的培養(yǎng)，形成叢生芽；所述的增殖培養(yǎng)基的配方為：改良WPM培養(yǎng)基+6-BA 8.0 mg/L+IBA 3.0 mg/L+ZT 1.0 mg/L+VC 15 mg/L+VB₂ 15 mg+L-半胱氨酸 20 mg/L+瓊脂 3.6 g/L+卡拉膠 30 g/L；

（5）壯芽培養(yǎng)：將步驟（4）得到的叢生芽進行切割，4-5顆芽/叢，插入壯芽培養(yǎng)基中，置于光培養(yǎng)，光照4000 lx，每日光照16 h，培養(yǎng)溫度25-28℃的環(huán)境中培養(yǎng)35-40 d，形成壯芽；所述的壯芽培養(yǎng)基的配方為：改良WPM培養(yǎng)基+6-BA 4.0 mg/L+IBA 1.5 mg/L+VC 15 mg/L+VB₂ 15 mg+L-半胱氨酸 20 mg/L+瓊脂 3.5 g/L+卡拉膠 25 g/L；

（6）生根培養(yǎng)：將步驟（5）得到的高≥2cm的單芽插入生根培養(yǎng)基中，余下小芽叢再次接種于步驟（4）的增殖培養(yǎng)基中繼續(xù)增殖，然后再重復步驟（5），循環(huán)往復，獲得大量壯芽；生根培養(yǎng)是置于光培養(yǎng)，光照4000 lx，每日光照16 h，培養(yǎng)溫度25-28℃的環(huán)境中誘導生根，生根率為96%；；所述的生根培養(yǎng)基的配方為：1/2改良WPM培養(yǎng)基+6-BA 2.5 mg/L+IBA 1.5 mg/L+瓊脂 3.5 g/L+卡拉膠 30 g/L。

以上所述改良WPM培養(yǎng)基的組分和體積重量比為：NH₄NO₃ 230mg/L，CaCl₂·2H₂O 76 mg/L，MgSO₄·7H₂0 340 mg/L，KH₂PO₄ 170 mg/L，Ca(NO₃)₂·4H₂O 180 mg/L，KI 0.83 mg/L，MnSO₄·H₂O 22.4 mg/L，ZnSO₄·7H₂O 8.6 mg/L，Na₂MoO₄·2H₂O 0.25 mg/L，CuSO₄·5H₂O 0.025 mg/L，Na₂·EDTA 37.4 mg/L，F(xiàn)eSO₄·7H₂O 25.2 mg/L，肌醇200 mg/L，煙酸0.5 mg/L，鹽酸吡哆醇0.5 mg/L，鹽酸硫胺素1.0 mg/L，甘氨酸2.0 mg/L。