本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)生物防治與微生物制劑應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種防治油菜菌核病的復(fù)合微生物制劑及其制備方法。
背景技術(shù)：
：油菜是我國重要的油料作物，由核盤菌引起的油菜菌核病是世界范圍內(nèi)的一種重要病害，在我國發(fā)生普遍且危害嚴(yán)重，一般年份發(fā)病率為10%-30%，嚴(yán)重年份或嚴(yán)重地塊的發(fā)病率達(dá)80%以上，導(dǎo)致嚴(yán)重減產(chǎn)和品質(zhì)下降。由于核盤菌具有：（1)可以在土壤中頑固存活，而且極易在土壤中積累；(2)寄主范圍極廣；(3)菌核在條件適宜時(shí)可以萌發(fā)形成菌絲體，菌絲體或侵染苗期作物或利用土壤中的營養(yǎng)進(jìn)行生長，并形成更多的菌核，一個(gè)菌核可以產(chǎn)生很多子囊盤，在春季田間菌核萌發(fā)持續(xù)時(shí)間長達(dá)50d等特點(diǎn)，因此在生產(chǎn)上采取推廣抗(耐)作物品種、農(nóng)業(yè)防治和化學(xué)防治的措施。推廣抗病品種是植物病害防治中最為經(jīng)濟(jì)有效的措施之一，但是油菜對菌核病不表現(xiàn)垂直杭性，目前還沒有有效的抗病品種問世。因此，長期以來，對該病的防治主要采取花期對地上部部噴施化學(xué)藥劑，但防治效果并不穩(wěn)定。除此之外，長期大量使用農(nóng)藥，存在嚴(yán)重的遺留問題：第一，在核盤菌群體中出現(xiàn)了抗藥性菌株，如潘以樓(1998)報(bào)道核盤菌群體中己出現(xiàn)了對多菌靈高抗的菌株；第二，污染環(huán)境和為害人類健康。鑒于上述原因，20世紀(jì)80年代以來人們逐漸把目光投向了生物防治.目前，油菜菌核病的生物防治以活體微生物或其代謝產(chǎn)物控制核盤菌的研究較多，己有的研究結(jié)果表明，許多土壤、葉圍、根圍及內(nèi)生微生物甚至包括一些植物病原物對核盤菌均有一定程度的抑制作用。據(jù)報(bào)道現(xiàn)在己知有30多種以上的真菌、細(xì)菌或其它微生物對核盤菌具有寄生或拮抗作用，己發(fā)現(xiàn)對核盤菌具有拮抗作用的微生物包括：青霉、鳥巢菌、假單胞桿菌、芽抱桿菌、毛霉、輪枝菌、筍頂孢、單孢枝霉、淡紫擬青霉、紫色附球菌等。重寄生真菌包括:盾殼霉、木霉、粘帚霉、食菌核甚孢霉、和黃色蠕形霉等等。對該病害生物防治的多數(shù)研究主要集中在木霉、粘帚霉、盾殼霉等屬的一些真菌種類，如羅寬等研究了南方油菜土壤中油菜菌核病菌菌核上的寄生真菌，發(fā)現(xiàn)木霉菌為優(yōu)勢種群，且綠色木霉Tv36等菌株在室內(nèi)對菌核有90%以上的寄生腐爛。廖曉蘭等報(bào)道了將木霉制劑施于油菜地，田間可減輕病害50%左右。也有報(bào)道用粘帚霉處理土壤后產(chǎn)生的菌核數(shù)比自然土壤少，并且測定了木霉、粘帚霉、盾殼霉及2個(gè)鐮刀菌菌株對核盤菌菌絲體、子囊飽子產(chǎn)生以及菌核產(chǎn)生數(shù)量的影響，發(fā)現(xiàn)盾殼霉、綠粘帚霉、哈茨木霉完全能控制核盤菌產(chǎn)生子囊盤，而粉紅枯帚霉對其只起輕微作用。此外，皿內(nèi)和田間試驗(yàn)結(jié)果表明，細(xì)菌對油菜菌核病也具有一定的抑制作用和防治效果。