本發(fā)明涉及一種利用大理裂腹魚腎臟細(xì)胞系的構(gòu)建方法，屬淡水水生生物細(xì)胞培養(yǎng)和超低溫冷凍保存的技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

大理裂腹魚(Schizothorax taliensis)隸屬于鯉科裂腹魚亞科裂腹魚屬，原是洱海特產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)魚類，歷史上占洱海漁獲物30％。上世紀(jì)70年代由于洱海水位下降，數(shù)十條河溝、魚洞干涸，大理裂腹魚失去產(chǎn)卵場，且外來種的引入，大量吞食大理裂腹魚的魚卵，加之，酷魚濫捕使大理裂腹魚數(shù)量銳減。從中國科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所魚類標(biāo)本庫采集記錄看，自從1973年最后一次被采集后，已經(jīng)43年沒有發(fā)現(xiàn)大理裂腹魚，在學(xué)術(shù)界上一致認(rèn)為大理裂腹魚從大理洱海流域滅絕。大理裂腹魚1989年被列為國家II級保護(hù)動(dòng)物，在《中國瀕危動(dòng)物紅皮書(魚類)》中被列為瀕危等級，為保護(hù)這一珍稀物種地方政府制定了《洱海管理?xiàng)l例》。大理裂腹魚生活在靜水環(huán)境的中上層，食物以浮游生物為主，產(chǎn)卵時(shí)要求流水環(huán)境，每年4-5月繁殖季節(jié)，親魚溯水上游到沙礫底河床的河流或湖底地下水出口處產(chǎn)卵。卵需在流水中孵化。

為保護(hù)和了解大理裂腹魚的生存狀況，自上世紀(jì)九十年代以來，中國科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所多次組隊(duì)至大理洱海、西洱河、彌苴河等地開展調(diào)查，直至2016年5月才發(fā)現(xiàn)大理裂腹魚的蹤跡。但因大理裂腹魚種群數(shù)量較少，且不易獲得，因此，如何保護(hù)和保存這一珍稀魚類的種質(zhì)資源成為現(xiàn)今亟待解決的問題。塘養(yǎng)環(huán)境下，因培育時(shí)間太短，大理裂腹魚還不能實(shí)現(xiàn)人工繁殖，因此，通過保存其精子、卵子、胚胎、個(gè)體等來保存其種質(zhì)資源的方法已不可行，所以發(fā)明人將目光投向了大理裂腹魚的體細(xì)胞培養(yǎng)。

已知的脊椎動(dòng)物中48％是魚類，魚類細(xì)胞作為組織細(xì)胞模型，應(yīng)用于多門生物醫(yī)學(xué)學(xué)科，是巨大的資源寶庫。魚類細(xì)胞培養(yǎng)起于1962年，發(fā)展至今已建立了280余株細(xì)胞系，中國的魚類細(xì)胞培養(yǎng)歷經(jīng)30多年共建立魚類細(xì)胞系70余株，來源于40多種魚類，建立細(xì)胞系的物種不足中國魚類總數(shù)的1.5％(中國魚類超過3500種)。由此可見，細(xì)胞系的構(gòu)建速度是非常緩慢的，關(guān)注度不夠、參與的工作者較少可能是其原因之一；其次，相較于哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)，魚類細(xì)胞培養(yǎng)中更易發(fā)生污染，導(dǎo)致失敗率上升，而現(xiàn)有的專利或文章中大多將這一現(xiàn)象歸結(jié)為技術(shù)不過關(guān)，而嫌少注重魚體本身的質(zhì)量問題，在大理裂腹魚細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)踐中，魚體的生活狀態(tài)也直接影響了細(xì)胞系構(gòu)建的成??；另外，因大理裂腹魚野外生境的局限性，對其生活習(xí)性的了解較少，這也在一定程度上加大了大理裂腹魚細(xì)胞培養(yǎng)的難度。經(jīng)文獻(xiàn)檢索，未見與本發(fā)明的相同報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種操作簡便易行的大理裂腹魚腎臟細(xì)胞系的構(gòu)建方法，以滿足對大理裂腹魚種質(zhì)資源保存和高原適應(yīng)性研究的需要。

