本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別涉及一種臍帶組織凍存液。
背景技術(shù)：
：臍帶是胎兒時期連接胎兒與母體胎盤的索狀或管狀結(jié)構(gòu)，其外被羊膜，內(nèi)含2條臍動脈和1條臍靜脈組成，在動靜脈之間含有特殊的胚胎粘液樣結(jié)締組織—華爾通氏膠(WhartonpsJelly)，華爾通氏膠里含有豐富的可分離得到的臍帶間充質(zhì)干細胞(hUC-MSCs)。臍帶間充質(zhì)干細胞是一種多功能干細胞，它能分化成許多種組織細胞，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。但臍帶組織在4℃條件下最多能保存6天，超過48h再進行原代分離培養(yǎng)的臍帶組織得到純的臍帶間充質(zhì)干細胞的概率會大大減低?，F(xiàn)有的臍帶組織凍存方法雖然提供了基本的凍存液和程序降溫方法，但是未能提供更豐富的營養(yǎng)物質(zhì)及保護劑，不利于長時間的凍存臍帶組織，限制了其臨床應(yīng)用。因此，研究一種能長時間凍存臍帶組織的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員需要解決的技術(shù)問題。技術(shù)實現(xiàn)要素：有鑒于此，本發(fā)明公開了一種能長時間凍存臍帶組織的凍存液，所述凍存液對臍帶組織具有良好的凍存效果。本發(fā)明公開了一種凍存液，按體積濃度計，包括如下組分：優(yōu)選地，所述凍存液按體積濃度計，包括如下組分：作為優(yōu)選，所述培養(yǎng)基為DMEM、DMEM/12或1640培養(yǎng)基。作為優(yōu)選，所述右旋糖酐為中分子右旋糖酐、低分子右旋糖酐和小分子右旋糖酐中的任意一種。其中，最優(yōu)選為中分子右旋糖酐。本發(fā)明還公開了一種臍帶組織的凍存方法，包括以下步驟：將預(yù)處理過的臍帶組織放入含上述凍存液的凍存管內(nèi)制成凍存樣品，然后將所述凍存樣品放入程序降溫盒中，再將程序降溫盒放入-80℃冰箱內(nèi)，24h后將所述凍存樣品轉(zhuǎn)入液氮中，完成凍存。預(yù)處理方法為用生理鹽水將臍帶充分洗滌2次，用組織剪將臍帶兩端剪去，再清洗2次。然后用尖頭剪將臍帶剪成約2cm的小段，清洗2次。將臍帶沿靜脈血管平行方向剪開小口，再用組織鑷縱向撕開、展平；再將3根血管及羊膜從臍帶中剝離干凈，可得臍帶華通氏膠，轉(zhuǎn)移至離心管中，并剪至1～2mm3小塊。向華通氏膠小塊中加入含10％DMSO+90％培養(yǎng)基的平衡液，使組織塊全部浸沒，置4℃進行濃度平衡15min。平衡后-4℃、1500rpm離心5min，去上清，稱取2g華通氏膠，放入凍存管內(nèi)進行后續(xù)凍存操作。本發(fā)明還公開了所述凍存液在組織凍存中的應(yīng)用。對本發(fā)明公開的凍存液中包括的部分組分介紹如下：二甲基亞砜(DMSO)，是一種含硫有機化合物，分子式為(CH3)2SO，常溫下為無色無臭的透明液體，是一種具有吸濕性的可燃液體，具有高極性、高沸點、熱穩(wěn)定性好、非質(zhì)子、與水混溶的特性，能溶于乙醇、丙醇、苯和氯仿等大多數(shù)有機物，被稱為“萬能溶劑”。在酸存在時對DMSO加熱會產(chǎn)生少量甲基硫醇、甲醛、二甲基硫和甲磺酸等化合物。DMSO在高溫下有分解現(xiàn)象，遇氫能發(fā)生劇烈反應(yīng)，在空氣中燃燒發(fā)出淡藍色火焰。DMSO可用作有機溶劑、反應(yīng)介質(zhì)和有機合成中間體，也可用作合成纖維的染色溶劑、去染劑和染色載體，還可用作回收乙炔和二氧化硫的吸收劑。DMSO能快速通過細胞膜進入細胞內(nèi)部，在細胞冷凍過程中，維持細胞內(nèi)外的水和離子平衡。非必需氨基酸(MEMNEAA)，包括丙氨酸、精氨酸、天門冬氨酸、胱氨酸、脯氨酸、酪氨酸等。