李國慶自腐爛菌核和油菜等七種植物地上部分健康組織表面分離到31株對油菜菌核病菌有抑制作用的細(xì)菌菌株。廖曉蘭于油菜初花期和盛花期從花瓣和花藥上分離并篩選到6株對核盤菌有抑制作用的拮抗細(xì)菌，初步鑒定為芽孢桿菌。陳士云等從土壤中分離到一株解淀粉芽孢桿菌，能夠抑制油菜核盤菌菌核形成。吳健勝等篩選到1株對草酸具有很強(qiáng)解毒活性的菌株，能夠防治油菜菌核病。綜上所述，對于油菜菌核病生物防治的研究報(bào)道很多，但是從研究現(xiàn)狀來看依然存在一些問題。如，在所報(bào)道的大最生防菌中，大部分研究內(nèi)容僅限于皿內(nèi)試驗(yàn)、活體生測及少量的小區(qū)防病試驗(yàn)，研究結(jié)果仍然停留在實(shí)驗(yàn)室階段，很少有關(guān)于將其廣泛應(yīng)用于田間大面積病害防治的報(bào)道；對于利用生防細(xì)菌防治該病害的研究主要為單一菌株的防治試驗(yàn)，但是，由于病原菌的多樣性和同步進(jìn)化特性，現(xiàn)有的單一拮抗菌株由于其作用方式單一、防治效果不穩(wěn)定、生產(chǎn)和使用也無法達(dá)到很理想的防治效果，因此，生防菌的很多生物功能需要依靠兩株或兩株以上的細(xì)菌間的協(xié)同作用，才能發(fā)揮出更好的作用。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的第一目的在于提供一種防治油菜菌核病的復(fù)合微生物制劑。該復(fù)合微生物制劑的原料配比為：拒霉素鏈霉菌發(fā)酵液20-40份，不枝鏈霉菌發(fā)酵液10-30份，特基拉芽孢桿菌發(fā)酵液20-40份，西姆芽孢桿菌發(fā)酵液10-30份，子座木霉發(fā)酵液20-40份。在所述微生物制劑中的拒霉素鏈霉菌，不枝鏈霉菌，特基拉芽孢桿菌，西姆芽孢桿菌，子座木霉等5種菌是從400多株微生物菌株中篩選得到的能共生共存，能產(chǎn)生多種抗菌素如拒霉素，醋霉素和大環(huán)內(nèi)酯菌素，能對油菜菌核病病原菌--核盤菌產(chǎn)生超強(qiáng)抑制效果，從而達(dá)到超強(qiáng)防治油菜菌核病的作用；另一方面，本發(fā)明的菌種能夠全面的利用微生物種間或種內(nèi)的抗生、競爭、重寄生、溶菌作用，以及通過次級代謝產(chǎn)物誘導(dǎo)油菜產(chǎn)生抗病性，增強(qiáng)其防病效果；再次，本發(fā)明中所使用的這5株菌株都是可從土壤中直接分離得到，都具有根跡促生作用，可在作物表面、植株內(nèi)部或土壤中繁殖生長的同時(shí)，并定向植物根際分泌某些次生代謝產(chǎn)物，能夠提高植物對養(yǎng)分的吸收、刺激植株生長起到肥料的效果；本發(fā)明的第二目的在于提供一種防治油菜菌核病的復(fù)合微生物制劑的制備方法，該方法步驟簡單，確保微生物制劑的藥肥效果突出。為了達(dá)到上述目的，該防治油菜菌核病的復(fù)合微生物制劑的制備方法，包括以下步驟：步驟一：拒霉素鏈霉菌發(fā)酵液的制備取出拒霉素鏈霉菌菌種保藏管，用高氏一號(hào)固體培養(yǎng)基劃平板進(jìn)行復(fù)蘇，30℃培養(yǎng)7天。