具體地，本發(fā)明提供一種大理裂腹魚腎臟細(xì)胞系的構(gòu)建方法，該構(gòu)建方法包括如下步驟：

1)大理裂腹魚腎臟的獲取：先用10-20mg/L的高錳酸鉀浸泡消毒大理裂腹魚魚體10-20分鐘，再用80-100ppm的MS-222麻醉大理裂腹魚魚體；再以75％酒精擦拭魚體后，取其腎臟，加入PBS消毒液清洗大理裂腹魚魚體的腎臟組織；

2)原代培養(yǎng)：將通過步驟1)獲得的腎臟組織剪成組織小塊，并將其接種于25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，在18-20℃培養(yǎng)箱中倒置過夜，次日再加入原代培養(yǎng)液，在18-20℃培養(yǎng)箱中啟動(dòng)原代培養(yǎng)，每三天半量更換培養(yǎng)液，第10-12天細(xì)胞開始從組織塊中遷移，30-40天長成細(xì)胞單層，則原代腎臟細(xì)胞；

3)傳代培養(yǎng)：原代腎臟細(xì)胞鋪滿瓶底80％后開始傳代，先吸出培養(yǎng)瓶中的原代培養(yǎng)液，以含0.1-0.2％的胰蛋白酶-EDTA的胰酶消化法傳代懸起細(xì)胞，加入傳代培養(yǎng)液1-2mL以中和胰酶反應(yīng)，首次傳代按1:1傳，此后按1:2進(jìn)行傳代，于18-20℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)；每5-7天傳代一次，傳至第10代時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)液換成基礎(chǔ)培養(yǎng)液，所述大理裂腹魚腎臟細(xì)胞系建立成功。

進(jìn)一步地，所述PBS消毒液為含有濃度為含有濃度為100-300IU/mL的青霉素、濃度為100-300μg/mL的鏈霉素以及濃度為20-40μg/mL的兩性霉素B的混合溶液。

進(jìn)一步地，所述的基礎(chǔ)培養(yǎng)液為含有濃度為6-10ng/mL的bFGF和占總體積的10-15％的胎牛血清的L-15或DMEM/F12培養(yǎng)液的混合溶液。

進(jìn)一步地，所述的原代培養(yǎng)液為含有濃度為6-10ng/mL的bFGF、占總體積的15-20％的胎牛血清、濃度為200-300IU/mL的青霉素、濃度為200-300μg/mL的鏈霉素以及濃度為20-40μg/mL的兩性霉素B的L-15或DMEM/F12培養(yǎng)液的混合溶液。

進(jìn)一步地，所述的傳代培養(yǎng)液為含有濃度為6-10ng/mL的bFGF、占總體積的15-20％的胎牛血清、濃度為100-200IU/mL的青霉素、濃度為100-200μg/mL的鏈霉素以及濃度為15-20μg/mL的兩性霉素B的L-15或DMEM/F12培養(yǎng)液。

進(jìn)一步地，所述原代培養(yǎng)液、傳代培養(yǎng)液和基礎(chǔ)培養(yǎng)液的pH值均為7.0-7.2。

進(jìn)一步地，所述原代培養(yǎng)液、傳代培養(yǎng)液和基礎(chǔ)培養(yǎng)液的滲透壓均為280-300mOsm/L。

進(jìn)一步地，所述構(gòu)建方法還包括如下細(xì)胞凍存與復(fù)蘇的步驟：1)配制細(xì)胞凍存液：凍存液包括L-15或DMEM/F12培養(yǎng)液、胎牛血清和DMSO，按3：6：1的體積比混合，現(xiàn)用現(xiàn)配；2)細(xì)胞凍存：取對數(shù)生長期的細(xì)胞，經(jīng)上述胰酶消化后，細(xì)胞懸液800-1200rpm離心6-10分鐘，棄掉上清液；向細(xì)胞沉淀中加入配制的細(xì)胞凍存液，重懸，使細(xì)胞的濃度約為1×10⁶個(gè)/mL，將1mL細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至1.8mL凍存管中，將凍存管置于程序降溫盒中，-80℃放置24-48小時(shí)，然后放入液氮中長期保存；3)細(xì)胞復(fù)蘇：將上述凍存管從液氮中取出，放入30℃水浴鍋中快速搖晃至融化；然后在無菌操作臺中，將解凍細(xì)胞轉(zhuǎn)移至15mL離心管中，并加入等量基礎(chǔ)培養(yǎng)液，800-1000rpm離心6-8分鐘，除上清液；用基礎(chǔ)培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，并轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，18-20℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，8-10天細(xì)胞即長成單層。

