本發(fā)明涉及哺乳動物精液冷凍保存劑，具體涉及番茄紅素與α-硫辛酸配伍作為哺乳動物精液冷凍保存劑的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
哺乳動物精液的冷凍保存技術(shù)被廣泛應(yīng)用于動物生產(chǎn)，成為優(yōu)良家畜品種高效繁育、加快雜交改良的重要手段；同時也為動物胚胎移植、體外受精等提供了不受時間和空間限制的材料。但是，目前精液冷凍過程中普遍存在的對精子的物理性損傷、化學(xué)性損傷和氧化應(yīng)激損傷等，大大降低了精液冷凍保存效果。在精液的冷凍保存過程中，有必要在冷凍稀釋液中添加外源的抗氧化保護劑，以減少ROS對精子質(zhì)膜的氧化損傷。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于，提供一種用于哺乳動物精子低損傷冷凍保存的稀釋液。
本發(fā)明以番茄紅素和α-硫辛酸作為哺乳動物精液的冷凍稀釋液的組分，以冷凍保存后山羊精子活率、質(zhì)膜完整率、頂體完整率、線粒體活性以及SOD、CAT、GSH-Px等抗氧化酶活性等作為評定指標，并探究番茄紅素和α-硫辛酸的最佳配伍濃度，以保持哺乳動物精子在冷凍-解凍后具有良好的生理活性。
本發(fā)明同時還提供了包含番茄紅素與α-硫辛酸的哺乳動物精液的冷凍稀釋液。
進一步，本發(fā)明的哺乳動物精液的冷凍稀釋液組分為：每100mL所述哺乳動物精液的冷凍稀釋液的配方為：Tris 3.25g，檸檬酸1.74g，果糖1.14g，青霉素200000IU，鏈霉素100000IU，卵黃15mL，甘油5mL，番茄紅素100mg，α-硫辛酸0.5mg,其余為水。
另一種方案中，本發(fā)明的哺乳動物精液的冷凍稀釋液組分為：每100mL所述哺乳動物精液的冷凍稀釋液的配方為：Tris 3.25g，檸檬酸1.74g，果糖1.14g，青霉素200000IU，鏈霉素100000IU，卵黃15mL，番茄紅素100mg，α-硫辛酸0.5mg,其余為水。
本發(fā)明的哺乳動物精液的冷凍稀釋液配方，由于采用了番茄紅素和α-硫辛酸，能夠在哺乳動物精液的冷凍-解凍過程中很好地保護哺乳動物精子的生理活性。
附圖說明
圖1為番茄紅素和α-硫辛酸配伍對山羊精液凍后SOD(A圖)、CAT(B圖)及GSH-Px(C圖)活性的影響。
具體實施方式
以下結(jié)合具體實施例，對本發(fā)明進行進一步的詳細說明。
實施例：
按照本發(fā)明的技術(shù)方案，本實施例給出六組用于哺乳動物精液冷凍保存的番茄紅素與α-硫辛酸配伍的稀釋液配方，分別稱取0mg、50mg、100mg番茄紅素和0mg、0.5mg、1mgα-硫辛酸，兩者按照表1所示進行配伍，其他成分根據(jù)表2其所占的比例稱取。
表1番茄紅素與α-硫辛酸配伍方案
表2番茄紅素與α-硫辛酸配伍稀釋液配方(每100ml)
注：青鏈霉素雙抗在冷凍保護前單獨添加。
上述實施例中哺乳動物精液的冷凍保存稀釋液用于哺乳動物精液的冷凍-解凍的方法，按下列步驟實施：
(1)檢測合格后，按照精液：冷凍稀釋I液為1:2的比例將精液稀釋，加入含有不同濃度番茄紅素和α-硫辛酸的冷凍稀釋I液，放置于4℃冰箱中降溫平衡2h；
(2)將第一次稀釋和平衡后的精液按照1:2的比例加入等溫(4℃)的冷凍稀釋II液進一步稀釋，4℃冰箱中平衡1.5h；
