本發(fā)明涉及一種木霉菌·蕓苔素內(nèi)酯可濕性粉劑及其制備方法和應用，特別是涉及一種生防型木霉菌可濕性粉劑制備方法及其在番茄灰霉病防治中的應用。
背景技術(shù)：
：木霉菌(Trichoderma)作為生物防治中極為重要的生防真菌，由于具有多種拮抗機制，對鐮刀菌、灰霉病菌、立枯絲核菌等多種病原真菌均有很好的抑制效果，不僅如此，木霉菌可以系統(tǒng)誘導植物的防御反應，從而提高植物的抗病能力。然而，木霉菌在應用中存在兩個問題需要解決：木霉菌有時會產(chǎn)生一些抑制性物質(zhì)抑制種子萌發(fā)，因此利用植物源激素的促生功能可解決這一難題。另一方面，在木霉菌生物制劑中，多是利用其活孢子對植物進行生物防控。木霉菌孢子制劑中大部分應用的是分生孢子。但分生孢子受環(huán)境條件影響較大，壽命較短，生活力弱，不易長期保存。厚垣孢子雖然細胞壁厚，對環(huán)境要求不高，壽命較長，但產(chǎn)生條件相對嚴格，不易獲得。除此之外，孢子制劑在貨架期方面仍然存在諸多不足。如何提高木霉菌孢子制劑的貨架期也是近年來研究的主要問題。天然蕓苔素內(nèi)酯，也稱油菜素內(nèi)酯(Brassinolide,簡寫為BRs)，是一類甾醇類植物激素，是目前國際上公認的活性最佳、最廣譜的一類植物生長激素。我國中科院上海植物生理研究所利用蕓苔素內(nèi)酯對小麥、玉米、西瓜、黃瓜、烤煙、葡萄、水稻等作物進行增產(chǎn)試驗。結(jié)果表明，濃度為0.01～0.1ppm的蕓苔素內(nèi)酯類激素，可使小麥增產(chǎn)10％，玉米增產(chǎn)9.8％～18.4％，西瓜增產(chǎn)20％。蕓苔素內(nèi)酯不但對多種農(nóng)作物有促生和增產(chǎn)的作用，在植物抗病抗逆性方面也同樣起到不可或缺的作用。農(nóng)作物經(jīng)常遭受惡劣干旱氣候的威脅，這種高溫干旱天氣會使植物細胞膜結(jié)構(gòu)受到損害、削弱光合作用能力、使其生長受到抑制。BRs可通過改善植物的滲透調(diào)節(jié)、提高植物體內(nèi)多種保護酶如過氧化物酶(POD)、超氧化物氣化酶(SOD)等酶的活性來增強植物的抗逆能力。但蕓苔素內(nèi)酯單獨使用幾乎無抑制病菌的功能，因此通過與生防木霉菌混配可能提高其防病效果，彌補這一不足。目前，利用木霉菌進行生物防治的效果已經(jīng)獲得國內(nèi)外肯定，木霉菌與其他化學農(nóng)藥復配也已經(jīng)有很廣泛的研究。但這些復配制劑在應用時仍存在諸多問題：一、木霉菌復配制劑的防效仍不及化學殺菌劑的防治效果，多種化學殺菌劑對木霉菌本身的生長具有抑制作用，間接影響木霉菌的生防效果。田間應用時，木霉菌的穩(wěn)定性較差，活性物質(zhì)易受環(huán)境影響。二、木霉菌與化學農(nóng)藥的復配仍對環(huán)境有一定污染，并沒有達到生物防治無污染的目的。三、國內(nèi)市場上所生產(chǎn)的木霉菌可濕性粉劑在溶于水后仍殘留部分沉淀，懸浮率較低。技術(shù)實現(xiàn)要素：針對生防木霉菌和蕓苔素內(nèi)酯各自不足和互補優(yōu)勢，本發(fā)明提供了一種木霉菌·蕓苔素內(nèi)酯可濕性粉劑及其制備方法和應用，有效用于番茄灰霉病的防治。本發(fā)明是從大量的木霉菌資源中篩選獲得的拮抗木霉菌株，對番茄灰霉病具有很好的抑制作用。同時，將天然蕓苔素內(nèi)酯與木霉菌聯(lián)用，發(fā)揮各自優(yōu)勢作用的同時，對番茄灰霉病的防治具有協(xié)同增效作用。