亞麻酸?；掖及返穆?lián)合醫(yī)用和保健用藥物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了天然蕓苔素內(nèi)酯類似物和亞麻酸酰基乙醇胺在制備用于預(yù)防或治療哺乳動物（尤其是雄性哺乳動物）疾病的藥物中的應(yīng)用，或者在制備用于保健哺乳動物的保健品中的應(yīng)用。另外，本發(fā)明還提供了相應(yīng)的藥物或保健品組合物及其制備方法。
【專利說明】亞麻酸?；掖及返穆?lián)合醫(yī)用和保健用藥物
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明是中國專利第201310086548.8號的繼續(xù)申請，屬于用于哺乳動物(如，人)的醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】，具體而言，本發(fā)明涉及天然蕓苔素內(nèi)酯類似物和亞麻酸?；掖及返穆?lián)用及其哺乳動物用藥物組合物，用于制備治療或預(yù)防哺乳動物疾病的藥物中。
[0002]
【背景技術(shù)】
[0003]蕓苔素內(nèi)酯被稱為世界第六大類植物激素，是用于植物的生長調(diào)節(jié)劑。其中，化學(xué)合成的蕓苔素內(nèi)酯，如中國專利申請CN1217337A、CN1217338A等所述的，雖然產(chǎn)品較為均一，但是種類少，主要是28-表聞蕓苔素內(nèi)酯。
[0004]從植物(如，花粉)或其他天然來源(如，蜂蠟)中提取的蕓苔素內(nèi)酯，其通常是含有多種蕓苔素內(nèi)酯結(jié)構(gòu)類似物的混合物，容易產(chǎn)生產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定的情況，即使對于用于植物的生長調(diào)節(jié)劑這樣對穩(wěn)定性較為寬容的項(xiàng)目來說，也比較難獲得穩(wěn)定的效果，更無法用于要求更高的項(xiàng)目(如用于哺乳動物身體)；如果進(jìn)一步提純，則制備成本上升較大，不利于產(chǎn)業(yè)化實(shí)施，因而阻礙了人們進(jìn)一步大量純化，并阻礙了人們?nèi)パ芯科渲懈魇|苔素內(nèi)酯類似物是否具有蕓苔素內(nèi)酯的活性，更無法想象出對哺乳動物的藥物應(yīng)用。
[0005]本發(fā)明人通過長期而艱苦的努力，摸索出了從植物中提取(純化)蕓苔素內(nèi)酯類似物的穩(wěn)定流程，精心研究了其中的各種提取溶劑，盡管其中需要一定的提純過程，但是只需要一次提取過程，最終可以收集到多種分離的高純度的天然蕓苔素內(nèi)酯類似物，因而攤薄了提純的成本，有利于產(chǎn)業(yè)化推廣實(shí)施；這些分離的天然蕓苔素內(nèi)酯類似物可以單獨(dú)使用，也可以配比混和使用，因而產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定而容易控制。令人意想不到的是，在獲得了大量分離的高純度的天然蕓苔素內(nèi)酯類似物的基礎(chǔ)上，本發(fā)明人偶然發(fā)現(xiàn)，這些天然蕓苔素內(nèi)酯類似物中的一些，能夠用于作為哺乳動`物用藥物或保健品，例如用于預(yù)防或治療雄性哺乳動物前列腺增生疾病，或用于改善雄性哺乳動物前列腺增生狀況。
[0006]更令人意想不到的是，本發(fā)明人從浩如煙海的現(xiàn)有化合物中，偶然發(fā)現(xiàn)，天然蕓苔素內(nèi)酯能夠與亞麻酸酰基乙醇胺協(xié)同起效，從而能夠更好地用于預(yù)防或治療雄性哺乳動物前列腺增生疾病，或用于改善雄性哺乳動物前列腺增生狀況。
[0007]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于提供了新的藥物或保健品的應(yīng)用，能用于哺乳動物(如，人)的治療、預(yù)防或改善。另外，本發(fā)明還提供了配比穩(wěn)定的藥物組合物或保健品，以及制備它們的方法。
