本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)和生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種器官保存液及其制備方法。

背景技術(shù)：

器官移植被譽(yù)為二十世紀(jì)改變?nèi)祟?lèi)生活的重大生命科學(xué)進(jìn)展，是世界公認(rèn)的治療多種終末期疾病的有效方法。據(jù)統(tǒng)計(jì)，僅我國(guó)每年器官衰竭的病人有100-150萬(wàn)，急需器官移植患者約30萬(wàn)。因此，如何進(jìn)行離體器官的有效保存成為器官移植的重要支撐技術(shù)之一。

器官保存的根本目的是保持離體器官的活性，最大限度減少缺血對(duì)離體器官的各種損傷，使之更加適用于運(yùn)送，并在手術(shù)后能夠更加迅速地恢復(fù)功能。

一種有效的器官保存液必須具備五個(gè)方面的特點(diǎn)：1、減少因低溫導(dǎo)致的細(xì)胞水腫；2、防止灌洗保存過(guò)程中的細(xì)胞間隙膨脹；3、防止細(xì)胞的酸化作用；4、防止或減輕再灌注損傷；5、提供再生高能磷酸化合物的底物。目前臨床上常用的器官保存液大致有2種UW液和HTK液等。

UniversityWisconsin器官保存液(簡(jiǎn)稱(chēng)UW液)由美國(guó)Wisconsin大學(xué)發(fā)明，被公認(rèn)為肝臟、胰、腎臟的標(biāo)準(zhǔn)保存液，臨床證實(shí)其能夠保存腎臟72小時(shí)，肝臟臟20-24小時(shí)。然而該保存液高鉀低鈉，易引起血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷；膠體成分羥乙基淀粉(HES)對(duì)血液流變學(xué)影響較大，并易引起紅細(xì)胞聚集；棉子糖、乳糖醛酸等原料成本高昂，大大增加器官移植患者臨床費(fèi)用；粘滯度高，影響灌注效果。

HTK液中含有組氨酸-組氨酸鹽緩沖對(duì)，能夠明顯抑制組織酸化；其鈉離子和鉀離子濃度較低；粘度低，易于擴(kuò)撒。然而從器官保存效果來(lái)看，供者肝臟臟表現(xiàn)出微循環(huán)障礙，HTK液的保存效果不及UW液。

目前，我國(guó)開(kāi)發(fā)的細(xì)胞保存液有HC-A液(高滲枸櫞酸嘌呤液)，由第二軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)征醫(yī)院和上海市中心血站共同研制，其配制簡(jiǎn)單，穩(wěn)定性好。但是HC-A液僅限于整塊切取器官時(shí)體內(nèi)灌洗和腎臟保存，肝臟、胰等器官保存仍需依賴UW液。

此外，研究人員還提供了多種改良的器官保存液，如中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)200910014423公開(kāi)了一種器官保存液及其制備方法，其特點(diǎn)是：在每1000ml器官保存液中含有：枸櫞酸鉀21～29mmol；一水合磷酸二氫鈉6～10mmol；磷酸氫二鈉30～45mmol；硫酸鎂4～6mmol；氯化鉀1～3mmol；右旋糖酐-4016-24g；甘露醇110～150mmol；腺苷4～6mmol；乙酰半胱氨酸4～6mmol；氫氧化鈉4～6mmol；余量為注射用水。然而該保存液為雙室包裝，使用較為麻煩，不夠簡(jiǎn)便，進(jìn)而制備方法也較為繁瑣復(fù)雜，應(yīng)對(duì)緊急情況時(shí)靈活性相對(duì)較差；且該保存液僅對(duì)腎臟有較好效果，對(duì)其他器官的保存效果不佳。

又如，中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)200810033425公開(kāi)了一種器官保存液及其制備方法，該保存液由枸櫞酸鈉、枸櫞酸鉀硫酸鎂、一水合磷酸二氫鈉、氫氧化鈉、腺嘌呤核苷、精氨酸、色氨酸、甘露醇和鹽酸川弓嗪等成分組成。然而該保存液也僅對(duì)腎臟有較好效果，對(duì)其他器官的保存效果不佳。