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的：第一方面，本發(fā)明提供了一種木霉菌·蕓苔素內(nèi)酯可濕性粉劑，包括木霉菌孢子菌絲勻漿、蕓苔素內(nèi)酯、食品級羥基淀粉醚混合得到的粉末，其中，所述粉末中木霉菌孢子菌絲勻漿與食品級羥基淀粉醚的質(zhì)量比為2:1；所述可濕性粉劑還包括糊精、木質(zhì)素磺酸鈉、分散劑NNO、甲基纖維素、羧甲基纖維素、殼聚糖，上述各組分的質(zhì)量分別為所述木霉菌孢子菌絲勻漿、蕓苔素內(nèi)酯、食品級羥基淀粉醚混合得到的粉末質(zhì)量的8.0-10.0％、4.0-6.0％、4.0-6.0％、9.5-11.0％、4.0-6.0％、3％。優(yōu)選地，所述蕓苔素內(nèi)酯的加入量為：每500g木霉菌孢子菌絲勻漿中加入800mL0.1％蕓苔素內(nèi)酯稀釋10倍液。優(yōu)選地，所述可濕性粉劑中，木霉菌的濃度為7.5-8.0×108個/g。優(yōu)選地，所述木霉菌為深綠木霉菌CGMCCNo.6479(該菌株見中國發(fā)明專利文獻CN103484377A中的記載)。優(yōu)選地，所述木霉菌孢子菌絲勻漿的制備方法如下：以0.5％的接種量將一級菌種接種于優(yōu)化后的木霉菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)7天后，30Hz高速離心機離心5min，即得木霉菌孢子菌絲勻漿。優(yōu)選地，所述一級菌種是通過將木霉菌菌餅以3-5片/三角瓶的接種量于PD培養(yǎng)基中、180r/min、28℃條件下培養(yǎng)4d獲得。優(yōu)選地，所述優(yōu)化后的木霉菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基組成包括：玉米粉5.0g，葡萄糖2.0g，大豆蛋白胨2.0g，K2HPO41.0g，F(xiàn)eSO40.01g，MgSO40.5g，KCl0.5g；培養(yǎng)基的裝液量為100mL/250mL。優(yōu)選地，所述發(fā)酵培養(yǎng)的條件為：溫度28.33℃，PH＝6.28，轉(zhuǎn)速183.72r/min。第二方面，本發(fā)明提供了一種木霉菌·蕓苔素內(nèi)酯可濕性粉劑的制備方法，所述方法包括以下步驟：將木霉菌孢子菌絲勻漿、蕓苔素內(nèi)酯、食品級羥基淀粉醚混合得到的粉末與糊精、木質(zhì)素磺酸鈉、分散劑NNO、甲基纖維素、羧甲基纖維素、殼聚糖按比例混合均勻后，進行干燥，即得所述可濕性粉劑。第三方面，本發(fā)明提供了一種木霉菌·蕓苔素內(nèi)酯可濕性粉劑作為生防制劑在防治番茄灰霉病中的應用。第四方面，本發(fā)明提供了一種木霉菌·蕓苔素內(nèi)酯可濕性粉劑在防治番茄灰霉病中的使用方法，所述使用方法具體為：將所述可濕性粉劑溶解在水中形成混合溶液，葉面噴施即可；所述混合溶液中可濕性粉劑的濃度為2g/L。本發(fā)明經(jīng)過木霉菌初篩，復篩純化后保存于凍存管中。在上述優(yōu)化培養(yǎng)基中進行液體發(fā)酵使其產(chǎn)生木霉菌孢子發(fā)酵液，將含有大量孢子的發(fā)酵液裝入30Hz高速離心機中離心5min，與蕓苔素內(nèi)酯、蕓苔素內(nèi)酯、食品級羥基淀粉醚、糊精、木質(zhì)素磺酸鈉、分散劑NNO、甲基纖維素、羧甲基纖維素、殼聚糖；按照最佳配比混合制成木霉菌·蕓苔素內(nèi)酯可濕性粉劑，將所述可濕性粉劑(10g/5L)溶解在水中，在溫室與田間葉面噴施。與對照相比，防治番茄灰霉病效果顯著，平均達70％以上。本發(fā)明的可濕性粉劑具有配制方便，包衣容易，高效低毒，對環(huán)境相對安全，對番茄灰霉病具有良好的防效。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下的有益效果：1、該木霉菌·蕓苔素內(nèi)酯可濕性粉劑中不僅含有大量木霉菌孢子和菌絲體，同時還有蕓苔素內(nèi)酯天然植物激素。研究表明，木霉菌孢子發(fā)酵液有抑制多種病原菌的功能。而本發(fā)明采用的深綠木霉菌CGMCCNo.6479，經(jīng)過反復試驗得出，其對番茄灰霉病的防治具有明顯的效果。