[0009]具體而言，在第一方面，本發(fā)明提供了天然蕓苔素內(nèi)酯類似物和亞麻酸?；掖及仿?lián)合在制備用于預(yù)防或治療哺乳動物疾病的藥物中的應(yīng)用；另外，本發(fā)明也提供了天然蕓苔素內(nèi)酯類似物和亞麻酸?；掖及仿?lián)合在制備用于改善哺乳動物狀況的保健品中的應(yīng)用。
[0010]在本文中，亞麻酸酸基乙醇胺(LinolenoylEthanolamide ;N_9, 12, 15-Octadecatrienoylethanolamine)具有如圖14所示結(jié)構(gòu)，其CAS登記號為57086-93-8，是花生四烯酰基乙醇酰胺的類似物，具有抗菌、止喘、止吐、抗偏頭痛和鎮(zhèn)痛以及治療青光眼和緩解硬化癥狀等作用(參見中國專利申請CN1097735A)。到目前為止，沒有報(bào)道認(rèn)為亞麻酸酰基乙醇胺，尤其是低濃度的亞麻酸酰基乙醇胺，能與本發(fā)明的天然蕓苔素內(nèi)酯類似物協(xié)同起效，用于預(yù)防或治療雄性哺乳動物前列腺增生疾病，或用于改善雄性哺乳動物前列腺增生狀況。本發(fā)明的亞麻酸?；掖及房梢允腔瘜W(xué)合成的，也可以是從植物中提取的。
[0011]由于亞麻酸酰基乙醇胺，尤其是低濃度的亞麻酸?；掖及?，盡管單獨(dú)給藥幾乎沒有針對前列腺增生的作用，但是仍舊保留了增強(qiáng)天然蕓苔素內(nèi)酯類似物的功效的作用，所以優(yōu)選在本發(fā)明的第一方面的的應(yīng)用中，所述藥物中的亞麻酸酰基乙醇胺無法單獨(dú)預(yù)防或治療哺乳動物(尤其是雄性哺乳動物)疾?。换蛘?，所述保健品中的亞麻酸?；掖及窡o法單獨(dú)改善哺乳動物(尤其是雄性哺乳動物)狀況。無法單獨(dú)起效可以是亞麻酸?；掖及返臐舛然蚝康椭翢o法單獨(dú)起效。[0012]在本文中，藥物或保健品，指的是針對哺乳動物(尤其是人)施用的藥物或保健品，而不是針對植物施用的組合物。顯然，針對哺乳動物(尤其是人)施用的藥物或保健品的要求比針對植物施用的組合物的要求高得多，前者需要配比穩(wěn)定，而后者可以較不穩(wěn)定；前者需要無菌，而后者可以有些菌；前者雜質(zhì)含量低，而后者可以含有較多雜質(zhì)，所以，即使前者與后者的主要組分相同，但是兩者是不同的，或者前者只是后者范疇中不會按后者要求而選擇卻精選出的一部分。
[0013]另外，藥物和保健品的差異是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉的，主要是行政審批標(biāo)準(zhǔn)的差異，藥物的要求比保健品更高。
[0014]在本發(fā)明的第一方面的應(yīng)用中，哺乳動物可以是人、家畜、寵物等，優(yōu)選是人。優(yōu)選其中，哺乳動物是雄性哺乳動物，如男人。
[0015]在本文中，“天然”指的是從所限定的物質(zhì)是從天然來源(如花粉、蜂蠟等)中提取的。在本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】中，所提供的蕓苔素內(nèi)酯類似物是從油菜花粉中。當(dāng)然，由于已經(jīng)解析了這些天然蕓苔素內(nèi)酯類似物，因此它們不限于從天然來源(如花粉、蜂蠟等)中提取，也可以是化學(xué)合成的。
[0016]在本發(fā)明的第一方面的應(yīng)用中，天然蕓苔素內(nèi)酯類似物優(yōu)選是分離的天然蕓苔素內(nèi)酯類似物。在本文中，“分離的”指的是天然蕓苔素內(nèi)酯類似物脫離了或者曾經(jīng)脫離了天然存在的環(huán)境而以高于50%的純度存在或者存在過。盡管天然蕓苔素內(nèi)酯類似物可以重新混合入混合物中從而降低了它本身的純度，但是曾經(jīng)的高純度，便于使得各批次產(chǎn)品穩(wěn)定，這對于制備藥物或保健品等涉及人身安全的領(lǐng)域來說，是尤為重要而且比要的優(yōu)點(diǎn)。因此，在本發(fā)明的第一方面的應(yīng)用中，天然蕓苔素內(nèi)酯類似物優(yōu)選是配比穩(wěn)定的天然蕓苔素內(nèi)酯類似物。在本文中，“配比穩(wěn)定”指的是不同批次產(chǎn)品中天然蕓苔素內(nèi)酯類似物的組成和含量是相同的。由于本發(fā)明第一方面的提取方法能夠?qū)⑻烊皇|苔素內(nèi)酯類似物分離，因此可以單獨(dú)使用或者重新配比使用，完全能夠做到配比穩(wěn)定。