綜上所述，HTK液和Celsior液主要用于心臟的保存，使用范圍受到限制；UW液作為標(biāo)準(zhǔn)的多器官保存液具有諸多優(yōu)點(diǎn)，然而其粘度高、鉀離子過(guò)高，且價(jià)格昂貴，處理與檢驗(yàn)不便，并不適用于我國(guó)實(shí)際國(guó)情；國(guó)產(chǎn)HCA液及其改進(jìn)配方主要用于腎臟保存，對(duì)其他器官保存效果不佳。近年來(lái)，隨著肝臟臟、心臟和胰腺等大器官移植以及多器官聯(lián)合移植在我的需求不斷提高，缺乏高效、廉價(jià)、適用范圍廣并適應(yīng)我國(guó)國(guó)情的多器官保存液成為限制我國(guó)器官移植技術(shù)發(fā)展的重要原因。

綜上所述，開(kāi)發(fā)一種新型廉價(jià)、高效，并適用于多器官保存的器官保存液有著十分重要的研究和臨床價(jià)值。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種新型廉價(jià)、高效，并適用于多器官保存的器官保存液。

一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種器官保存液，所述的器官保存液按重量配比為，每1000mL含有：

優(yōu)選地，所述的器官保存液按重量配比為，每1000mL含有：

更優(yōu)選地，所述的器官保存液按重量配比為，每1000mL含有：

進(jìn)一步優(yōu)選地，所述的器官保存液按重量配比為，每1000mL含有：

器官保存液中的能量底物用于再生細(xì)胞的能量來(lái)源三磷酸腺苷，保持線粒體的功能活性，維持能量代謝。本發(fā)明所述的器官保存液中的能量底物為腺嘌呤核苷、一磷酸腺苷、二磷酸腺苷、色氨酸、α-酮戊二酸、琥珀酸、琥珀酰輔酶A、乙酰輔酶A和輔酶Q10中的一種或幾種；優(yōu)選為腺嘌呤核苷、琥珀酸、輔酶Q10、色氨酸和α-酮戊二酸中的一種或幾種；進(jìn)一步優(yōu)選為腺嘌呤核苷、輔酶Q10、色氨酸和琥珀酸中的一種或幾種；更進(jìn)一步優(yōu)選為腺嘌呤核苷、輔酶Q10、色氨酸和琥珀酸。

低溫保存狀態(tài)下，由于缺血缺氧，代謝途徑向糖酵解方向進(jìn)行，同時(shí)促進(jìn)乳酸的生成，導(dǎo)致組織酸化。組織酸化會(huì)損傷細(xì)胞并導(dǎo)致溶酶體不穩(wěn)定，激活溶酶體并損傷線粒體的功能。因此器官保存液中應(yīng)當(dāng)含有酸堿緩沖系統(tǒng)，減少組織酸化，維持細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境相對(duì)穩(wěn)定。本發(fā)明所述的器官保存液中的pH緩沖對(duì)為磷酸鹽、碳酸氫鹽和組氨酸中的一種或幾種；優(yōu)選為磷酸鹽和組氨酸中的一種或兩種；進(jìn)一步優(yōu)選為磷酸鹽和組氨酸。

所述的器官保存液中還含有昆布多糖、海藻糖、昆布氨酸和甜菜堿中的一種或幾種。

昆布多糖，是指昆布中的大分子多糖物質(zhì)。昆布多糖具有廣泛的生物學(xué)活性，例如研究表明昆布多糖凈化酸性物質(zhì)的作用。

海藻糖是一種安全、可靠的天然糖類(lèi)，在醫(yī)學(xué)上已經(jīng)成功地應(yīng)用海藻糖替代血漿蛋白作為血液制品、疫苗、淋巴細(xì)胞、細(xì)胞組織等生物活性物質(zhì)的穩(wěn)定劑，此外海藻糖還具有防止病毒傳播的功能。