蕓苔素內(nèi)酯，作為一種新型植物生長調(diào)節(jié)劑，可在植物的各個階段起到調(diào)控作用。不但可以促進細胞的伸長和分裂，促進光合作用，提高作物抗高溫、抗干旱等抗逆性；幼苗期促進根的伸長、營養(yǎng)期促進莖葉的生長、生殖期促進果實成熟。蕓苔素內(nèi)酯能夠有利于植物過氧化氫CAT、超氧化物酶SOD、過氧化物酶POD活性的提高，增強細胞自我保護功能。2、該木霉菌·蕓苔素內(nèi)酯可濕性粉劑是由專門針對番茄灰霉病具有很好防治效果的深綠木霉菌及天然植物生長調(diào)節(jié)劑蕓苔素內(nèi)酯優(yōu)化組配而成，功能上優(yōu)勢互補；二者不僅在防治灰霉病的機制上具有協(xié)同增效作用，同時對植物的生長指標有顯著的促進作用，對種子的萌發(fā)及發(fā)芽勢具有顯著促進作用。3、該木霉菌·蕓苔素內(nèi)酯可濕性粉劑的載體選用的是可溶于水且對木霉菌及蕓苔素內(nèi)酯本身無影響的食品級羥基淀粉醚，消除了傳統(tǒng)可濕性粉劑中使用高嶺土、硅藻土等惰性等不溶于水的載體；同時在分別優(yōu)化保護劑、潤濕劑、穩(wěn)定劑的種類及量的前提下，加入了崩解劑甲基纖維素，大大加快了粉劑浸入水中后的分散與潤濕速率。4、該木霉菌·蕓苔素內(nèi)酯可濕性粉劑中加入了殼聚糖與海藻酸鈉，使常溫下貨架期時長提高45.4％；對可濕性粉劑的常溫儲存具有顯著的意義。5、將本發(fā)明提供的木霉菌·蕓苔素內(nèi)酯可濕性粉劑按照一定比例要求對番茄進行噴施，對土壤無污染。在上海交通大學溫室、七寶農(nóng)場進行試驗，此可濕性粉劑對番茄灰霉病的防效均能達到70％以上。6、將本發(fā)明提供的木霉菌·蕓苔素內(nèi)酯可濕性粉劑按照一定比例要求對番茄進行噴施，與國內(nèi)外同類可濕性粉劑及化學殺菌劑嘧霉胺進行防效對比，木霉菌·蕓苔素內(nèi)酯可濕性粉劑的防效與化學殺菌劑嘧霉胺防效相當，分別為75％、73％；遠高于其他可濕性粉劑。7、本發(fā)明適用于大多數(shù)具有良好生防效果的木霉菌菌株，制作方法簡單，成本低，適合于不同規(guī)模生產(chǎn)，市場前景廣闊。附圖說明通過閱讀參照以下附圖對非限制性實施例所作的詳細描述，本發(fā)明的其它特征、目的和優(yōu)點將會變得更明顯：圖1為不同藥劑處理對番茄盆栽防治效果；圖2不同藥劑對番茄果實灰霉病的防治效果；圖3為采用不同載體制備的木霉菌·蕓苔素內(nèi)酯可濕性粉劑沉淀情況對比；圖4為本發(fā)明制備的可濕性粉劑貨架期測定結(jié)果。具體實施方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行詳細說明。以下實施例將有助于本領域的技術(shù)人員進一步理解本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。應當指出的是，對本領域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變化和改進。這些都屬于本發(fā)明的保護范圍。實施例1本實施例提供了一種木霉菌·蕓苔素內(nèi)酯可濕性粉劑的制備方法，具體步驟如下：1、平板菌種活化：將深綠木霉菌CGMCCNo.6479接種于PDA培養(yǎng)皿中，28℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)4-5天；然后將番茄灰霉菌接種于PDA培養(yǎng)皿中，25℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)7天，光照黑暗交替處理。所述PDA培養(yǎng)基為：200g馬鈴薯蒸煮后過濾的上層汁液，20g葡萄糖，20g瓊脂粉，純凈水定容至1L，每250mL分裝至500mL三角瓶，121℃高壓滅菌25min。