[0017]優(yōu)選在本發(fā)明的第一方面的應(yīng)用中，所述疾病是前列腺疾病，更優(yōu)選是前列腺增生疾病。這一疾病尤其困擾中老年男性。相應(yīng)地，也優(yōu)選在本發(fā)明的第一方面的應(yīng)用中，所述狀況是前列腺狀況，優(yōu)選是前列腺增生狀況。
[0018]經(jīng)本發(fā)明人深入研究，發(fā)現(xiàn)有許多天然蕓苔素內(nèi)酯類似物能夠用于哺乳動物用藥物或保健品，尤其在與亞麻酸?；掖及仿?lián)合給藥時(shí)，能夠增強(qiáng)效果，從而能夠?qū)嶋H藥用或保健使用。優(yōu)選在本發(fā)明的第一方面的應(yīng)用中，所述天然蕓苔素內(nèi)酯類似物是BR6、BRUBR2、BR3、BR4和/或BR5，或它們之任意幾種的混合物。在本文中，BRl的結(jié)構(gòu)式如圖8所示，BR2的結(jié)構(gòu)式如圖9所示，BR3的結(jié)構(gòu)式如圖10所示，BR4的結(jié)構(gòu)式如圖11所示，BR5的結(jié)構(gòu)式如圖12所示，BR6的結(jié)構(gòu)式如圖13所示。
[0019]BR3單獨(dú)用藥效果已經(jīng)能夠達(dá)到極限，盡管聯(lián)用時(shí)未顯示出協(xié)同效應(yīng)，但是預(yù)計(jì)與亞麻酸?；掖及仿?lián)用，能在不影響極限藥效的情況下可以降低它們的用量，所以BR3也是優(yōu)選的。另外優(yōu)選在本發(fā)明的第一方面的應(yīng)用中，所述天然蕓苔素內(nèi)酯類似物是BR6、BR1、BR2、BR4和/或BR5，或它們之任意幾種的混合物。[0020]另外也優(yōu)選在本發(fā)明的第一方面的應(yīng)用中，所述藥物或保健品是本發(fā)明的第二方面的組合物。
[0021]在第二方面，本發(fā)明提供了用于預(yù)防或治療哺乳動物(尤其是雄性哺乳動物)疾病的藥物組合物，其包括天然蕓苔素內(nèi)酯類似物和亞麻酸?；掖及?，以及藥物上可接受的載體；另外，本發(fā)明也提供了用于改善哺乳動物(尤其是雄性哺乳動物)狀況的保健品組合物，其包括天然蕓苔素內(nèi)酯類似物和亞麻酸?；掖及?，以及保健品上可接受的載體。
[0022]在本文中，藥物上可接受的載體和保健品上可接受的載體分別具有醫(yī)藥和保健品領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的含義，分別指不影響(甚至能增強(qiáng))活性成分發(fā)揮功效的、對人或其他哺乳動物安全無毒的藥物輔料或保健品輔料。藥物上可接受的載體和保健品上可接受的載體往往可以通用，包括賦形劑、增溶劑、填充劑、pH調(diào)節(jié)劑和/或矯味劑。它們比常規(guī)施用于植物的輔料的雜質(zhì)含量低得多，均一性更好。
[0023]在本發(fā)明的第二方面的組合物中，天然蕓苔素內(nèi)酯類似物優(yōu)選是分離的天然蕓苔素內(nèi)酯類似物。另外，在本發(fā)明的第二方面的組合物中，天然蕓苔素內(nèi)酯類似物優(yōu)選是配比穩(wěn)定的天然蕓苔素內(nèi)酯類似物。
[0024]優(yōu)選在本發(fā)明的第二方面的組合物中，所述疾病是前列腺疾病，更優(yōu)選是前列腺增生疾病。相應(yīng)地，也優(yōu)選在本發(fā)明的第二方面的組合物中，所述狀況是前列腺狀況，優(yōu)選是前列腺增生狀況。