甜菜堿，用于抗腫瘤，降血壓，抗消化性潰瘍及胃腸功能障礙，治療肝臟疾病等，此外還具有殺菌消炎的功能。

所述的器官保存液中昆布多糖的含量為，每1000mL含有1.0-10.0g。

所述的器官保存液中海藻糖的含量為，每1000mL含有1.0-16.0g。

所述的器官保存液中昆布氨酸的含量為，每1000mL含有8.0-27.0g。

所述的器官保存液中甜菜堿的含量為，每1000mL含有4.0-37.0g。

所述的器官保存液中還可以含有鹽酸川弓嗪、精氨酸、乳糖酸、谷胱甘肽、別嘌呤醇和木棉糖中的一種或多種。

另一方面，本發(fā)明還提供的上述器官保存液的制備方法，所述的制備方法包括以下步驟：

(1)按照配方用量稱(chēng)取除了能量底物之外的其他成分，加總體積50-80％的注射用水?dāng)嚢杈鶆蚝螅尤脶t(yī)用活性炭，攪拌5-20分鐘后，使用0.45μm的濾膜過(guò)濾脫碳，得到溶液A；

(2)按照配方用量稱(chēng)取能量底物，采用注射用水溶解后，得到能量底物溶液，將能量底物溶液和步驟(1)的溶液A混合，補(bǔ)加注射用水至全量，攪拌均勻后，使用0.45μm的濾膜過(guò)濾，濾液即為器官保存液。

所述的制備方法步驟(1)中醫(yī)用活性炭的加入量為每1000mL注射用水加入1-5g；優(yōu)選為每1000mL注射用水加入2-4g,；進(jìn)一步優(yōu)選為每1000mL注射用水加入3g。

所述的制備方法步驟(1)中醫(yī)用活性炭的平均粒徑為2～5μm，優(yōu)選為3～4μm，進(jìn)一步優(yōu)選為4μm。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的傷口修復(fù)液具有以下有益效果：

(1)、本發(fā)明提供的器官保存液能夠用于多種器官的冷卻、灌洗和保存，可有效保存腎臟、肝臟、心臟和胰超過(guò)48小時(shí)，其中可保存腎臟72小時(shí)，肝臟48小時(shí)。

(2)、本發(fā)明將昆布氨酸用于器官保存液，昆布氨酸具有減壓和抗菌作用，此外意外地發(fā)現(xiàn)昆布氨酸的加入能夠明顯延長(zhǎng)對(duì)胰的保存時(shí)間，將心臟的保存時(shí)間由不足24h延長(zhǎng)至48h。

(3)、本發(fā)明提供的器官保存液具有高鉀低鈉特性，能夠減少細(xì)胞內(nèi)外的離子交換和能量消耗，防止細(xì)胞水腫發(fā)生，有效延長(zhǎng)保存時(shí)間。

(4)、本發(fā)明提供的器官保存液中去除了羥乙基淀粉，降低液體粘滯度，除了含有甘露醇外，還含有昆布多糖、和海藻糖，其中昆布多糖和海藻糖具有穩(wěn)定生物膜的作用，由甘露醇、昆布多糖、和海藻糖三種成分構(gòu)成混合滲透壓調(diào)節(jié)劑，能夠有效調(diào)劑滲透壓，抑制細(xì)胞水腫和間隙膨脹，有效延長(zhǎng)保存時(shí)間。

(5)、本發(fā)明提供的器官保存液中含有甜菜堿，甜菜堿具有保護(hù)細(xì)胞膜膜、保護(hù)酶、維持細(xì)胞滲透壓的作用，本發(fā)明創(chuàng)造性地發(fā)現(xiàn)，將甜菜堿用于器官保存液能夠一定程度抑制組織酸化、穩(wěn)定溶酶體；并且能夠一定程度抑制細(xì)胞水腫，能夠有效延長(zhǎng)對(duì)肝臟、腎臟的保存時(shí)間。