2、一級菌種的制備：先制備PD培養(yǎng)基：200g馬鈴薯，20g葡萄糖，純凈水1L，每250mL分裝至500mL三角瓶，121℃高壓滅菌25min。然后在PD培養(yǎng)基中接入步驟1活化后的平板菌種，置于180r/min、28℃搖床中搖瓶培養(yǎng)5天，得到深綠木霉菌CGMCCNo.6479液體發(fā)酵菌種，即一級菌種。3、木霉菌液體發(fā)酵：玉米粉含量為10kg，葡萄糖為4kg，大豆蛋白胨為4kg，磷酸氫二鉀2kg，硫酸亞鐵10g，硫酸鎂100g，氯化鉀100g，水補足至200L，裝入300L發(fā)酵罐。培養(yǎng)基初始pH調(diào)節(jié)為6.2-6.5,121℃下高溫滅菌40-60min。接入重量比為0.5％的深綠木霉菌CGMCCNo.6479液體發(fā)酵菌種，發(fā)酵溫度為28.33℃，PH＝6.28，轉(zhuǎn)速183.72r/min，發(fā)酵時間7天，即得深綠木霉菌孢子發(fā)酵液。4、木霉菌·蕓苔素內(nèi)酯可濕性粉劑的制備：將深綠木霉菌發(fā)酵液用30Hz高速離心機離心5min，得木霉菌孢子菌絲勻漿。向500g木霉菌孢子菌絲勻漿中加入0.1％蕓苔素內(nèi)酯稀釋10倍液800mL，制得初步混合勻漿。向上述混合勻漿中加入250g食品級羥基淀粉醚，不足則用吸水性較強且沉淀較少的白炭黑補足，手動研磨成細度均勻的粉末。稱取上述細度均勻的粉末500g，分別加50g糊精、25g木質(zhì)素磺酸鈉、25g分散劑NNO、50g甲基纖維素、25g羧甲基纖維素、15g殼聚糖；混合均勻。通過活性孢子粉專用干燥機中，氣流作用吹成細度勻稱的干燥粉末狀，制成可濕性粉劑。效果驗證：1)木霉菌·蕓苔素內(nèi)酯可濕性粉劑對盆栽番茄的防病效果以實施例1方法制得的木霉菌·蕓苔素內(nèi)酯可濕性粉劑為樣品1、牛博士可濕性粉劑為對照樣品2、哈茨木霉可濕性粉劑為對照樣品3、殺菌劑嘧霉胺為對照樣品4、CK(不采用任何藥劑處理)為樣品5，對盆栽番茄的防病效果進行考察。由表1、圖1可知，盆栽試驗中，接種灰霉病的植株發(fā)病率為71.6％，四種藥劑處理中，牛博士木霉菌可濕性粉劑處理的植株發(fā)病率相對較高，為40.1％。由防效可知，化學藥劑嘧霉胺的防效最好，為74.7％；深綠木霉·蕓苔素內(nèi)酯復合型可濕性粉劑與哈茨木霉菌可濕性粉劑防效差異不顯著，分別為71.2％，71.5％；而牛博士木霉菌可濕性粉劑防效僅為61.2％，與其他三組差異均顯著(p<0.05)，效果相對較差。表1不同藥劑處理對番茄盆栽防效的影響2)木霉菌·蕓苔素內(nèi)酯可濕性粉劑對番茄果實的防病效果以實施例1方法制得的木霉菌·蕓苔素內(nèi)酯可濕性粉劑為樣品1、牛博士可濕性粉劑為對照樣品2、哈茨木霉可濕性粉劑為對照樣品3、殺菌劑嘧霉胺為對照樣品4、CK(不采用任何藥劑處理)為樣品5，對番茄果實的防病效果進行考察。由表2、圖2可知，四種不同藥劑處理番茄果實后，對番茄果實防效不同?；瘜W殺菌劑嘧霉胺對果實的防效最好，為61.3％；深綠木霉·蕓苔素內(nèi)酯復合型可濕性粉劑與哈茨木霉菌可濕性粉劑防效分別為58.1％，52.6％；差異不顯著(p<0.05)。牛博士木霉菌可濕性粉劑對果實的防效為47.4％。與其他三組差異均顯著，效果相對較差。表2不同藥劑處理對番茄果實灰霉病的防效處理病情指數(shù)防效(％)117.758.1Aa222.247.4Bb320.052.6Ab416.361.3Aa542.2—3)田間試驗番茄的灰霉病防效以實施例1方法制得的木霉菌·蕓苔素內(nèi)酯可濕性粉劑為樣品1和11(其中樣品1為木霉菌·蕓苔素內(nèi)酯可濕性粉劑按照10g/5L噴施，樣品11為木霉菌·蕓苔素內(nèi)酯可濕性粉劑按照5g/5L噴施)、牛博士可濕性粉劑為對照樣品2、哈茨木霉可濕性粉劑為對照樣品3、殺菌劑嘧霉胺為對照樣品4、CK(不采用任何藥劑處理)為樣品5，對田間試驗番茄的灰霉病防效進行考察。