本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體的說(shuō)是涉及一種牙齒標(biāo)本保存液及其應(yīng)用以及牙齒標(biāo)本保存方法。
背景技術(shù)：
：牙髓干細(xì)胞(dentalpulpstemcells,DPSCs)是存在于牙齒牙髓組織中的一類(lèi)具有自我更新、增殖能力強(qiáng)，及多向分化能力的間充質(zhì)干細(xì)胞。牙髓干細(xì)胞具有多向分化的潛能，它除了能形成礦化結(jié)節(jié)能力的細(xì)胞外，經(jīng)過(guò)不同細(xì)胞因子的誘導(dǎo)，還能夠分化為脂肪、骨、軟骨、肌肉、血管內(nèi)皮、肝、神經(jīng)等細(xì)胞系類(lèi)型。成功從離體的牙齒中提取出足夠量符合標(biāo)準(zhǔn)的牙髓干細(xì)胞，首先遇到的問(wèn)題就是離體牙齒保存的問(wèn)題?？谇画h(huán)境較其他組織環(huán)境不同，口腔內(nèi)的細(xì)菌數(shù)量很多，種類(lèi)相當(dāng)繁雜，離體牙齒保存不當(dāng)極易發(fā)生染菌，且牙齒內(nèi)細(xì)胞量較少，離體牙齒保存不當(dāng)也極易發(fā)生牙髓干細(xì)晌提取失敗的情況。文獻(xiàn)《六種保存液對(duì)牙周膜成纖維細(xì)胞活性的影響》(陳富波等，口腔材料器械，2012年第21卷第4期)中公開(kāi)了6種脫位牙的保存液，雖然該文獻(xiàn)研究?jī)?nèi)容是保存液對(duì)已提取的牙周膜成纖維細(xì)胞活性的影響，但是經(jīng)過(guò)試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，這6種脫位牙保存液無(wú)法對(duì)牙齒標(biāo)本提供有效的保護(hù)，存在易染菌和影響牙髓干細(xì)胞的問(wèn)題。中國(guó)專利CN104705289A公開(kāi)了一種離體牙齒保存液，每升保存液中有以下組分：青霉素0.3-0.6g、鏈霉素0.5-1g、甲硝唑0.02-0.04g、兩性霉素B0.015-0.025g、羥甲基纖維素5-10g、胰島素50-100μg，余量為MEM。上述保存液能夠有效保持牙髓干細(xì)胞的活性，并在一定程度上降低細(xì)菌污染，但是對(duì)于細(xì)菌污染的降低程度仍然不夠理想，需要提供更加優(yōu)異的保存液來(lái)加大對(duì)牙齒標(biāo)本的保護(hù)程度。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種牙齒標(biāo)本保存液及其應(yīng)用以及牙齒標(biāo)本保存方法，使得所述保存液能夠有效保護(hù)牙齒標(biāo)本，進(jìn)而保證牙齒中的牙髓干細(xì)胞活性，顯著降低細(xì)菌感染細(xì)胞的程度。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：一種牙齒標(biāo)本保存液，包括：氯化鈉、氯化鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、青霉素、鏈霉素和兩性霉素B。針對(duì)現(xiàn)有的牙齒保存液存在較大的細(xì)菌感染問(wèn)題，本發(fā)明調(diào)整了牙齒標(biāo)本保存液的組分，在保證牙齒中牙髓干細(xì)胞活性較高的前提下，顯著地降低了細(xì)胞感染細(xì)菌的程度。其中，所述保存液在具體實(shí)施過(guò)程中各組分濃度為：氯化鈉8g/L、氯化鉀0.2g/L、磷酸氫二鈉1.44g/L、磷酸二氫鉀0.24g/L、青霉素50U-500U/mL、鏈霉素50μg-500μg/mL和兩性霉素B0.5μg-5μg/mL，pH值7.2。進(jìn)一步優(yōu)選地，所述青霉素濃度為100U/mL，所述鏈霉素濃度為100μg/mL，所述兩性霉素B濃度為1μg/mL。