本發(fā)明的各步驟中所用的百分比為體積百分比。

本發(fā)明的顯著效果在于：

1.本發(fā)明的構(gòu)建方法操作簡便易行，并且構(gòu)建方法具有重復(fù)性，構(gòu)建的細(xì)胞系穩(wěn)定性好。

2.相對于用于核型分析的血液短期培養(yǎng)，采用本發(fā)明的構(gòu)建方法獲得的腎臟組織塊中剛遷移出來的細(xì)胞具有活性，且細(xì)胞量大，可用于染色體分析。

3.與其它細(xì)胞系相比，用本發(fā)明的構(gòu)建方法獲得的腎臟細(xì)胞系原代培養(yǎng)中組織塊污染率較低，從而提高了成功率。

4.本發(fā)明構(gòu)建的大理裂腹魚腎臟細(xì)胞系形態(tài)為成纖維樣，能夠連續(xù)傳代并直接應(yīng)用于生物學(xué)特性研究，滿足了對大理裂腹魚種質(zhì)資源保存和理論研究及應(yīng)用的需要。

5.用本發(fā)明的構(gòu)建方法獲得的大理裂腹魚腎臟細(xì)胞是大理裂腹魚的首個(gè)細(xì)胞系，為研究高原魚類對高原環(huán)境的適應(yīng)性提供了很好的素材，奠定了高原適應(yīng)性研究的基礎(chǔ)。

附圖說明

圖1是顯示大理裂腹魚原代培養(yǎng)中腎臟組織遷移出細(xì)胞的過程的圖。

圖2是顯示大理裂腹魚原代培養(yǎng)中腎臟細(xì)胞單層的圖。

圖3是示出不同消毒方式對大理裂腹魚腎臟組織塊細(xì)胞遷移的影響的圖。

圖4是示出不同培養(yǎng)液對大理裂腹魚腎臟細(xì)胞生長的影響的圖。

具體實(shí)施方式

從下文的詳細(xì)描述中，本發(fā)明的上述方面和本發(fā)明的其他方面將是明顯的。

實(shí)施例1

1.制備PBS消毒液和細(xì)胞培養(yǎng)液

PBS消毒液：向PBS中加入抗生素，使青霉素的濃度為300IU/mL，鏈霉素濃度為300μg/mL，兩性霉素B濃度為20μg/mL。

基礎(chǔ)培養(yǎng)液：向L-15培養(yǎng)液中加入bFGF和胎牛血清，使bFGF的濃度為10ng/mL，胎牛血清占總體積的20％。

原代培養(yǎng)液：向L-15培養(yǎng)液中加入bFGF、胎牛血清和抗生素，使bFGF的濃度為10ng/mL，胎牛血清占總體積的20％，青霉素的濃度為250IU/mL，鏈霉素濃度為250μg/mL，兩性霉素B濃度為40μg/mL。

傳代培養(yǎng)液：向L-15培養(yǎng)液中加入bFGF、胎牛血清和抗生素，使bFGF的濃度為10ng/mL，胎牛血清占總體積的20％，兩性霉素B濃度為20μg/mL。

調(diào)節(jié)上述培養(yǎng)液的pH值為7.0，滲透壓為300mOsm/L，放置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.原代培養(yǎng)

先用20mg/l的高錳酸鉀浸泡消毒大理裂腹魚魚體10分鐘，再用80ppm的MS-222麻醉大理裂腹魚。再以75％酒精擦拭魚體后，置于超凈工作臺中，用無菌解剖器械取其腎臟，置于12孔板中，用PBS消毒液清洗腎臟組織5次，剪成組織小塊，并將其接種于25cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，在18℃培養(yǎng)箱中倒置過夜，次日再加入原代培養(yǎng)液3mL，在18℃培養(yǎng)箱中啟動(dòng)原代培養(yǎng)，每三天半量更換培養(yǎng)液，第11天細(xì)胞開始從組織塊中遷移(圖1)，40天長成細(xì)胞單層(圖2)。

3.傳代培養(yǎng)

原代腎臟細(xì)胞鋪滿瓶底80％后開始傳代。傳代培養(yǎng)具體方法如下：先吸出培養(yǎng)瓶中的原代培養(yǎng)液，加入0.15％的胰蛋白酶-EDTA溶液2mL，消化3分鐘，細(xì)胞變圓后，加入傳代培養(yǎng)液2mL以中和胰酶反應(yīng)，輕輕吹打瓶底，使貼壁細(xì)胞脫落，首次傳代按1:1傳，此后按1:2進(jìn)行傳代，于18℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)；每6天傳代一次，傳至第10代時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)液換成基礎(chǔ)培養(yǎng)液，此時(shí)，細(xì)胞系建立成功。