由表3可知，深綠木霉菌·蕓苔素內(nèi)酯復合型可濕性粉劑按照5g/5L噴施與哈茨木霉菌可濕性粉劑按照10g/5L噴施防效分別為67.3％、61.5％。二者差異不顯著，前者防效略高于后者；而深綠木霉·蕓苔素內(nèi)酯復合型可濕性粉劑按照10g/5L稀釋噴施，防效為75％，與化學殺菌劑嘧霉胺防效差異不顯著，分別為75.0％、73.0％，且遠高于其他藥劑處理。牛博士木霉菌可濕性粉劑防效僅為57.6％，與其它處理組均差異顯著。表3田間藥劑防效調(diào)查處理發(fā)病率(％)病情指數(shù)防效(％)112.31375.0Aa214.32257.6Cc312.82061.5Bb47.51473.0Aa1112.41767.3Bb533.552—4)對本實施例制備的可濕性粉劑進行貨架期的測定本實施例制備的可濕性粉劑中最初含孢量為7.63×108CFU/g，以不加殼聚糖制備的粉劑進行對照。結(jié)果表明，殼聚糖在可濕性粉劑中不僅可以對病原菌有抑制作用，作為一種糖類物質(zhì)，保護劑的一種，為粉劑中的木霉菌孢子提供持續(xù)營養(yǎng)成分，使其貨架期延長，4個月后，孢子量可達1.35×108CFU/g，見圖4。實施例2本實施例考察了本發(fā)明的可濕性粉劑的兩種有效組分的不同濃度配比對番茄灰霉病的防治效果，如表4和表5所示。表4的結(jié)果表明，當木霉菌孢子濃度為108CFU/g，0.1％蕓苔素內(nèi)酯稀釋10倍時，二者共同對灰霉病菌菌絲生長的抑制效果最好，抑菌率可達到73.6％，抑菌率均高于其它處理組。進一步地，表5的研究結(jié)果表明，木霉菌孢子濃度在7.5-8.0×108個/g，0.1％10倍液(濃度為0.01％)的每克木霉菌孢子粉末中加入0.1％蕓苔素內(nèi)酯的稀釋10倍液(濃度為0.01％)的蕓苔素內(nèi)酯1-3mL，二者共同對番茄灰霉病菌有較明顯的抑制作用，防效達到74.84％，與其他配比組分相比較，差異顯著。表4不同濃度木霉菌與蕓苔素內(nèi)酯復配對灰霉菌生長的影響表5不同配比含量復配對番茄植株灰霉病的抑菌效果同時，本實施例還考察了本發(fā)明中不同木霉菌孢子含量與蕓苔素內(nèi)酯含量配比對番茄植株的促生長作用。由表6可知，木霉菌孢子濃度在7.5-8.0×108個/g，蕓苔素內(nèi)酯濃度為0.01％且每克木霉菌孢子粉末中加入1.0-3.0mL時，對番茄植株的株高、根長及鮮重均有明顯的促進效果，與其他配比的促生效果相比，差異顯著；與單獨處理及空白對照相比，差異極顯著。說明在此濃度配比范圍內(nèi)，可濕性粉劑的促生效果最好。表6不同配比復配對番茄植株生理指標的影響通過優(yōu)化可濕性粉劑助劑配方，用食品級羥基淀粉醚作為此粉劑的載體，消除了傳統(tǒng)惰性載體沉淀量極大的問題；由圖3可知，與其他載體相比，食品級羥基淀粉醚的沉淀量最少，為11.48％，差異顯著。在此基礎上，通過優(yōu)化分散劑、潤濕劑、懸浮劑的組分含量，極大提高了可濕性粉劑的懸浮率及潤濕時間。由表7可知，在木質(zhì)素磺酸鈉、NNO、甲基纖維素分別為4％，5％，10％的配比下，可濕性粉劑的懸浮率最高，為77.26％，且此時的潤濕時間最短為21s。由表8可知，在10％糊精的保護作用下，木霉菌在紫外照射下，生長活性提高68.9％，在紫外照射120min后，木霉菌菌絲直徑與無保護劑處理的菌絲直徑相比，差異極顯著。表7不同助劑配比對可濕性粉劑懸浮率及潤濕時間的影響表8保護劑對可濕性粉劑中木霉菌活性的保護作用以上對本發(fā)明的具體實施例進行了描述。需要理解的是，本發(fā)明并不局限于上述特定實施方式，本領域技術(shù)人員可以在權(quán)利要求的范圍內(nèi)做出各種變化或修改，這并不影響本發(fā)明的實質(zhì)內(nèi)容。在不沖突的情況下，本申請的實施例和實施例中的特征可以任意相互組合。當前第1頁1 2 3