[0025]優(yōu)選在本發(fā)明的第二方面的組合物中，所述天然蕓苔素內(nèi)酯類似物和亞麻酸?；掖及返闹亓勘葹?.2~20:0.1~10，更優(yōu)選為0.6~6:0.3~3，更加優(yōu)選為1~4:0.5~2，如1.5~2.5:0.8~1.3，最優(yōu)選為2:1。
[0026]本發(fā)明第二方面的組合物可以是各種制劑(劑型)，優(yōu)選為固體制劑和液體制劑。本發(fā)明的制劑可以為單位劑量形式，如片劑、丸劑、膠囊(包括持續(xù)釋放或延遲釋釋放形式)、粉劑、混懸劑、顆粒劑、酊劑、糖漿劑、乳液劑、懸浮液、針劑、等劑型以及各種緩釋劑型，從而適合各種給藥方式，例如口服、非腸道注射、粘膜、肌肉、靜脈內(nèi)、皮下、眼內(nèi)、皮內(nèi)或經(jīng)過皮膚等的給藥形式。優(yōu)選本發(fā)明的第二方面的組合物是口服制劑，更優(yōu)選是口服液體制劑，如水溶液或含醇的水溶液。
[0027]根據(jù)本發(fā)明人的深入的研究，優(yōu)選在本發(fā)明的第二方面的組合物中，所述天然蕓苔素內(nèi)酯類似物是BR6、BR1、BR2、BR3、BR4和/或BR5，或它們之任意幾種的混合物。[0028]另外也優(yōu)選本發(fā)明的第二方面的組合物是通過本發(fā)明的第三方面的方法制備的。
[0029]在第三方面，本發(fā)明提供了制備包含天然蕓苔素內(nèi)酯類似物和亞麻酸?；掖及返牟溉閯游镉盟幬锘虮＝∑返姆椒?，其包括，
(1)用8(T100%(V/V)乙醇水溶液提取破碎的油菜花粉，固液分離后保留濾液(任選其中濾液進(jìn)一步濃縮)，獲得醇溶性提取液；
(2)將醇溶性提取液與(T60%(V/V)乙醇水溶液混合，然后加入乙酸乙酯萃取，保留乙酸乙酯層并加入酯酶進(jìn)行不完全反應(yīng)，然后干燥，獲得酯溶性提取物；
(3)酯溶性提取物上樣于硅膠色譜柱，用甲醇和乙酸乙酯的混和液洗脫，收集含有天然蕓苔素內(nèi)酯類似物的洗脫液，干燥并溶解于甲醇中，獲得硅膠柱純化液；
(4)和將硅膠柱純化液上樣于C18反相色譜柱，用乙腈和水的混和液洗脫，分別收集含有BR6、BR1、BR2、BR3、BR4和/或BR5的洗脫液；和
(5)將洗脫液干燥后，與亞麻酸?；掖及坊旌?，以及與藥物上可接受的載體或保健品上可接受的載體混合。
[0030]BR6、BR1、BR2、BR3、BR4和/或BR5等天然蕓苔素內(nèi)酯類似物可以通過本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】所述的提取方法依次洗脫，其鑒定圖譜分別如圖2~7所示。
[0031]在本發(fā)明第三方面的方法中，在步驟(1)中，可以使用100% (V/V)乙醇水溶液(SP，純乙醇)，但優(yōu)選乙醇水溶液的濃度為85~98%(V/V)，優(yōu)選為90~97%(V/V)，更優(yōu)選為93~96%(V/V)，最優(yōu)選為 95% (V/V)0
[0032]在本發(fā)明第三方面的方法中，在步驟(1)中，破碎油菜花粉的方式一般是用物理破碎方式，包括超聲破碎、碾磨破碎等。
[0033]在本發(fā)明第三方面的方法中，在步驟(1)中，油菜花粉和乙醇水溶液的比例可以優(yōu)化，比例過低，將使用過量乙醇，需要更高成本的濃縮；比例過高，則提取不充分。經(jīng)本發(fā)明人研究，優(yōu)選在步驟(1)中，油菜花粉:乙醇水溶液的重量體積比為50-200克:20(T500mL，優(yōu)選為80~150克:25(T450mL，更優(yōu)選為90~120克:28(T350mL，最優(yōu)選為100克:300mL。
[0034]在步驟(1)中，為了提取完全，可以對提取后的濾渣進(jìn)一步提取，并如此反復(fù)提取濾渣，合并濾液。因此優(yōu)選在本發(fā)明第三方面的方法中，步驟(1)進(jìn)一步包括，固液分離后得到的濾渣用8(T100% (V/V)乙醇水溶液提取，然后進(jìn)行固液分離，保留濾液并與步驟(1)中獲得的濾液合并。該步驟可以步驟(1)的其他提取步驟采用相同的條件，而且該步驟固液分離后得到的濾渣可以進(jìn)一步采用與該步驟相同的步驟提取0-5次，只要最后將所有濾液合并即可。