非必需氨基酸可通過人體自身合成或從其它氨基酸轉(zhuǎn)化得到。有些非必需氨基酸的攝入量還會影響必需氨基酸的需求量，例如，當膳食中的半胱氨酸和酪氨酸充裕時，可分別減少對蛋氨酸和苯丙氨酸的需求。因此，半胱氨酸和酪氨酸又被稱為半必需氨基酸或條件必需氨基酸。非必需氨基酸可在動物體內(nèi)合成，作為營養(yǎng)源，不需要從外部補充氨基酸。對人來說非必需氨基酸為甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、絲氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸。這些氨基酸由碳水化合物的代謝物或由必需氨基酸合成碳鏈，進一步由氨基轉(zhuǎn)移反應(yīng)引入氨基生成氨基酸。已知即使攝取非必需氨基酸，也是對生長有利的。右旋糖酐系蔗糖經(jīng)腸膜狀明串珠菌-1226(Leuconostocmesenteroides)發(fā)酵合成的一種高分子葡萄糖聚合物，是目前最佳的血漿代用品之一。臨床上常用的有中分子右旋糖酐，主要用作血漿代用品，用于治療出血性休克、創(chuàng)傷性休克及燒傷性休克等。低、小分子右旋糖酐能改善微循環(huán)，預(yù)防或消除血管內(nèi)紅細胞聚集和血栓形成等，亦有擴充血容量的作用，用于治療各種休克所致的微循環(huán)障礙、彌漫性血管內(nèi)凝血、心絞痛、急性心肌梗塞及其他周圍血管疾病等。在本發(fā)明中，右旋糖酐可以為組織塊的凍存模擬一個接近原始的環(huán)境；而臍帶組織離開胎盤后缺乏營養(yǎng)供應(yīng)，對氨基酸的補充需要完整，包括必需氨基酸和非必需氨基酸的補充，這樣才能保證臍帶組織塊的活性；DMSO能快速通過細胞膜進入細胞內(nèi)部，在細胞冷凍過程中，維持細胞內(nèi)外的水和離子平衡，同時可以時保護液中讓各組分間的充分混合以及具有協(xié)同增效的作用。用本發(fā)明實施例制備的凍存液對臍帶組織進行凍存，6個月后將凍存的臍帶組織復(fù)蘇并分離得到臍帶間充質(zhì)干細胞的形態(tài)與凍存前進行原代分離得到的臍帶間充質(zhì)干細胞的形態(tài)一致，且相比于傳統(tǒng)的凍存液，用本發(fā)明實施例制備的凍存液凍存復(fù)蘇后的臍帶組織分離得到臍帶間充質(zhì)干細胞的成功率高，且細胞的免疫表型和分化能力沒有發(fā)生變化。綜上所述，本發(fā)明公開了一種臍帶組織凍存液，該凍存液能為臍帶組織模擬一個接近原始的環(huán)境和提供充足的營養(yǎng)物質(zhì)，對臍帶組織的凍存效果好，能對臍帶組織進行長時間的凍存。從凍存復(fù)蘇后的臍帶組織分離得到的臍帶間充質(zhì)干細胞的細胞形態(tài)、免疫表型和分化能力與凍存前相比未發(fā)生變化。且該臍帶組織凍存液的成本低，利于大規(guī)模推廣應(yīng)用。附圖說明為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對實施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實施例，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。圖1為正常原代分離的臍帶間充質(zhì)干細胞的顯微鏡圖；圖2為本發(fā)明實施例制備的凍存液凍存復(fù)蘇后原代分離得到的臍帶間充質(zhì)干細胞的顯微鏡圖；圖3為凍存復(fù)蘇后進行分離得到的臍帶間充質(zhì)干細胞的流式結(jié)果圖；圖4為未凍存直接進行原代分離得到的臍帶間充質(zhì)干細胞的流式結(jié)果圖；圖5為臍帶間充質(zhì)干細胞體外向脂肪細胞誘導(dǎo)分化的顯微鏡染色圖。具體實施方式本發(fā)明公開了一種臍帶組織凍存液，該凍存液對臍帶組織具有良好的凍存效果。