(6)、器官在冷凍保存時(shí)了，無(wú)氧糖酵解是其唯一的能量來(lái)源，此過(guò)程是pH依賴性的，pH下降及其他代謝產(chǎn)物的積累將抑制糖酵解過(guò)程，也將導(dǎo)致能量缺乏。因此，pH緩沖對(duì)在器官保存液中的功能非常重要，合適的pH緩沖對(duì)能夠有效抵抗pH變化，并且進(jìn)行跨細(xì)胞膜運(yùn)輸能力較弱，不會(huì)因進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)而引起水腫。常規(guī)器官保存液采用單一種類(lèi)的緩沖對(duì)，而本發(fā)明采用磷酸鹽和組氨酸的雙成分緩沖對(duì)，其效果明顯優(yōu)于各自的單一成分緩沖對(duì)，能夠維持pH在8.0左右，pH在8.0左右的器官保存液有利于細(xì)胞內(nèi)的H⁺通過(guò)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)向外流動(dòng)，緩解細(xì)胞內(nèi)酸中毒，是肝臟細(xì)胞pH在0-4℃時(shí)接近7.7左右，能減緩ATP分解，減輕對(duì)線粒體的損害，消除酸中毒對(duì)糖酵解關(guān)鍵酶1,6-二磷酸果糖激酶的抑制，增加ATP的合成。

(7)、由于不同物質(zhì)的跨膜運(yùn)輸效率不同，因此進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部發(fā)揮作用的效果也不同。常規(guī)器官保存液采用單一種類(lèi)的能量底物，如腺嘌呤核苷。而本發(fā)明采用多種類(lèi)成分的能量底物，如腺嘌呤核苷、輔酶Q10、色氨酸和琥珀酸，多成分能量底物之間由于跨膜運(yùn)輸效率不同，因此可以相互彌補(bǔ)由于運(yùn)輸效率差異導(dǎo)致的能量合成不足。而本發(fā)明提供的含有多成分能量底物的器官保存液的保存效果也明顯好于含有單一成分能量底物的器官保存液，在缺氧條件下為細(xì)胞提供能量，對(duì)再灌注損傷的修復(fù)作用更強(qiáng)，能夠有效進(jìn)行能量再生。

(8)本發(fā)明提供的器官保存液pH在6.2-8.4，接近生理pH，能夠有效抑制組織酸化并防止細(xì)胞水腫，減少因pH差異引起的不良反應(yīng)；滲透壓在310-380mOsm/L，可以有效防止水腫，能夠明顯延長(zhǎng)器官保存時(shí)間。

(9)、線粒體呼吸率(RCR)作為線粒體內(nèi)能量合成的指標(biāo)能夠有效反應(yīng)細(xì)胞和移植物的活性，RCR高于3.0的保存肝，移植后肝功能較好。本發(fā)明提供的器官保存液保存腎臟48小時(shí)，能夠維持RCR在3.0左右，明顯高于現(xiàn)有技術(shù)。

(10)、本發(fā)明提供的器官保存液所使用的成分之間無(wú)配伍禁忌，制備工藝簡(jiǎn)單，性質(zhì)穩(wěn)定，價(jià)格低廉。

綜上所述，本發(fā)明提供的器官保存液廉價(jià)、高效，并適用于多器官保存。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例的說(shuō)明只是用于幫助理解本發(fā)明的方法及其核心思想。應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行若干改進(jìn)和修飾，這些改進(jìn)和修飾也落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。對(duì)所公開(kāi)的實(shí)施例的下述說(shuō)明，使本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員能夠?qū)崿F(xiàn)或使用本發(fā)明。對(duì)這些實(shí)施例的多種修改對(duì)本領(lǐng)域的專(zhuān)業(yè)技術(shù)人員來(lái)說(shuō)將是顯而易見(jiàn)的，本文中所定義的一般原理可以在不脫離本發(fā)明的精神或范圍的情況下，在其它實(shí)施例中實(shí)現(xiàn)。因此，本發(fā)明將不會(huì)被限制于本文所示的這些實(shí)施例中，而是可以應(yīng)用于符合與本文所公開(kāi)的原理和新穎特點(diǎn)相一致的更寬的范圍。