在平板下挑取單個(gè)菌落劃線接種裝有150毫升高氏一號(hào)固體培養(yǎng)基的茄子瓶中，在培養(yǎng)箱中30℃培養(yǎng)6-8天，待菌苔長滿茄子瓶，產(chǎn)生大量孢子粉即可用500毫升的無菌生理鹽水洗脫，調(diào)節(jié)孢子濃度為0.1億cfu/ml，即為拒霉素鏈霉菌種子液；發(fā)酵：將上述制備的拒霉素鏈霉菌種子液以1%的接種量接種至裝有滅菌的600L的拒霉素鏈霉菌發(fā)酵培養(yǎng)基的1000L發(fā)酵罐中，控溫28-32℃，前24小時(shí)，通氣量為每分鐘為200L空氣，24-36小時(shí)，通氣量為400L，36小時(shí)后，通氣量為600L，開攪拌200r/min，培養(yǎng)40-48小時(shí)，待菌體含量達(dá)到60g/L，即可停罐，即得到拒霉素鏈霉菌發(fā)酵液；其中，所述的高氏一號(hào)固體培養(yǎng)基：硝酸鉀：1克，可溶性淀粉：20克，磷酸氫二鉀：0﹒5克，硫酸鎂：0﹒5克，氯化鈉：0﹒5克，硫酸亞鐵：0﹒01克，瓊脂：20克，蒸餾水補(bǔ)足1000ml，PH7﹒2～7﹒4；其中，所述的拒霉素鏈霉菌發(fā)酵培養(yǎng)基：菜粕粉3%，玉米淀粉1%，石粉1%，大豆糖蜜2%，磷酸氫二鉀0.04%，硫酸鎂0.05%，各培養(yǎng)基滅菌的條件為：0.10-0.15MPa，121℃滅菌30分鐘。步驟二：不枝鏈霉菌發(fā)酵液的制備取出不枝鏈霉菌菌種保藏管，用高氏一號(hào)固體培養(yǎng)基劃平板進(jìn)行復(fù)蘇，30℃培養(yǎng)7天。在平板下挑取單個(gè)菌落劃線接種裝有150毫升高氏一號(hào)固體培養(yǎng)基的茄子瓶中，在培養(yǎng)箱中30℃培養(yǎng)6-8天，待菌苔長滿茄子瓶，產(chǎn)生大量孢子粉即可用500毫升的無菌生理鹽水洗脫，調(diào)節(jié)孢子濃度為0.1億cfu/ml，即為不枝鏈霉菌種子液；發(fā)酵：將上述制備的不枝鏈霉菌種子液以1%的接種量接種至裝有滅菌的600L的不枝鏈霉菌發(fā)酵培養(yǎng)基的1000L發(fā)酵罐中，控溫28-30℃，前18小時(shí)，通氣量為每分鐘為300L空氣，18-32小時(shí)，通氣量為500L，32小時(shí)后，通氣量為700L，開攪拌200r/min，培養(yǎng)40-48小時(shí)，待菌體含量達(dá)到80g/L，即可停罐，即得到不枝鏈霉菌發(fā)酵液；其中，所述的高氏一號(hào)固體培養(yǎng)基：硝酸鉀：1克，可溶性淀粉：20克，磷酸氫二鉀：0﹒5克，硫酸鎂：0﹒5克，氯化鈉：0﹒5克，硫酸亞鐵：0﹒01克，瓊脂：20克，蒸餾水補(bǔ)足1000ml，PH7﹒2～7﹒4；其中，所述的不枝鏈霉菌發(fā)酵培養(yǎng)基：豆粉3%，棉粕粉1%，玉米淀粉2%，石粉1%，甘蔗糖蜜2%，硫酸錳0.002%，磷酸氫二鉀0.01%，硫酸鎂0.02%，各培養(yǎng)基滅菌的條件為：0.10-0.15MPa，121℃滅菌30分鐘。步驟三，特基拉芽孢桿菌發(fā)酵液的制備取出特基拉芽孢桿菌保藏管，用LB固體培養(yǎng)基分別劃平板進(jìn)行復(fù)蘇，30℃培養(yǎng)48小時(shí)。