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當改進工藝參數(shù)實現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通過較佳實施例進行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對本文所述的方法和應(yīng)用進行改動或適當變更與組合，來實現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。本發(fā)明實施例中所使用到的組分或制劑均為市售或自制來源。非必需氨基酸為購自GIBCO公司的100×溶液。下面結(jié)合實施例，進一步闡述本發(fā)明。實施例1配制凍存液在無菌條件下，將上述量的組分混合，用DMEM/F12定容至目標體積，制得2×的凍存液。在實際使用時將2×凍存液稀釋成1×使用。實施例2配制凍存液在無菌條件下，將上述量的組分混合，用DMEM定容至目標體積，制得2×的凍存液。在實際使用時將2×凍存液稀釋成1×使用。實施例3配制凍存液在無菌條件下，將上述量的組分混合，用1640培養(yǎng)基定容至目標體積，制得2×的凍存液。在實際使用時將2×凍存液稀釋成1×使用。實施例4臍帶組織凍存試驗實施例1配制的凍存液作為試驗組，使用傳統(tǒng)的凍存液作為對照組。傳統(tǒng)凍存液的配方為80單位的FBS加上20單位的DMSO。采集臍帶20條(均經(jīng)過產(chǎn)婦授權(quán)同意，胎兒均足月生產(chǎn)且產(chǎn)婦無傳染性疾病)，將臍帶平均截斷，一段進行原代分離，分離得到的臍帶間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)至P2代進行凍存，對凍存細胞進行計數(shù)；一段臍帶組織預(yù)處理后平均分成兩部分，一部分用實施例1制備的凍存液進行凍存，另一部分用對照組的凍存液進行凍存。所述預(yù)處理方法為：用生理鹽水將臍帶組織充分洗滌2次，用組織剪將臍帶兩端剪去，再清洗2次。然后用尖頭剪將臍帶剪成約2cm的小段，清洗2次。將臍帶沿靜脈血管平行方向剪開小口，再用組織鑷縱向撕開、展平；再將3根血管及羊膜從臍帶中剝離干凈，可得臍帶華通氏膠，轉(zhuǎn)移至離心管中，并剪至1～2mm3小塊。向華通氏膠小塊中加入含10％DMSO+90％培養(yǎng)基的平衡液，使組織塊全部浸沒，置4℃進行濃度平衡15min。平衡后-4℃、1500rpm離心5min，去上清，稱取2g華通氏膠進行后續(xù)凍存操作。，放入凍存管內(nèi)進行后續(xù)凍存操作。將上述預(yù)處理過的臍帶組織放入含1ml凍存液的凍存管內(nèi)制成凍存樣品，將制備好的凍存樣品放入程序降溫盒中，再將程序降溫盒放入-80℃冰箱內(nèi)，24h后將成品轉(zhuǎn)入液氮中，完成凍存，切不可直接將成品放入液氮。將正常原代分離的臍帶間充質(zhì)干細胞在倒置顯微鏡下進行觀察，結(jié)果如圖1所示，圖1A為正常原代分離的臍帶間充質(zhì)干細胞放大40倍的顯微鏡圖，圖1B為正常原代分離的臍帶間充質(zhì)干細胞放大100倍的顯微鏡圖。正常人臍帶間充質(zhì)干細胞貼壁生長，為形態(tài)相對均一的梭形細胞，呈平行排列生長。凍存6個月后取出凍存的臍帶組織塊，采用跟之前一樣的原代分離方法對臍帶間充質(zhì)干細胞進行分離，統(tǒng)計結(jié)果如下：得到P0細胞成功率試驗組20100％對照組1785％對復(fù)蘇后進行分離得到的P0的在倒置顯微鏡下進行觀察，結(jié)果如圖2所示，圖2A為試驗組凍存復(fù)蘇后分離得到的臍帶間充質(zhì)干細胞放大40倍的顯微鏡圖，圖2B為試驗組凍存復(fù)蘇后分離得到的臍帶間充質(zhì)干細胞放大100倍的顯微鏡圖。