除非另外定義，本文中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同意義。

枸櫞酸鉀購(gòu)自廣東臺(tái)山市新寧制藥廠；枸櫞酸鈉購(gòu)自陜西西安市第四制藥廠；七水合硫酸鎂購(gòu)自上海寶達(dá)化工有限公司；琥珀酸、色氨酸、組氨酸、氯化鉀、一水合磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉購(gòu)自上海精化科技研究所；腺嘌呤核苷購(gòu)自廣東肇慶市星湖公司；、海藻糖購(gòu)自南寧中諾生物工程公司；昆布氨酸購(gòu)自陜西慈緣生物技術(shù)有限公司；昆布多糖購(gòu)自西安通澤生物科技有限公司；甘露醇購(gòu)自鄭州皇朝化工產(chǎn)品有限公司；甜菜堿購(gòu)自濟(jì)南金輝化工有限公司；輔酶Q10購(gòu)自西安康諾化工有限公司；光學(xué)顯微鏡購(gòu)自上海光學(xué)儀器公司；離心機(jī)和恒溫水浴箱購(gòu)自上海醫(yī)療儀器公司。

實(shí)施例1一種器官保存液

配方，每1000mL含有：

制備方法：

(1)按照配方用量稱(chēng)取除了腺嘌呤核苷之外的其他成分，加總體積600mL的注射用水?dāng)嚢杈鶆蚝?，加入平均粒徑?μm的醫(yī)用活性炭1g，攪拌5分鐘后，使用0.45μm的濾膜過(guò)濾脫碳，得到溶液A；

(2)按照配方用量稱(chēng)取腺嘌呤核苷，采用50mL注射用水溶解后，得到能量底物溶液，將能量底物溶液和步驟(1)的溶液A混合，補(bǔ)加注射用水至1000mL，攪拌均勻后，使用0.45μm的濾膜過(guò)濾，濾液即為器官保存液。

實(shí)施例2一種器官保存液

配方，每1000mL含有：

制備方法：

(1)按照配方用量稱(chēng)取除了腺嘌呤核苷、輔酶Q10和琥珀酸之外的其他成分，加總體積800mL的注射用水?dāng)嚢杈鶆蚝?，加入平均粒徑?μm的醫(yī)用活性炭5g，攪拌20分鐘后，使用0.45μm的濾膜過(guò)濾脫碳，得到溶液A；

(2)按照配方用量稱(chēng)取腺嘌呤核苷、輔酶Q10和琥珀酸，采用100mL注射用水溶解后，得到能量底物溶液，將能量底物溶液和步驟(1)的溶液A混合，補(bǔ)加注射用水至1000mL，攪拌均勻后，使用0.45μm的濾膜過(guò)濾，濾液即為器官保存液。

實(shí)施例3一種器官保存液

配方，每1000mL含有：

制備方法：

(1)按照配方用量稱(chēng)取除了腺嘌呤核苷、輔酶Q10、色氨酸和琥珀酸之外的其他成分，加總體積700mL的注射用水?dāng)嚢杈鶆蚝?，加入平均粒徑?μm的醫(yī)用活性炭3g，攪拌15分鐘后，使用0.45μm的濾膜過(guò)濾脫碳，得到溶液A；

(2)按照配方用量稱(chēng)取腺嘌呤核苷、輔酶Q10、色氨酸和琥珀酸，采用200mL注射用水溶解后，得到能量底物溶液，將能量底物溶液和步驟(1)的溶液A混合，補(bǔ)加注射用水至1000mL，攪拌均勻后，使用0.45μm的濾膜過(guò)濾，濾液即為器官保存液。