在平板下挑取單個(gè)菌落接種至裝有LB固體培養(yǎng)基，在30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)，用3000ml無菌水將三個(gè)茄子瓶中的菌苔洗脫，接種至裝有300L特基拉芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基的500L發(fā)酵罐中，開攪拌120r/min，前12小時(shí)通氣量為200L/min，12小時(shí)后通氣量為320L/min，30℃培養(yǎng)26-36小時(shí)，待總芽孢含量不低于40億cfu/ml，即可作為特基拉芽孢桿菌發(fā)酵液；其中，所述LB固體培養(yǎng)基：酵母提取物5.0g,蛋白胨10.0，NaCl10.0g，瓊脂20g，水1000mL，pH7.2；其中，所述特基拉芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖5g/L，木薯淀粉25g/L，花生粕粉30g/L，玉米漿干粉5g/L，硫酸鎂0.4g/L，硫酸錳0.5g/L，磷酸二氫鉀0.5g/L，碳酸鈣5g/L，pH7.0。各培養(yǎng)基滅菌的條件為：0.10-0.15MPa，121℃滅菌30分鐘。步驟四，西姆芽孢桿菌發(fā)酵液的制備取出西姆芽孢桿菌保藏管，用營養(yǎng)肉湯固體培養(yǎng)基分別劃平板進(jìn)行復(fù)蘇，30℃培養(yǎng)48小時(shí)。在平板下挑取單個(gè)菌落接種至裝有營養(yǎng)肉湯固體培養(yǎng)基，在30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)，用3000ml無菌水將三個(gè)茄子瓶中的菌苔洗脫，接種至裝有300L西姆芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基的500L發(fā)酵罐中，開攪拌120r/min，前8小時(shí)通氣量為200L/min，8小時(shí)后通氣量為300L/min，30℃培養(yǎng)24-36小時(shí)，待總芽孢含量不低于80億cfu/ml，即可作為西姆芽孢桿菌發(fā)酵液；其中，所述營養(yǎng)肉湯固體培養(yǎng)基：蛋白胨10.0g/L,牛肉膏3.0g/L，氯化鈉5.0g/L，瓊脂20g/L，pH7.2±0.2；其中，所述西姆芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖8g/L，玉米粉20g/L，菜粕粉30g/L，魚粉10g/L，硫酸鎂0.4g/L，硫酸錳0.5g/L，磷酸二氫鉀0.2g/L，碳酸鈣5g/L，pH7.0。各培養(yǎng)基滅菌的條件為：0.10-0.15MPa，121℃滅菌30分鐘。步驟五，子座木霉發(fā)酵液的制備取出子座木霉菌種保藏管，用PDA固體培養(yǎng)基劃平板進(jìn)行復(fù)蘇，30℃培養(yǎng)7天。在平板下挑取單個(gè)菌落劃線接種裝有150毫升PDA固體培養(yǎng)基的茄子瓶中，在培養(yǎng)箱中30℃培養(yǎng)6-8天，待菌苔長滿茄子瓶，產(chǎn)生大量孢子粉即可用500毫升的無菌生理鹽水洗脫，調(diào)節(jié)孢子濃度為0.05億cfu/ml，即為子座木霉種子液；發(fā)酵：將上述制備的子座木霉種子液以1%的接種量接種至裝有300L子座木霉發(fā)酵培養(yǎng)基的500L發(fā)酵罐中，開攪拌200r/min，前8小時(shí)通氣量為120L/min，8-24小時(shí)后通氣量為240L/min，24小時(shí)后通氣量為360L/min，30℃培養(yǎng)32-48小時(shí)，待菌體含量達(dá)到100g/L，即可停罐，即可作為子座木霉發(fā)酵液；其中，所述的PDA固體培養(yǎng)基：土豆200g，蔗糖20g，水1000mL，瓊脂20g；其中，所述的子座木霉發(fā)酵培養(yǎng)基：菜粕2%，棉粕2%，玉米淀粉2%，石粉1%，大豆糖蜜3%，硫酸錳0.001%，磷酸氫二鉀0.04%，硫酸鎂0.02%，各培養(yǎng)基滅菌的條件為：0.10-0.15MPa，121℃滅菌30分鐘。