(3)以1℃/min的速率從5℃降至-5℃，將細管置于液氮面上方2～3cm處達6～8min，然后將細管投入液氮中冷凍保存；
(4)冷凍14d后，在37℃水浴鍋中解凍30s，測定凍后精子活率、頂體完整率、質(zhì)膜完整率、線粒體活性及抗氧化酶(SOD、CAT、GSH-Px)的活性值。
番茄紅素與α-硫辛酸按照表2配伍方案添加，同一配方下，除甘油之外的其他試劑的混合液為冷凍稀釋I液，所有試劑(包含甘油)的混合液為冷凍稀釋II液。
試驗冷凍所用的山羊精液來自榆林陜北白絨山羊試驗基地。采用假陰道法采集種公羊精液，進行常規(guī)品質(zhì)檢查，精子活力達到0.8以上方可用于冷凍保存，在lh內(nèi)運回實驗室。
將檢測合格后的精液按照1:2的比例加入冷凍稀釋I液，經(jīng)多層紗布包裹后，放置于4℃冰箱中降溫平衡2h。然后將第一次稀釋和平衡后的精液按照1:2的比例加入等溫的(4℃)的冷凍稀釋II液進一步稀釋，使精液與稀釋液的最終比例為1:4，經(jīng)多層紗布包裹后，4℃冰箱中平衡1.5h。裝管后，將細管放入程序冷凍儀中控制其以1℃/min的速率從5℃降至-5℃，再將其置于液氮面上方2～3cm熏蒸6～8min，最后將細管投入液氮中冷凍保存。
保存14d后將冷凍細管投入37℃水浴中解凍30s。常溫環(huán)境下，在400×光學(xué)顯微鏡下觀察并統(tǒng)計呈直線運動的精子數(shù)，計算精子活率(表3)。
采用異硫氰酸酯熒光素標記的花生凝集素(FITC-PNA)染色的方法檢測精子頂體完整率，即將30μL精液樣品均勻涂抹于載玻片上，待自然干燥后，甲醇固定10min，然后加入10μL FITC-PNA染液，37℃潮濕環(huán)境下避光孵育30min，PBS沖洗2次，空氣干燥，用無色指甲油封片，在熒光顯微鏡下觀察并計算精子頂體完整率(表3)。
采用低滲腫脹試驗(HOST)檢測精子質(zhì)膜完整率，即取20μL解凍孵育后的精液樣品加入等溫HOST低滲溶液200μL混勻，37℃孵育1h后取10μL均勻涂抹于載玻片上，在400×倒置顯微鏡下觀察5個視野，計算精子彎尾率(表3)。
精子線粒體活性的檢測，即將1μL碘化丙啶(PI)貯存液和1μL羅丹明123(Rh123)貯存液混合后避光培養(yǎng)10min，將解凍后的精液用精液稀釋I液稀釋，吸取50μL加入上述避光培養(yǎng)的PI和Rh123混合液，培養(yǎng)30min，取10μL樣品制片，然后在400×倒置顯微鏡下觀察并計算精子線粒體活性(表3)。
按照南京建成生物科技公司所提供的試劑盒說明書對精液中超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)等酶的活性進行檢測(圖1)，并將測得數(shù)據(jù)代入相關(guān)公式準確計算，所有結(jié)果均用平均值±標準差表示。
表3聯(lián)合添加番茄紅素和α-硫辛酸對山羊精液冷凍效果的影響
根據(jù)以上操作步驟，測定得到凍存14d后的山羊精子活率、頂體完整率、質(zhì)膜完整率、線粒體活性及抗氧化酶(SOD、CAT、GSH-Px)活性。
應(yīng)當(dāng)理解的是，對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說，可根據(jù)上述說明加以改進或變換，而所有這些改進和變換都應(yīng)屬于本發(fā)明所附權(quán)利要求的保護范圍。