[0035]在步驟(1)中，濾液或者合并的濾液，體積過大，則不利于以后步驟的萃取效率。因此優(yōu)選在本發(fā)明第三方面的方法中，在步驟(1)中，濾液進(jìn)一步濃縮。濃縮是減壓干燥濃縮，優(yōu)選為以65~80°C和0.08^0.09Mpa的真空度干燥濃縮，最優(yōu)選為以75°C和0.085Mpa的真空度干燥濃縮。濃縮后，優(yōu)選醇溶性提取液:步驟(2)中的乙醇水溶液的體積比為0.5^2:1-3，優(yōu)選為0.8~1.5:1.5~2.5，最優(yōu)選為1:2。
[0036]在本發(fā)明第三方面的方法中，在步驟(2)中，可以使用0% (V/V)乙醇水溶液(SP，純水)，但優(yōu)選乙醇水溶液的濃度為30~55% (V/V)，優(yōu)選為40~53% (V/V)，更優(yōu)選為45~52%(V/V),最優(yōu)選為 50% (V/V)0
[0037]在本發(fā)明第三方面的方法中，在步驟(2)中，加入的乙酸乙酯的量可以優(yōu)化。經(jīng)本發(fā)明人研究，優(yōu)選在步驟(2)中，乙醇水溶液:乙酸乙酯的體積比為廣3:3~8，優(yōu)選為
1.5^2.5:4飛，最優(yōu)選為2:5。
[0038]為了萃取完全，可以對萃取后的非乙酸乙酯層(B卩，分離了乙酸乙酯層后剩余的層)進(jìn)一步提取，并如此反復(fù)萃取非乙酸乙酯層，合并乙酸乙酯層。因此優(yōu)選在本發(fā)明第三方面的方法中，步驟(2)進(jìn)一步包括，萃取后得到的非乙酸乙酯層加入乙酸乙酯萃取，保留乙酸乙酯層并與步驟(2)中獲得的乙酸乙酯層合并。萃取可以進(jìn)行f 8次，優(yōu)選為2飛次。
[0039]優(yōu)選在本發(fā)明第三方面的方法中，在步驟(2)中，酯酶，也稱脂肪酶，能水解甘油三酯或脂肪酸脂產(chǎn)生單或雙甘油酯和游離脂肪酸。這樣的酶本身已經(jīng)在食品領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。脂肪酶優(yōu)選是提取自細(xì)菌的酯酶，如可以是能夠從市場購買獲取的脂肪酶，也可以是直接從細(xì)菌(如，熒光假單胞菌，優(yōu)選是CGMCC N0.1.867 (即AS 1.867)菌株)中提取的酯酶(如參見中國專利申請200810046182.0)。
[0040]優(yōu)選在本發(fā)明第三方面的方法中，在步驟(2)中，糖化酶，也稱葡萄糖淀粉酶，能將淀粉鏈轉(zhuǎn)化為葡萄糖。這樣的酶本身已經(jīng)在釀造領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。糖化酶優(yōu)選是提取自真菌的糖化酶，如可以是能夠從市場購買獲取的糖化酶，也可以是直接從真菌(如黑曲霉)中提取的糖化酶。
[0041]在本文中，“不完全反應(yīng)”指的是使酶反應(yīng)的底物在全部轉(zhuǎn)化前終止反應(yīng)，由此保持天然蕓苔素內(nèi)酯類似物的多樣性。通常完全反應(yīng)要進(jìn)行3小時(shí)以上，因此優(yōu)選在本發(fā)明第三方面的方法中，在步驟(2)中，不完全反應(yīng)是在35~42°C反應(yīng)0.5^2小時(shí)，優(yōu)選是在37~41°C反應(yīng)0.75~1.5小時(shí)，最優(yōu)選在40°C反應(yīng)I小時(shí)。 [0042]優(yōu)選在本發(fā)明第三方面的方法中，在步驟(2)中，干燥是減壓干燥，優(yōu)選為以65~80°C和0.08~0.09Mpa的真空度干燥，最優(yōu)選為以75°C和0.085Mpa的真空度干燥。