步驟六，混合發(fā)酵液將前五個(gè)步驟制備的菌液按拒霉素鏈霉菌發(fā)酵液20-40份，不枝鏈霉菌發(fā)酵液10-30份，特基拉芽孢桿菌發(fā)酵液20-40份，西姆芽孢桿菌發(fā)酵液10-30份，子座木霉發(fā)酵液20-40份，混勻，即得到防治油菜菌核病的復(fù)合微生物制劑。其中，該復(fù)合微生物制劑在防治油菜菌核病的方法為在油菜初花期與盛花期各噴施一次，每次葉面噴施用量為1-2L/畝，其稀釋的倍數(shù)為100-200倍。本發(fā)明具有的優(yōu)點(diǎn)和有益效果：、本發(fā)明中包含的拒霉素鏈霉菌，不枝鏈霉菌，特基拉芽孢桿菌，西姆芽孢桿菌，子座木霉等5種菌是從400多株微生物菌株中篩選得到的能共生共存，能在植株的根，莖，葉以及土壤中能夠生長繁殖，能產(chǎn)生多種抗菌素如拒霉素，醋霉素和大環(huán)內(nèi)酯菌素；它們對抑制油菜菌核病病原菌--核盤菌有特別強(qiáng)大的效果，從而達(dá)到超強(qiáng)防治油菜菌核病的效果，其對油菜菌核病的藥效高，平均防效在90.83%以上，且針對性強(qiáng)；、本發(fā)明的菌種能夠全面的利用微生物種間或種內(nèi)的抗生、競爭、重寄生、溶菌作用，或者通過次級代謝產(chǎn)物誘導(dǎo)油菜產(chǎn)生抗病性，增強(qiáng)其防病效果；、本發(fā)明中所使用的這5株菌株都是可從土壤中直接分離得到，都具有根跡促生作用，可在作物表面、植株內(nèi)部或土壤中繁殖生長的同時(shí)，并定向植物根際分泌某些次生代謝產(chǎn)物，能夠提高植物對養(yǎng)分的吸收、刺激植株生長起到肥料的效果；(4)、本發(fā)明復(fù)合微生物制劑對人、畜安全，屬于環(huán)境友好型，利用本發(fā)明方法防治油菜菌核病不易產(chǎn)生抗藥性，本發(fā)明制備方法穩(wěn)定、菌種多，相對于單一拮抗菌，產(chǎn)生的拮抗物質(zhì)廣泛，效果顯著，成本低、使用簡單。具體實(shí)施方式實(shí)施例1一種防治油菜菌核病的復(fù)合微生物制劑，其特征在于，該微生物制劑的原料配比為：拒霉素鏈霉菌發(fā)酵液30份，不枝鏈霉菌發(fā)酵液20份，特基拉芽孢桿菌發(fā)酵液30份，西姆芽孢桿菌發(fā)酵液20份，子座木霉發(fā)酵液30份。該防治油菜菌核病的復(fù)合微生物制劑的制備方法，包括以下步驟：步驟一：拒霉素鏈霉菌發(fā)酵液的制備取出拒霉素鏈霉菌菌種保藏管，用高氏一號(hào)固體培養(yǎng)基劃平板進(jìn)行復(fù)蘇，30℃培養(yǎng)7天。