4.細(xì)胞凍存與復(fù)蘇

(a)配制細(xì)胞凍存保護(hù)液：凍存液包括L-15培養(yǎng)液、胎牛血清和DMSO，按3：6：1的體積比混合，現(xiàn)用現(xiàn)配。

(b)細(xì)胞凍存：取對數(shù)生長期的細(xì)胞，經(jīng)上述胰酶消化后，細(xì)胞懸液800rpm離心10分鐘，棄掉上清液。向細(xì)胞沉淀中加入配制的細(xì)胞凍存液，重懸，使細(xì)胞的濃度約為1×10⁶個(gè)/mL，將1mL細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至1.8mL凍存管中，將凍存管置于程序降溫盒中，-80℃放置24小時(shí)，然后放入液氮中長期保存。

(c)細(xì)胞復(fù)蘇：將上述凍存管從液氮中取出，放入30℃水浴鍋中快速搖晃至融化。然后在無菌操作臺中，將解凍細(xì)胞轉(zhuǎn)移至15mL離心管中，并加入等量基礎(chǔ)培養(yǎng)液，800rpm離心8分鐘，除上清液。用基礎(chǔ)培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，并轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，18℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，9天細(xì)胞即長成單層。

實(shí)施例2

1.制備PBS消毒液和細(xì)胞培養(yǎng)液

PBS消毒液：向PBS中加入抗生素，使青霉素的濃度為250IU/mL，鏈霉素濃度為250μg/mL，兩性霉素B濃度為30μg/mL。

基礎(chǔ)培養(yǎng)液：向DMEM/F12培養(yǎng)液中加入bFGF和胎牛血清，使bFGF的濃度為10ng/mL，胎牛血清占總體積的15％。

原代培養(yǎng)液：向DMEM/F12培養(yǎng)液中加入bFGF、胎牛血清和抗生素，使bFGF的濃度為10ng/mL，胎牛血清占總體積的15％，青霉素的濃度為200IU/mL，鏈霉素濃度為200μg/mL，兩性霉素B濃度為30μg/mL。

傳代培養(yǎng)液：向DMEM/F12培養(yǎng)液中加入bFGF、胎牛血清和抗生素，使bFGF的濃度為10ng/mL，胎牛血清占總體積的15％，兩性霉素B濃度為20μg/mL。

調(diào)節(jié)上述培養(yǎng)液的pH值為7.0，滲透壓為300mOsm/L，放置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.原代培養(yǎng)

先用10mg/l的高錳酸鉀浸泡消毒大理裂腹魚魚體20分鐘，再用100ppm的MS-222麻醉大理裂腹魚。再以75％酒精擦拭魚體后，置于超凈工作臺中，用無菌解剖器械取其腎臟，置于12孔板中，將腎臟組織用PBS消毒液清洗3次，剪成組織小塊，并將其接種于25cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，在20℃培養(yǎng)箱中倒置過夜，次日再加入原代培養(yǎng)液5mL，在20℃培養(yǎng)箱中啟動(dòng)原代培養(yǎng)，每三天半量更換培養(yǎng)液，第10天細(xì)胞開始從組織塊中遷移，35天長成細(xì)胞單層。

3.傳代培養(yǎng)

原代腎臟細(xì)胞鋪滿瓶底80％后開始傳代。傳代培養(yǎng)具體方法如下：先吸出培養(yǎng)瓶中的原代培養(yǎng)液，加入0.2％的胰蛋白酶-EDTA溶液1mL，消化2分鐘，細(xì)胞變圓后，加入傳代培養(yǎng)液1.5mL以中和胰酶反應(yīng)，輕輕吹打瓶底，使貼壁細(xì)胞脫落，首次傳代按1:1傳，此后按1:2進(jìn)行傳代，于20℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)；每5天傳代一次，傳至第10代時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)液換成基礎(chǔ)培養(yǎng)液，此時(shí)，細(xì)胞系建立成功。

4.細(xì)胞凍存與復(fù)蘇

(a)配制細(xì)胞凍存保護(hù)液：凍存液包括DMEM/F12培養(yǎng)液、胎牛血清和DMSO，按3：6：1的體積比混合，現(xiàn)用現(xiàn)配。