實(shí)施例4一種器官保存液

配方，每1000mL含有：

制備方法：

(1)按照配方用量稱(chēng)取除了腺嘌呤核苷和琥珀酸之外的其他成分，加總體積700mL的注射用水?dāng)嚢杈鶆蚝螅尤肫骄綖?μm的醫(yī)用活性炭3g，攪拌15分鐘后，使用0.45μm的濾膜過(guò)濾脫碳，得到溶液A；

(2)按照配方用量稱(chēng)取腺嘌呤核苷和琥珀酸，采用200mL注射用水溶解后，得到能量底物溶液，將能量底物溶液和步驟(1)的溶液A混合，補(bǔ)加注射用水至1000mL，攪拌均勻后，使用0.45μm的濾膜過(guò)濾，濾液即為器官保存液。

實(shí)施例5一種器官保存液

配方，每1000mL含有：

制備方法：

(1)按照配方用量稱(chēng)取除了腺嘌呤核苷和輔酶Q10之外的其他成分，加總體積600mL的注射用水?dāng)嚢杈鶆蚝螅尤肫骄綖?μm的醫(yī)用活性炭2g，攪拌8分鐘后，使用0.45μm的濾膜過(guò)濾脫碳，得到溶液A；

(2)按照配方用量稱(chēng)取腺嘌呤核苷和輔酶Q10，采用200mL注射用水溶解后，得到能量底物溶液，將能量底物溶液和步驟(1)的溶液A混合，補(bǔ)加注射用水至1000mL，攪拌均勻后，使用0.45μm的濾膜過(guò)濾，濾液即為器官保存液。

實(shí)施例6一種器官保存液

配方，每1000mL含有：

制備方法：

(1)按照配方用量稱(chēng)取除了腺嘌呤核苷、色氨酸和琥珀酸之外的其他成分，加總體積600mL的注射用水?dāng)嚢杈鶆蚝螅尤肫骄綖?μm的醫(yī)用活性炭2g，攪拌10分鐘后，使用0.45μm的濾膜過(guò)濾脫碳，得到溶液A；

(2)按照配方用量稱(chēng)取腺嘌呤核苷、色氨酸和琥珀酸，采用200mL注射用水溶解后，得到能量底物溶液，將能量底物溶液和步驟(1)的溶液A混合，補(bǔ)加注射用水至1000mL，攪拌均勻后，使用0.45μm的濾膜過(guò)濾，濾液即為器官保存液。

對(duì)比例1一種器官保存液

配方和實(shí)施例3的區(qū)別為不含昆布多糖和海藻糖；

制備方法同實(shí)施例3。

對(duì)比例2一種器官保存液

配方和實(shí)施例3的區(qū)別為不含昆布氨酸；

制備方法同實(shí)施例3。

對(duì)比例3一種器官保存液

配方和實(shí)施例3的區(qū)別為不含甜菜堿；

制備方法同實(shí)施例3。

對(duì)比例4一種器官保存液

配方和實(shí)施例3的區(qū)別為不含組氨酸；

制備方法同實(shí)施例3。

對(duì)比例5一種器官保存液

配方和實(shí)施例3的區(qū)別為不含磷酸氫二鈉和一水合磷酸二氫鈉；

制備方法同實(shí)施例3。

對(duì)比例6一種器官保存液

配方和實(shí)施例3的區(qū)別為不含輔酶Q10、色氨酸和琥珀酸，且腺嘌呤核苷的含量為11.0g；

制備方法同實(shí)施例3。

實(shí)驗(yàn)例1豬腎臟低溫保存期間的形態(tài)學(xué)改變

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：健康成年實(shí)驗(yàn)用巴馬小型豬，雌雄隨機(jī)，體重25-30kg。

實(shí)驗(yàn)方法：

1、術(shù)前準(zhǔn)備及麻醉：術(shù)前禁食16h，進(jìn)水12h。供體采用基礎(chǔ)麻醉，肌注氯胺酮1mg/kg誘導(dǎo)麻醉，異丙酚維持。