在平板下挑取單個(gè)菌落劃線接種裝有150毫升高氏一號(hào)固體培養(yǎng)基的茄子瓶中，在培養(yǎng)箱中30℃培養(yǎng)6-8天，待菌苔長滿茄子瓶，產(chǎn)生大量孢子粉即可用500毫升的無菌生理鹽水洗脫，調(diào)節(jié)孢子濃度為0.1億cfu/ml，即為拒霉素鏈霉菌種子液；發(fā)酵：將上述制備的拒霉素鏈霉菌種子液以1%的接種量接種至裝有滅菌的600L的拒霉素鏈霉菌發(fā)酵培養(yǎng)基的1000L發(fā)酵罐中，控溫28-32℃，前24小時(shí)，通氣量為每分鐘為200L空氣，24-36小時(shí)，通氣量為400L，36小時(shí)后，通氣量為600L，開攪拌200r/min，培養(yǎng)44小時(shí)，檢測其菌體含量為65g/L，停罐，即得到拒霉素鏈霉菌發(fā)酵液；其中，所述的高氏一號(hào)固體培養(yǎng)基：硝酸鉀：1克，可溶性淀粉：20克，磷酸氫二鉀：0﹒5克，硫酸鎂：0﹒5克，氯化鈉：0﹒5克，硫酸亞鐵：0﹒01克，瓊脂：20克，蒸餾水補(bǔ)足1000ml，PH7﹒2～7﹒4；其中，所述的拒霉素鏈霉菌發(fā)酵培養(yǎng)基：菜粕粉3%，玉米淀粉1%，石粉1%，大豆糖蜜2%，磷酸氫二鉀0.04%，硫酸鎂0.05%，各培養(yǎng)基滅菌的條件為：0.10-0.15MPa，121℃滅菌30分鐘。步驟二：不枝鏈霉菌發(fā)酵液的制備取出不枝鏈霉菌菌種保藏管，用高氏一號(hào)固體培養(yǎng)基劃平板進(jìn)行復(fù)蘇，30℃培養(yǎng)7天。在平板下挑取單個(gè)菌落劃線接種裝有150毫升高氏一號(hào)固體培養(yǎng)基的茄子瓶中，在培養(yǎng)箱中30℃培養(yǎng)6-8天，待菌苔長滿茄子瓶，產(chǎn)生大量孢子粉即可用500毫升的無菌生理鹽水洗脫，調(diào)節(jié)孢子濃度為0.1億cfu/ml，即為不枝鏈霉菌種子液；發(fā)酵：將上述制備的不枝鏈霉菌種子液以1%的接種量接種至裝有滅菌的600L的不枝鏈霉菌發(fā)酵培養(yǎng)基的1000L發(fā)酵罐中，控溫28-30℃，前18小時(shí)，通氣量為每分鐘為300L空氣，18-32小時(shí)，通氣量為500L，32小時(shí)后，通氣量為700L，開攪拌200r/min，培養(yǎng)42小時(shí)，檢測其菌體含量為82g/L，停罐，即得到不枝鏈霉菌發(fā)酵液；其中，所述的高氏一號(hào)固體培養(yǎng)基：硝酸鉀：1克，可溶性淀粉：20克，磷酸氫二鉀：0﹒5克，硫酸鎂：0﹒5克，氯化鈉：0﹒5克，硫酸亞鐵：0﹒01克，瓊脂：20克，蒸餾水補(bǔ)足1000ml，PH7﹒2～7﹒4；其中，所述的不枝鏈霉菌發(fā)酵培養(yǎng)基：豆粉3%，棉粕粉1%，玉米淀粉2%，石粉1%，甘蔗糖蜜2%，硫酸錳0.002%，磷酸氫二鉀0.01%，硫酸鎂0.02%，各培養(yǎng)基滅菌的條件為：0.10-0.15MPa，121℃滅菌30分鐘。步驟三，特基拉芽孢桿菌發(fā)酵液的制備取出特基拉芽孢桿菌保藏管，用LB固體培養(yǎng)基分別劃平板進(jìn)行復(fù)蘇，30℃培養(yǎng)48小時(shí)。在平板下挑取單個(gè)菌落接種至裝有LB固體培養(yǎng)基，在30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)，用3000ml無菌水將三個(gè)茄子瓶中的菌苔洗脫，接種至裝有300L特基拉芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基的500L發(fā)酵罐中，開攪拌120r/min，前12小時(shí)通氣量為200L/min，12小時(shí)后通氣量為320L/min，30℃培養(yǎng)32小時(shí)，檢測其總芽孢含量