通過比較圖1和圖2可以看出，試驗組凍存復(fù)蘇后分離得到的臍帶間充質(zhì)干細胞與未經(jīng)凍存直接原代分離得到的臍帶間充質(zhì)干細胞形態(tài)一致，且試驗組凍存復(fù)蘇后分離得到臍帶間充質(zhì)干細胞的成功率要高于對照組，可見試驗組的凍存液對臍帶組織的凍存效果要優(yōu)于對照組。用實施例2或3制備的凍存液重復(fù)上述試驗，得到相似的結(jié)果。實施例5凍存復(fù)蘇后進行分離得到的細胞的免疫表型分析試驗組：將實施例4試驗組(實施例1配制的凍存液)凍存6個月復(fù)蘇后進行分離得到的臍帶間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)至第3代，對細胞進行消化后清洗3次，制成細胞懸液，加入抗體后用流式細胞儀檢測分析CD73、CD90、CD105、CD11b、CD19、CD34、CD45、HLA-DR的表達情況。對照組：未經(jīng)凍存組織塊直接進行原代分離得到臍帶間充質(zhì)干細胞，與試驗組進行同樣的流式分析。將試驗組和對照組的流式分析結(jié)果進行比較，試驗組的流式結(jié)果見圖3及如下：對照組的流式結(jié)果見圖4及如下：流式細胞學(xué)檢測顯示，試驗組和對照組的細胞標記物表達情況一樣，均不表達陰性細胞標記物(造血細胞標記CD34、CD45、CD11、HLA-DR和CD19)，陽性細胞標記物均呈高表達(整合素和黏附分子CD90，以及常用的人間充質(zhì)干細胞標記CD73和CD105)，且試驗組和對照組對陽性標記物和陰性標記物的表達情況無異(P>0.05)。說明用實施例1配制的凍存液凍存后的臍帶組織良好地保持了其原有的活性，獲取的臍帶間充質(zhì)干細胞與新鮮組織無異。取實施例2或3制備的凍存液重復(fù)上述試驗，得到相似的結(jié)果。實施例6凍存復(fù)蘇后進行分離得到的細胞體外向脂肪細胞誘導(dǎo)分化檢測誘導(dǎo)試驗組：將實施例4試驗組(實施例1配制的凍存液)凍存6個月復(fù)蘇后進行分離得到的臍帶間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)至第3代，按2.5×104的細胞濃度接種于含有DMEM/F12+20％FBS培養(yǎng)基的24孔板中，培養(yǎng)至細胞80％融合時，更換為含有1nmol/L地塞米松、10mg/L胰島素、0.5mmol/L3-異丁基-1-甲基黃嘌呤和100μmol/L吲哚美辛的培養(yǎng)液，每周換液2次，3周后用多聚甲醛固定，油紅O染色。誘導(dǎo)對照組：未經(jīng)凍存的組織塊直接進行原代分離得到臍帶間充質(zhì)干細胞，與誘導(dǎo)試驗組進行同樣的體外向脂肪細胞誘導(dǎo)分化的檢測。對照組：將實施例4試驗組(實施例1配制的凍存液)凍存6個月復(fù)蘇后進行分離得到的臍帶間充質(zhì)干細胞進行正常培養(yǎng)至第3代，不進行體外向脂肪細胞的誘導(dǎo)分化。結(jié)果如圖5所示。檢測結(jié)果顯示，人臍帶間充質(zhì)干細胞誘導(dǎo)試驗組和誘導(dǎo)對照組均可以經(jīng)體外誘導(dǎo)形成脂肪細胞，油紅O染色發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)試驗組和誘導(dǎo)對照組的細胞漿內(nèi)均充滿了油滴空泡，說明實施例1制備的組織凍存液凍存后的臍帶組織塊得到的細胞具有正常的分化能力。用實施例2和3制備的凍存液重復(fù)上述試驗，得到相似的結(jié)果。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當指出，對于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護范圍。當前第1頁1 2 3