[0043]本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，初步的提純以硅膠色譜柱為宜，只需要根據(jù)洗脫速度來設(shè)置收集的起始和終止時(shí)間即可全面收集多種天然蕓苔素內(nèi)酯類似物，簡便易行。優(yōu)選在本發(fā)明第三方面的方法中，在步驟(3)中，硅膠色譜柱中的填料是200-300目硅膠，最優(yōu)選是300目硅膠。
[0044]在步驟(3)中，潛在可以選擇的洗脫液種類繁多，經(jīng)本發(fā)明人研究，發(fā)現(xiàn)用甲醇和乙酸乙酯的混和液洗脫，產(chǎn)物較穩(wěn)定。優(yōu)選在本發(fā)明第三方面的方法中，在步驟(3)中，混和液中甲醇:乙酸乙酯的體積比為3~8:0.5^1.5，優(yōu)選為1~7:0.8^1.3，最優(yōu)選為5:1。
[0045]優(yōu)選在本發(fā)明第三方面的方法中，在步驟(3)中，干燥是減壓干燥，優(yōu)選為以65~80°C和0.08~0.09Mpa的真空度干燥，最優(yōu)選為以75°C和0.085Mpa的真空度干燥。
[0046]在步驟(4)中，潛在可以選擇的洗脫液種類繁多，經(jīng)本發(fā)明人研究，發(fā)現(xiàn)用乙腈和水的混和液洗脫，可以有效分離各種天然蕓苔素內(nèi)酯類似物。優(yōu)選在本發(fā)明第三方面的方法中，在步驟(4)中，混和液中乙腈:水的體積比為60~90:10~40，優(yōu)選為70~80:20~30，最優(yōu)選為75:25。
[0047]用本發(fā)明第三方面的方法中的步驟提取得到的天然蕓苔素內(nèi)酯類似物是高純度的。優(yōu)選在本發(fā)明第三方面的方法中，在步驟(4)中，如式BR6、BRl、BR2、BR3、BR4和/或BR5所示的天然蕓苔素內(nèi)酯類似物的純度大于90%，優(yōu)選大于95%，更優(yōu)選大于98%，最優(yōu)選大于99%。
[0048]本發(fā)明取得的優(yōu)異效果在于，一次提取，最終可以收集到多種分離的高純度的天然蕓苔素內(nèi)酯類似物，因而攤薄了成本；提取(純化)流程穩(wěn)定，多種分離的天然蕓苔素內(nèi)酯類似物可以單獨(dú)施用，也可以配比混和施用，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定而容易控制，達(dá)到人用藥物或保健品的要求；突破現(xiàn)有技術(shù)中蕓苔素用于植物的限制，拓寬了其更高附加值的用途，能夠用于治療或預(yù)防哺乳動物疾病，尤其是前列腺(增生)疾病，或者能夠用于改善哺乳動物狀況，尤其是前列腺(增生)狀況；天然蕓苔素內(nèi)酯類似物和亞麻酸?；掖及穮f(xié)同增效，不但提高了效果，可以降低給藥量，更可以使得原來不具備成藥價(jià)值的天然蕓苔素內(nèi)酯類似物(如，BR5)也能具有聯(lián)合成藥的價(jià)值。
[0049]為了便于理解，以下將通過具體的附圖和實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)地描述。需要特別指出的是，具體實(shí)例和附圖僅是為了說明，并不構(gòu)成對本發(fā)明范圍的限制。顯然本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以根據(jù)本文說明，在本發(fā)明的范圍內(nèi)對本發(fā)明做出各種各樣的修正和改變，這些修正和改變也納入本發(fā)明的范圍內(nèi)。另外，本發(fā)明引用了現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)，這些文獻(xiàn)也是為了更清楚地描述本發(fā)明，它們的全文內(nèi)容均納入本發(fā)明進(jìn)行參考，就好像它們的全文已經(jīng)在本發(fā)明說明書中重復(fù)敘述過一樣。[0050]【專利附圖】

【附圖說明】
[0051]圖1顯示了天然蕓苔素內(nèi)酯類似物的純化圖譜。