2、供腎切?。翰捎猛ㄓ萌I快速切取技術(shù)。

3、保存：供腎獲取后，分別于實(shí)施例1-6和對(duì)比例1-6制備的器官保存液中低溫保存，以HCA-Ⅱ液(由第二軍醫(yī)大長(zhǎng)征醫(yī)院提供)為對(duì)照。

4、病理檢查：在腎臟保存的第1、24、48、72小時(shí)，取腎臟實(shí)質(zhì)標(biāo)本，制作石蠟切片，進(jìn)行光鏡觀察；制作電鏡切片進(jìn)行透射電鏡形態(tài)學(xué)觀察。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

HCA-Ⅱ液組：保存24小時(shí)，光鏡所見(jiàn)腎臟結(jié)構(gòu)輕微改變，腎臟小球、腎臟小管結(jié)構(gòu)輪廓清晰，間質(zhì)輕度水腫；保存48小時(shí)，大部分腎臟小球毛細(xì)血管輪廓尚清，腎臟小管上皮廣泛中到重度空泡樣變性，間質(zhì)水腫明顯，刷狀緣損害嚴(yán)重，可見(jiàn)腎臟小管上皮多發(fā)小灶狀壞死；保存72小時(shí)，腎臟小球毛細(xì)血管部分已無(wú)正常輪廓，腎臟小管上皮廣泛且嚴(yán)重變性并片狀壞死，細(xì)胞間解離，間質(zhì)水腫明顯。電鏡結(jié)果與光鏡一致。

本發(fā)明實(shí)施例1-6組：在保存的48內(nèi)，實(shí)施例1-6組的形態(tài)學(xué)改變和HCA-Ⅱ液組無(wú)明顯差別；但保存72小時(shí)，腎臟組織輪廓較48小時(shí)未有明顯惡化，未出現(xiàn)細(xì)胞破碎和片狀壞死，惡化程度由強(qiáng)到弱排序依次為：實(shí)施例5、1、4、2、6、3。

本發(fā)明對(duì)比例1-6組：保存24小時(shí)較1小時(shí)即出現(xiàn)明顯惡化，出現(xiàn)細(xì)胞破碎和片狀壞死。

實(shí)驗(yàn)例2小型豬肝臟低溫保存-再灌注期間的形態(tài)學(xué)改變

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：同實(shí)驗(yàn)例1

實(shí)驗(yàn)方法：

1、術(shù)前準(zhǔn)備及麻醉：同實(shí)驗(yàn)例1。

2、供肝切取：采用通用全肝快速切取技術(shù)。

3、保存-再灌注：供肝獲取后進(jìn)行低溫保存，保存液為本發(fā)明實(shí)施1-5和對(duì)比例1-6制備的器官保存液，在保存的1、12小時(shí)和再灌注后1小時(shí)后，取標(biāo)本進(jìn)行光鏡觀察，以HCA-Ⅱ液和UW液(由第二軍醫(yī)大長(zhǎng)征醫(yī)院提供)為對(duì)照。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

HCA-Ⅱ液組：保存1小時(shí)，肝組織形態(tài)結(jié)構(gòu)基本正常，肝細(xì)胞輕度水腫；保存12小時(shí)，肝小葉結(jié)構(gòu)尚清楚，部分肝板崩解，肝細(xì)胞普遍輕到中度氣球樣變，少量干細(xì)胞壞死；再灌注一小時(shí)后，肝血竇明顯擴(kuò)張，肝細(xì)胞腫脹，肝板大部分崩解，散在少量脂肪變性和少量壞死。

UW液組：保存1小時(shí)，肝組織形態(tài)結(jié)構(gòu)基本正常，肝細(xì)胞輕度水腫；保存12小時(shí)，肝小葉結(jié)構(gòu)尚清楚，肝細(xì)胞腫脹，有少量肝細(xì)胞成氣球樣變，小葉周邊部分肝細(xì)胞有點(diǎn)狀壞死。