(b)細(xì)胞凍存：取對數(shù)生長期的細(xì)胞，經(jīng)上述胰酶消化后，細(xì)胞懸液1200rpm離心6分鐘，棄掉上清液。向細(xì)胞沉淀中加入配制的細(xì)胞凍存液，重懸，使細(xì)胞的濃度約為1×10⁶個(gè)/mL，將1mL細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至1.8mL凍存管中，將凍存管置于程序降溫盒中，-80℃放置48小時(shí)，然后放入液氮中長期保存。

(c)細(xì)胞復(fù)蘇：將上述凍存管從液氮中取出，放入30℃水浴鍋中快速搖晃至融化。然后在無菌操作臺中，將解凍細(xì)胞轉(zhuǎn)移至15mL離心管中，并加入等量基礎(chǔ)培養(yǎng)液，1000rpm離心6分鐘，除上清液。用基礎(chǔ)培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，并轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，20℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，6天細(xì)胞即長成單層。

實(shí)施例3

1.制備PBS消毒液和細(xì)胞培養(yǎng)液

PBS消毒液：向PBS中加入抗生素，使青霉素的濃度為200IU/mL，鏈霉素濃度為200μg/mL，兩性霉素B濃度為40μg/mL。

基礎(chǔ)培養(yǎng)液：向L-15培養(yǎng)液中加入bFGF和胎牛血清，使bFGF的濃度為400μg/mL，胎牛血清占總體積的10％。

原代培養(yǎng)液：向L-15培養(yǎng)液中加入bFGF、胎牛血清和抗生素，使bFGF的濃度為8ng/mL，胎牛血清占總體積的15％，青霉素的濃度為200IU/mL，鏈霉素濃度為200μg/mL，兩性霉素B濃度為20μg/mL。

傳代培養(yǎng)液：向L-15培養(yǎng)液中加入bFGF、胎牛血清和抗生素，使bFGF的濃度為8ng/mL，胎牛血清占總體積的10％，兩性霉素B濃度為30μg/mL。

調(diào)節(jié)上述培養(yǎng)液的pH值為7.0，滲透壓為300mOsm/l，放置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.原代培養(yǎng)

先用15mg/l的青霉素浸泡消毒大理裂腹魚魚體15分鐘，再用100ppm的MS-222麻醉大理裂腹魚。再以75％酒精擦拭魚體后，置于超凈工作臺中，用無菌解剖器械取其腎臟，置于12孔板中，將腎臟組織用PBS消毒液清洗4次，剪成組織小塊，并將其接種于25cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，在18℃培養(yǎng)箱中倒置過夜，次日再加入原代培養(yǎng)液4mL，在18℃培養(yǎng)箱中啟動(dòng)原代培養(yǎng)，每三天半量更換培養(yǎng)液，第11天細(xì)胞開始從組織塊中遷移，35天長成細(xì)胞單層。

3.傳代培養(yǎng)

原代腎臟細(xì)胞鋪滿瓶底80％后開始傳代。傳代培養(yǎng)具體方法如下，先吸出培養(yǎng)瓶中的原代培養(yǎng)液，加入0.15％的胰蛋白酶-EDTA溶液1.5mL，消化2分鐘，細(xì)胞變圓后，加入傳代培養(yǎng)液1.5mL以中和胰酶反應(yīng)，輕輕吹打瓶底，使貼壁細(xì)胞脫落，首次傳代按1:1傳，此后按1:2進(jìn)行傳代，于18℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)；每5天傳代一次，傳至第10代時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)液換成基礎(chǔ)培養(yǎng)液，此時(shí)，細(xì)胞系建立成功。

4.細(xì)胞凍存與復(fù)蘇

(a)配制細(xì)胞凍存保護(hù)液：凍存液包括L-15培養(yǎng)液、胎牛血清和DMSO，按3：6：1的體積比混合，現(xiàn)用現(xiàn)配。

(b)細(xì)胞凍存：取對數(shù)生長期的細(xì)胞，經(jīng)上述胰酶消化后，細(xì)胞懸液1000rpm離心8分鐘，棄掉上清液。向細(xì)胞沉淀中加入配制的細(xì)胞凍存液，重懸，使細(xì)胞的濃度約為1×10⁶個(gè)/mL，將1mL細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至1.8mL凍存管中，將凍存管置于程序降溫盒中，-80℃放置36小時(shí)，然后放入液氮中長期保存。