[0052]圖2~7顯示了各天然蕓苔素內(nèi)酯類似物的質(zhì)譜鑒定圖譜，其中，BRl的質(zhì)譜圖譜如圖2所示，BR2的如圖3所示，BR3的如圖4所示，BR4的如圖5所示，BR5的如圖6所示，BR6的如圖7所示。
[0053]圖8~13顯示了各天然蕓苔素內(nèi)酯類似物的結(jié)構(gòu)式，其中BRl如圖8所示，BR2如圖9所示，BR3如圖10所示，BR4如圖11所示，BR5如圖12所示，BR6如圖13所示。
[0054]圖14顯示了亞麻酸?；掖及返慕Y(jié)構(gòu)式。
[0055]【具體實(shí)施方式】
[0056]實(shí)施例1天然蕓苔素內(nèi)酯類似物的提取和鑒定
取油菜花粉100克，加入95% (V/V)乙醇300mL，超聲破碎，過濾，保留濾液；濾渣加入95% (V/V)乙醇300mL，超聲破碎，過濾，保留濾液。合并濾液，于75°C、0.085Mpa的真空度干燥濃縮至體積為IOOmL,得花粉醇提液。
[0057]將50% (V/V)乙醇200mL加到花粉醇提液中，混合均勻，然后加入500mL乙酸乙酯萃取，保留上層(乙酸乙酯層);下層繼續(xù)加入500mL乙酸乙酯萃取，保留上層(乙酸乙酯層)。合并乙酸乙酯層，加入300mL濃縮酶液(2500U/L ;參見中國專利申請200810046182.0)于40°C攪拌(45rpm)處理I小時(shí)，然后于75°C、0.085Mpa的真空度干燥，得酯溶性提取物。
[0058]取酯溶性提取物上樣于硅膠色譜柱(2.6cmX 40cm, 300目硅膠)，加流動相(即，甲醇和乙酸乙酯的混和液，甲醇:乙酸乙酯的體積比為5:1)洗脫，控制流速為4ml/分鐘，收集第40分鐘至第150分鐘流出的洗脫液，合并后于75°C、0.085Mpa的真空度干燥完全，溶解于IOmL甲醇中，得硅膠柱純化液。
[0059]然后,將硅膠柱純化液上樣于C18反相色譜柱(柱參數(shù)為50mmX 25cm，5μπι),加流動相(即，乙腈和水的混和液，乙腈:水的體積比為75:25)洗脫，控制流速為10ml/min，洗脫圖譜如圖1所示，其中標(biāo)明了各天然蕓苔素內(nèi)酯類似物的峰及其洗脫時(shí)間，可以在各洗脫時(shí)間分別收集相應(yīng)的天然蕓苔素內(nèi)酯類似物(BR6、BRl、BR2、BR3、BR4、BR5 )。上述提取流程的穩(wěn)定性好，綜合效率高，能夠一次獲得上述6種天然蕓苔素內(nèi)酯類似物。
[0060]收集天然蕓苔素內(nèi)酯類似物BR1、BR2、BR3、BR4、BR5和BR6，用高分辨率質(zhì)譜驗(yàn)證(BRl的質(zhì)譜圖譜如圖2所示，BR2的如圖3所示，BR3的如圖4所示，BR4的如圖5所示，BR5的如圖6所示，BR6的如圖7所示)正確，各類似物純度均高于99%，然后委托四川大學(xué)分析測試中心根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法(質(zhì)譜分析(GB/T 6041-2002)、紅外光譜分析(GB/T6040-2002)、超導(dǎo)脈沖傅里葉變換核磁共振譜(JY/T 007-1996)和分子吸收分光光度分析(GB/T 9721-2006))進(jìn)行測試，解析出各天然蕓苔素內(nèi)酯類似物的化學(xué)結(jié)構(gòu)，其中BRl如圖8所示，BR2如圖9所示，BR3如圖10所示，BR4如圖11所示，BR5如圖12所示，BR6如圖13所示。
[0061]另外將上述提純的化合物混和成蕓苔素類似物(簡稱為“BR混”或“BR混合物”;其中 BRl:BR2:BR3:BR4:BR5 和 BR6 的重量比為 0.4:0.4:0.4:0.4:0.4:98)
實(shí)施例2動物安全性測試 分別取實(shí)施例1制備的天然蕓苔素內(nèi)酯類似物BR1、BR2、BR3、BR4、BR5和BR6，以及BR混合物，分別用少量的無水乙醇溶解，然后加蒸餾水稀釋至藥物濃度為:0.005mg/mL，其中無水乙醇體積濃度為:0.0125% ;另外取少量無水乙醇用蒸餾水配制成體積濃度為0.0125%的乙醇水溶液作為對照。