本發(fā)明實(shí)施例1-6組：保存1小時(shí)，肝組織形態(tài)結(jié)構(gòu)基本正常；保存12小時(shí)，肝組織形態(tài)結(jié)構(gòu)基本正常，肝細(xì)胞輕度水腫，其它未有明顯變化，肝組織形態(tài)學(xué)改變程度由強(qiáng)到弱依次為：1、4、2、5、6、3。

本發(fā)明對(duì)比例1-6組：保存1小時(shí)，肝小葉結(jié)構(gòu)尚清楚，肝細(xì)胞腫脹，有少量肝細(xì)胞成氣球樣變，小葉周邊部分肝細(xì)胞有點(diǎn)狀壞死。

實(shí)驗(yàn)例3腎臟移植實(shí)驗(yàn)

動(dòng)物模型：雌性雜種犬，體重13-15kg。

器官保存液：對(duì)照組：HCA-Ⅱ液和UW液；實(shí)驗(yàn)組：本發(fā)明實(shí)施例1-6和對(duì)比例1-6制備的器官保存液。

實(shí)驗(yàn)方法：術(shù)前12小時(shí)禁食，以3％戊巴比妥30mg/kg腹腔內(nèi)注射麻醉。麻醉成功后，取腹正中切口，自劍突向下長(zhǎng)約12cm，切開(kāi)進(jìn)腹。游離左腎及腎動(dòng)靜脈、輸尿管，切斷輸尿管，長(zhǎng)約7cm，在腎靜脈和深動(dòng)脈根部分別將其切斷。立即取出腎臟至于各組保存液(0℃)200mL經(jīng)腎動(dòng)脈灌注腎臟，直至腎臟呈蒼白色，將腎臟連同500mL保存液置于腎袋中，在0-4℃條件下儲(chǔ)存。分別結(jié)扎實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腎動(dòng)靜脈及輸尿管殘端，關(guān)腹。術(shù)后立即給與頭孢曲松鈉1g靜脈滴注。72小時(shí)后，同一實(shí)驗(yàn)犬按同樣方法麻醉，按原切口打開(kāi)腹腔，并向下延長(zhǎng)至恥骨上方，游離右側(cè)髂外動(dòng)靜脈，取出腎臟，腎靜脈與髂外靜脈以7-0prelene血管吻合線端側(cè)吻合，腎動(dòng)脈與髂外動(dòng)脈端端吻合，開(kāi)放血流后徹底止血。切開(kāi)膀胱，留置導(dǎo)尿管。輸尿管內(nèi)置F4.5之雙J管，以5-0羊腸線與膀胱吻合。隨后切開(kāi)實(shí)驗(yàn)犬右腎，關(guān)腹，手術(shù)結(jié)束。術(shù)后予補(bǔ)液(每日10％葡萄糖500mL、平衡液500mL)及頭孢曲松鈉1g直至實(shí)驗(yàn)動(dòng)物開(kāi)始自行進(jìn)食。術(shù)后檢測(cè)移植前后腎功能指標(biāo)變化。術(shù)后觀察期60天，達(dá)到60天的動(dòng)物視為長(zhǎng)期存活。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

1、腎皮質(zhì)低溫保存期間細(xì)胞凋亡情況，凋亡指數(shù)如下所示：

2、線粒體呼吸控制率(RCR)測(cè)定結(jié)果如下所示：

3、存活時(shí)間：使用本發(fā)明實(shí)施例1-6制備的器官保存液的存活時(shí)間和UW液的存活時(shí)間相當(dāng)，均明顯高于HCA-Ⅱ液以及本發(fā)明中的對(duì)比例1-6；使用本發(fā)明實(shí)施例1-6制備的器官保存液的長(zhǎng)期存活犬?dāng)?shù)量也明顯多于HCA-Ⅱ液以及本發(fā)明中的對(duì)比例1-6。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。