為42億cfu/ml，即可作為特基拉芽孢桿菌發(fā)酵液；其中，所述LB固體培養(yǎng)基：酵母提取物5.0g,蛋白胨10.0,NaCl10.0g，瓊脂20g，水1000mL，pH7.2；其中，所述特基拉芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖5g/L，木薯淀粉25g/L，花生粕粉30g/L，玉米漿干粉5g/L，硫酸鎂0.4g/L，硫酸錳0.5g/L，磷酸二氫鉀0.5g/L，碳酸鈣5g/L，pH7.0。各培養(yǎng)基滅菌的條件為：0.10-0.15MPa，121℃滅菌30分鐘。步驟四，西姆芽孢桿菌發(fā)酵液的制備取出西姆芽孢桿菌保藏管，用營養(yǎng)肉湯固體培養(yǎng)基分別劃平板進(jìn)行復(fù)蘇，30℃培養(yǎng)48小時(shí)。在平板下挑取單個(gè)菌落接種至裝有營養(yǎng)肉湯固體培養(yǎng)基，在30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)，用3000ml無菌水將三個(gè)茄子瓶中的菌苔洗脫，接種至裝有300L西姆芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基的500L發(fā)酵罐中，開攪拌120r/min，前8小時(shí)通氣量為200L/min，8小時(shí)后通氣量為300L/min，30℃培養(yǎng)28小時(shí)，檢測其總芽孢含量為83億cfu/ml，即可作為西姆芽孢桿菌發(fā)酵液；其中，所述營養(yǎng)肉湯固體培養(yǎng)基：蛋白胨10.0g/L,牛肉膏3.0g/L，氯化鈉5.0g/L，瓊脂20g/L，pH7.2±0.2；其中，所述西姆芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖8g/L，玉米粉20g/L，菜粕粉30g/L，魚粉10g/L，硫酸鎂0.4g/L，硫酸錳0.5g/L，磷酸二氫鉀0.2g/L，碳酸鈣5g/L，pH7.0。各培養(yǎng)基滅菌的條件為：0.10-0.15MPa，121℃滅菌30分鐘。步驟五、子座木霉發(fā)酵液的制備取出子座木霉菌種保藏管，用PDA固體培養(yǎng)基劃平板進(jìn)行復(fù)蘇，30℃培養(yǎng)7天。在平板下挑取單個(gè)菌落劃線接種裝有150毫升PDA固體培養(yǎng)基的茄子瓶中，在培養(yǎng)箱中30℃培養(yǎng)6-8天，待菌苔長滿茄子瓶，產(chǎn)生大量孢子粉即可用500毫升的無菌生理鹽水洗脫，調(diào)節(jié)孢子濃度為0.05億cfu/ml，即為子座木霉種子液；發(fā)酵：將上述制備的子座木霉種子液以1%的接種量接種至裝有300L子座木霉發(fā)酵培養(yǎng)基的500L發(fā)酵罐中，開攪拌200r/min，前8小時(shí)通氣量為120L/min，8-24小時(shí)后通氣量為240L/min，24小時(shí)后通氣量為360L/min，30℃培養(yǎng)39小時(shí)，檢測其菌體含量為108g/L，停罐，即可作為子座木霉發(fā)酵液；其中，所述的PDA固體培養(yǎng)基：土豆200g，蔗糖20g，水1000mL，瓊脂20g；其中，所述的子座木霉發(fā)酵培養(yǎng)基：菜粕2%，棉粕2%，玉米淀粉2%，石粉1%，大豆糖蜜3%，硫酸錳0.001%，磷酸氫二鉀0.04%，硫酸鎂0.02%，各培養(yǎng)基滅菌的條件為：0.10-0.15MPa，121℃滅菌30分鐘。