同時(shí)，本發(fā)明還提供了所述保存液的制備方法，配制氯化鈉8g/L、氯化鉀0.2g/L、磷酸氫二鈉1.44g/L、磷酸二氫鉀0.24g/L的混合溶液，調(diào)pH值為7.2，滅菌后加入青霉素、鏈霉素以及兩性霉素B，使其終濃度分別為500U-50U/mL、500μg-50μg/mL、5μg-0.5μg/mL。在實(shí)際配制過(guò)程中，可以定容到1L來(lái)進(jìn)行配制。在本發(fā)明所述保存液與專利CN104705289A保存液的對(duì)比試驗(yàn)中，從本發(fā)明保存的牙齒中提取的牙髓干細(xì)胞活性和其相當(dāng)，但是細(xì)胞細(xì)菌污染的比例僅是10％，而現(xiàn)有保存液的比例是30％。此外，本發(fā)明還采用了《六種保存液對(duì)牙周膜成纖維細(xì)胞活性的影響》中牛奶、HBSS和DMEM高糖培養(yǎng)基3種脫位牙保存液進(jìn)行相同的試驗(yàn)，結(jié)果顯示這三種保存液在牙髓干細(xì)胞活性和細(xì)菌污染程度上都不及本發(fā)明保存液?；谏鲜龅募夹g(shù)效果，本發(fā)明提出了所述保存液在保存牙齒標(biāo)本、制備保存牙齒標(biāo)本的產(chǎn)品和/或?qū)ρ例X標(biāo)本消毒中的應(yīng)用。根據(jù)應(yīng)用，本發(fā)明提供了一種牙齒標(biāo)本的保存方法，將采集的牙齒標(biāo)本進(jìn)行消毒，然后放入到本發(fā)明所述的保存液中，在低溫環(huán)境下保存。其中，所述消毒為采用酒精或碘伏消毒，所述低溫為2-8℃，更優(yōu)選為4℃。由以上技術(shù)效果可知，本發(fā)明選擇氯化鈉、氯化鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、青霉素、鏈霉素和兩性霉素B組成一種新型的牙齒標(biāo)本保存液，相對(duì)于現(xiàn)有保存液，本發(fā)明保存液能提供更適合牙髓干細(xì)胞的生存環(huán)境，不影響其活性，同時(shí)極大地降低了細(xì)菌污染細(xì)胞的程度，無(wú)論從保存和運(yùn)輸都提供了有效保護(hù)。具體實(shí)施方式本發(fā)明實(shí)施例公開(kāi)了一種牙齒標(biāo)本保存液及其應(yīng)用以及牙齒標(biāo)本保存方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類(lèi)似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的產(chǎn)品、應(yīng)用和方法已經(jīng)通過(guò)較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對(duì)本文所述的產(chǎn)品、應(yīng)用及方法進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來(lái)實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。為了進(jìn)一步理解本發(fā)明，下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明提供的一種牙齒標(biāo)本保存液及其應(yīng)用以及牙齒標(biāo)本保存方法進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。實(shí)施例1：配制本發(fā)明所述保存液8g氯化鈉(NaCl)，0.2g氯化鉀(KCl)、1.44g磷酸氫二鈉(Na2HPO4)，0.24g磷酸二氫鉀(KH2PO4)，調(diào)pH7.2，定容1L；然后高壓蒸汽滅菌，取10mL溶液加入青霉素，使其終濃度為100U/mL，加入鏈霉素使其終濃度為100μg/mL,加入兩性霉素B，使其終濃度為1μg/ml，放置4℃?zhèn)溆?。?shí)施例2：配制本發(fā)明所述保存液8g氯化鈉(NaCl)，0.2g氯化鉀(KCl)、1.44g磷酸氫二鈉(Na2HPO4)，0.24g磷酸二氫鉀(KH2PO4)，調(diào)pH7.2，定容1L；然后高壓蒸汽滅菌，取10mL溶液加入青霉素，使其終濃度為50U/mL，加入鏈霉素使其終濃度為500μg/mL,加入兩性霉素B，使其終濃度為0.5μg/ml，放置4℃?zhèn)溆谩?shí)施例3：配制本發(fā)明所述保存液8g氯化鈉(NaCl)，0.2g氯化鉀(KCl)、1.44g磷酸氫二鈉(Na2HPO4)，0.24g磷酸二氫鉀(KH2PO4)，調(diào)pH7.2，定容1L；然后高壓蒸汽滅菌，取10mL溶液加入青霉素，使其終濃度為500U/mL，加入鏈霉素使其終濃度為50μg/mL,加入兩性霉素B，使其終濃度為5μg/ml，放置4℃?zhèn)溆?。?shí)施例4：對(duì)比試驗(yàn)1、牙齒標(biāo)本保存方法將采集的牙齒標(biāo)本進(jìn)行碘伏消毒，然后放入到保存液中，在4℃下保存72小時(shí)，所述牙齒取自18-30歲以內(nèi)無(wú)齲病、無(wú)釀炎的完整健康的智齒，大小差異不明顯。2、保存液本發(fā)明實(shí)施例1-3保存液、CN104705289A實(shí)施例1保存液、牛奶、HBSS和DMEM高糖培養(yǎng)基。3、牙髓干細(xì)胞提取方法將牙齒經(jīng)過(guò)碘伏消毒1min后，用PBS清洗2次。再用鉗子鉗開(kāi)牙齒，組織鑷取出牙髓。放置在0.3％I型膠原酶+0.4％分散酶消化30-60min后，以1200rpm離心10min中，用PBS清洗一次后，過(guò)100μm細(xì)胞篩，再次以1200rpm離心5min。用含10％胎牛血清，100U/ml青霉素及100μg/ml鏈霉素、1μg/ml兩性霉素B的DMEM/F12培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接種到25ml培養(yǎng)瓶中，在37℃，5％CO2培養(yǎng)，每2天換液一次，當(dāng)細(xì)胞待細(xì)胞達(dá)到匯合點(diǎn)(即細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底的70％-80％)時(shí)，用2.5g/L胰蛋白酶消化進(jìn)行傳代，按1:3傳代，第5代細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞活力檢測(cè)及取樣進(jìn)行微生物檢測(cè)。4、試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。表1不同保存液保存后牙髓干細(xì)胞活性和細(xì)菌污染細(xì)胞比例保存液細(xì)胞活力細(xì)菌污染細(xì)胞比例實(shí)施例190％±1.5％10％實(shí)施例291.5％±1％8％實(shí)施例393％±2％7％現(xiàn)有專利實(shí)施例192％±1％30％牛奶78％±4％45％HBSS85％±3％25％DMEM高糖培養(yǎng)基94％±2％34％由上表可知，本發(fā)明保存液和現(xiàn)有專利的保存液保存后的牙齒標(biāo)本，在分離的細(xì)胞活力上無(wú)明顯差異，但分離后的牙髓干細(xì)胞細(xì)菌污染比例本發(fā)明明顯低于現(xiàn)有專利，說(shuō)明現(xiàn)有專利保存液有利于細(xì)菌的增殖，而本發(fā)明保存液大大抑制了細(xì)菌增殖的趨勢(shì)，同時(shí)不損傷牙髓干細(xì)胞活性。雖然DMEM高糖培養(yǎng)基處理中牙髓干細(xì)胞的活性較高，但是其染菌細(xì)胞比例也是比較高的。而牛奶和HBSS無(wú)論在染菌方面和細(xì)胞活性方面都比較差。以上實(shí)施例的說(shuō)明只是用于幫助理解本發(fā)明的方法及其核心思想。應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行若干改進(jìn)和修飾，這些改進(jìn)和修飾也落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3