(c)細(xì)胞復(fù)蘇：將上述凍存管從液氮中取出，放入37℃水浴鍋中快速搖晃至融化。然后在無菌操作臺中，將解凍細(xì)胞轉(zhuǎn)移至15mL離心管中，并加入等量基礎(chǔ)培養(yǎng)液，800rpm離心8分鐘，除上清液。用基礎(chǔ)培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，并轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，18℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，8天細(xì)胞即長成單層。

實(shí)施例4

對實(shí)施例3的大理裂腹魚的魚體采用不同消毒方法進(jìn)行比較。

將實(shí)施例3中的大理裂腹魚分別采用最常見的高錳酸鉀浸泡消毒、亞甲基藍(lán)浸泡消毒、酒精直接消毒、亞甲基藍(lán)+酒精聯(lián)合消毒和高錳酸鉀+酒精聯(lián)合消毒的方式，其他步驟與實(shí)施例3中的步驟相同。結(jié)果顯示(參見圖1)，在整個(gè)原代培養(yǎng)過程中，亞甲基藍(lán)浸泡消毒和亞甲基藍(lán)+酒精聯(lián)合消毒都表現(xiàn)出較低的組織塊細(xì)胞遷移率，且隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加，某些遷移出細(xì)胞的組織塊會脫落而不會再重新貼壁遷移出細(xì)胞；在原代培養(yǎng)的初期，高錳酸鉀浸泡消毒和酒精直接消毒表現(xiàn)出較高的組織細(xì)胞遷移率，但隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，出現(xiàn)了組織塊污染的情況，導(dǎo)致組織塊脫落，無法挽救；高錳酸鉀+酒精聯(lián)合作用下，組織塊表現(xiàn)出較高的細(xì)胞遷移率，且隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，遷移出細(xì)胞的組織塊越來越多，脫落的組織塊較少。

因此，對于大理裂腹魚而言，亞甲基藍(lán)的毒性較大，無論亞甲基藍(lán)浸泡消毒還是亞甲基藍(lán)+酒精聯(lián)合消毒，雖能保證組織塊不發(fā)生污染，但對組織塊的損傷較大，細(xì)胞不易遷出，而酒精直接消毒和高錳酸鉀浸泡消毒往往發(fā)生污染，培養(yǎng)無法繼續(xù)，高猛酸鉀+酒精聯(lián)合消毒的方式是更為適合的。

實(shí)施例5

對實(shí)施例3的細(xì)胞培養(yǎng)液的基液采用不同的培養(yǎng)液進(jìn)行比較。

將實(shí)施例3中的培養(yǎng)液替換成魚類細(xì)胞培養(yǎng)常用的幾種培養(yǎng)液DMEM、DMEM(高糖)、DMEM/F12、L-15、M199、M1640，對比這些不同培養(yǎng)液對大理裂腹魚腎臟細(xì)胞生長的影響(參見圖2)，結(jié)果顯示，不同培養(yǎng)液條件下，細(xì)胞的生長速率不同，貼壁率也不同。細(xì)胞培養(yǎng)1天后，L-15和DMEM/F12的貼壁細(xì)胞較多，而DMEM、DMEM(高糖)、M199和M1640培養(yǎng)液貼壁的細(xì)胞較少；隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，L-15和DMEM/F12的細(xì)胞數(shù)量逐漸增加，L-15的細(xì)胞數(shù)量高于DMEM/F12；L-15的細(xì)胞數(shù)量約為DMEM、DMEM(高糖)和M199細(xì)胞數(shù)量的兩倍；M1640為培養(yǎng)液時(shí)，細(xì)胞數(shù)量雖略有增加，但一直維持在較低水平。

因此，對于大理裂腹魚腎臟細(xì)胞而言，L-15的效果最好，其次是DMEM/F12，其他四種培養(yǎng)液并不適合細(xì)胞生長。

本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)明了，盡管為了舉例說明的目的，本文描述了本發(fā)明的具體實(shí)施方式，但可以對其進(jìn)行各種修改而不偏離本發(fā)明的精神和范圍。因此，本發(fā)明的具體實(shí)施方式和實(shí)施例不應(yīng)當(dāng)視為限制本發(fā)明的范圍。本發(fā)明僅受所附權(quán)利要求的限制。本申請中引用的所有文獻(xiàn)均完整地并入本文作為參考。