步驟六、混合發(fā)酵液將前五個(gè)步驟制備的菌液按拒霉素鏈霉菌發(fā)酵液30份，不枝鏈霉菌發(fā)酵液20份，特基拉芽孢桿菌發(fā)酵液30份，西姆芽孢桿菌發(fā)酵液20份，子座木霉發(fā)酵液30份，混勻，即得到防治油菜菌核病的復(fù)合微生物制劑。實(shí)施例2復(fù)合微生物制劑抑菌活性檢測試驗(yàn)將實(shí)施例1制備的微生物制劑稀釋100倍和200倍，采用平板對峙法檢測兩種微生物制劑對油菜菌核病菌菌絲生長的影響。于PDA平板中央放置牛津杯，其中滴加微生物制劑稀釋液各100uL，四周對稱位置放置培養(yǎng)2d的油菜菌核病菌菌餅(直徑為5mm)。以滴加清水的處理作為對照，每個(gè)處理設(shè)置三次重復(fù)。于25℃恒溫培養(yǎng)5d后，觀察微生物制劑對菌絲生長的抑制情況，測量抑菌圈直徑。試驗(yàn)結(jié)果：將本發(fā)明復(fù)合微生物制劑稀釋200倍后，可以顯著抑制油菜菌核病菌的生長，抑菌圈直徑可達(dá)20mm以上。將本發(fā)明復(fù)合微生物制劑稀釋100倍后，可以顯著抑制油菜菌核病菌的生長，抑菌圈直徑可達(dá)25mm以上。實(shí)施例3本發(fā)明復(fù)合微生物制劑防治油菜菌核病的田間試驗(yàn)試驗(yàn)設(shè)在湖南省隆回縣灘頭鎮(zhèn)大底村某種植戶，經(jīng)調(diào)查該地塊多年發(fā)生油菜菌核病，并且噴施之前調(diào)查已經(jīng)在田埂上發(fā)現(xiàn)子囊盤。設(shè)置初花期噴施一次、盛花期噴施一次和初花期和盛花期各噴施一次3個(gè)不同的處理，于2015年3月中旬油菜的初花期將實(shí)施例1制備的本發(fā)明復(fù)合微生物制劑稀釋200倍均勻噴施于油菜花朵及葉片上，用量復(fù)合微生物制劑1L/畝，l0d后盛花期噴施第二次，每個(gè)小區(qū)66.7m2，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，以噴施多菌靈50%可濕性粉劑500倍稀釋液作為對照。于收獲初期調(diào)查植株發(fā)病情況，五點(diǎn)取樣，記錄發(fā)病株數(shù)及病害嚴(yán)重度，計(jì)算防治效果；病情指數(shù)=[Σ(各級病株數(shù)×代表數(shù)值)/(調(diào)查總株數(shù)×發(fā)病最重級的代表數(shù)值)〕×100防治效果(%)=[(對照組病情指數(shù)一處理組病情指數(shù))/對照組病情指數(shù)]×100試驗(yàn)結(jié)果如表1，將本發(fā)明的復(fù)合微生物制劑稀釋200倍以后，在初花期和盛花期各噴施一次的防治效果最好，防治效果達(dá)到90.83%，于初花期噴施一次的防治效果和盛花期噴施一次的防治效果也達(dá)到了75.35%以上。表1復(fù)合微生物制劑對油菜菌核病的田間防治效果處理病株率（%）病情指數(shù)防治效果（%）產(chǎn)量（kg）增產(chǎn)率（%）初花期一次2.091.0385.2426.826.42盛花期一次2.961.7275.3524.616.04初花+盛花期1.780.6490.8328.433.96對照組9.676.9821.2當(dāng)前第1頁1 2 3