[0062]用購自成都達(dá)碩生物科技有限公司的SPF級NIH同日齡斷乳小鼠(雌雄各半)和SPF級同日齡SD幼年大鼠(雌雄各半)進(jìn)行試驗(yàn)。試驗(yàn)過程為:將小鼠或大鼠隨機(jī)分成8組(其中BR單體6組，BR混合物I組，空白對照I組)，每組10只，雌雄各半，BR各組以0.1mg/kg灌胃，空白對照組每日灌胃等體積的上述乙醇水溶液I次，每周3次，共給藥4周，期間稱量體重并觀察動物生理狀態(tài)。試驗(yàn)期間，動物均自由攝食SPF級大、小鼠通用普通輻照飼料及飲用純水。
[0063]表1小鼠體重變化結(jié)果(，n=10)
【權(quán)利要求】
1.天然蕓苔素內(nèi)酯類似物和亞麻酸?；掖及仿?lián)合在制備用于預(yù)防或治療哺乳動物(尤其是雄性哺乳動物)疾病的藥物或者用于改善哺乳動物(尤其是雄性哺乳動物)狀況的保健品中的應(yīng)用。
2.權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其中所述藥物中的亞麻酸?；掖及窡o法單獨(dú)預(yù)防或治療哺乳動物(尤其是雄性哺乳動物)疾?。换蛘?，所述保健品中的亞麻酸酰基乙醇胺無法單獨(dú)改善哺乳動物(尤其是雄性哺乳動物)狀況。
3.權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其中所述疾病是前列腺疾病，優(yōu)選是前列腺增生疾?。换蛘?，所述狀況是前列腺狀況，優(yōu)選是前列腺增生狀況。
4.權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其中所述天然蕓苔素內(nèi)酯類似物是BR6、BR1、BR2、BR3、BR4和/或BR5，或它們之任意幾種的混合物。
5.用于預(yù)防或治療哺乳動物(尤其是雄性哺乳動物)疾病的藥物組合物，其包括天然蕓苔素內(nèi)酯類似物和亞麻酸?；掖及?，以及藥物上可接受的載體。
6.用于改善哺乳動物(尤其是雄性哺乳動物)狀況的保健品組合物，其包括天然蕓苔素內(nèi)酯類似物和亞麻酸?；掖及?，以及保健品上可接受的載體。
7.權(quán)利要求5或6所述的組合物，其中所述天然蕓苔素內(nèi)酯類似物是BR6、BRUBR2、BR3、BR4和/或BR5，或它們之任意幾種的混合物。
8.權(quán)利要求5或6所述的組合物，其是口服制劑，優(yōu)選是口服液體制劑。
9.權(quán)利要求5或6所述的組合物，其中所述疾病是前列腺疾病，優(yōu)選是前列腺增生疾?。换蛘?，所述狀況是前列腺狀況，優(yōu)選是前列腺增生狀況。
10.制備包含天然蕓苔素內(nèi)酯類似`物和亞麻酸?；掖及返牟溉閯游镉盟幬锘虮＝∑返姆椒?，其包括， (1)用8(T100%(V/V)乙醇水溶液提取破碎的油菜花粉，固液分離后保留濾液(任選其中濾液進(jìn)一步濃縮)，獲得醇溶性提取液； (2)將醇溶性提取液與(T60%(V/V)乙醇水溶液混合，然后加入乙酸乙酯萃取，保留乙酸乙酯層并加入酯酶進(jìn)行不完全反應(yīng)，然后干燥，獲得酯溶性提取物； (3)酯溶性提取物上樣于硅膠色譜柱，用甲醇和乙酸乙酯的混和液洗脫，收集含有天然蕓苔素內(nèi)酯類似物的洗脫液，干燥并溶解于甲醇中，獲得硅膠柱純化液； (4)將硅膠柱純化液上樣于C18反相色譜柱，用乙腈和水的混和液洗脫，分別收集含有BR6、BR1、BR2、BR3、BR4 和 / 或 BR5 的洗脫液；和 (5)將洗脫液干燥后，與亞麻酸酰基乙醇胺混合，以及與藥物上可接受的載體或保健品上可接受的載體混合。
【文檔編號】A61K31/164GK103877100SQ201310187134
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2013年5月21日 優(yōu)先權(quán)日:2013年5月21日
【發(fā)明者】何其明, 國錦琳 申請人:成都旗美生物科技有限公司