專利名稱：：一種器官保存液及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物學(xué)和醫(yī)學(xué)
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及器官移植技術(shù)中的器官保存，更具體地涉及一種器官保存液及其制備方法。
背景技術(shù)：
：器官移植是20世紀(jì)人類醫(yī)學(xué)科學(xué)的重大進(jìn)展。目前，全世界在各領(lǐng)域的移植總數(shù)已超過70萬例(次)，存活最長的器官移植受者已近半個世紀(jì)。器官保存是器官移植的三大技術(shù)支柱之一。為了提高患者長期存活率、緩解供器官短缺的矛盾，移植臨床對器官保存技術(shù)提出了更高的耍求。美國威斯康星大學(xué)(UW)Belzer教授等1988年研制成功的威斯康星大學(xué)溶液(UniversityofWisconsinSolution,UW液)極大地延長了腎、胰、肝、心臟等器官的保存時間。在UW液應(yīng)用的20多年來，其已逐漸成為了臨床上器官移植工作中保存液的"金標(biāo)準(zhǔn)"，后續(xù)開發(fā)成功的一系列器官保存也都以UW液為參照。Celsior液是1994年由Pasteur-Merieux研制成功的一種新型的細(xì)胞外液型保存液，其心臟冷保存效果已被實(shí)驗(yàn)證實(shí)優(yōu)于UW液和St.Thomas液等傳統(tǒng)的器官保存液。每升Celsior液的成分是甘露醇10.93g;組氨酸4.63g;谷胱甘肽0.92g;谷氨酸鈉3.74g;乳酸鈉6.90ml;KC11.12g;MgCl22.64g;0.1mol/LCaCl22,5ml。Celsior液對心肌的作用主要表現(xiàn)在(1)細(xì)胞外Na+為87-115mmol/L，lT為6.3-6.9mmol/L，是一種高鈉低鉀溶液，與細(xì)胞外液相似，易于均勻擴(kuò)散至組織間隙，改善灌注效果；(2)通過添加非滲透性物質(zhì)甘露醇、乳糖醛酸等大分子來維持細(xì)胞內(nèi)外滲透壓的平衡，減輕心肌細(xì)胞水腫；(3)通過組氨酸/乳糖醛酸緩沖系統(tǒng)防止細(xì)胞酸化；(4)保存液中含有谷氨酸，保證充足的ATP供應(yīng)；(5)用還原型谷胱甘肽作為抗氧化劑，可防止氧自由基介導(dǎo)的損傷作用。臨床證實(shí)Celsior液在心臟移植中應(yīng)用是安全有效的，可顯著延長器官體外活性。但是目前此類保存液并不能降低器官移植過程中的灌注再損傷，對進(jìn)'步提高器官移植后的存活率存在一定障礙。本研究試圖通過對Celsior液進(jìn)行改良，研究開發(fā)出基于Celsior液的新的能防止減弱缺血再灌注損傷的多器官保存液。四氫生物蝶呤(BH4)為喋啶類化合物，是一氧化氮合酶(NOS)重要的輔助因子，可與NOS緊密結(jié)合，促進(jìn)NO的合成與釋放。內(nèi)源性NO可抑制PMN對血管內(nèi)皮粘附、聚集，從而減輕組織器官的缺血損傷。NO也通過抑制PMN膜結(jié)合NADPH氧化酶活性，直接中和超氧陰離子而減輕氧自由基對血管內(nèi)皮的損傷。因此可將BH4作為一種抗氧化、抗缺血再灌注損傷的因子添加至Celsior液中以加強(qiáng)其器官組織保護(hù)作用。二氮嗪(diazoxide，DE)是一種苯丙噻二嗪類衍生物，作為一種血管擴(kuò)張劑用于高血壓危象的治療。近年來的研究證實(shí)，DE還是一種線粒體ATP敏感性鉀通道的特異性開放劑，它可模擬缺血預(yù)處理效應(yīng)，對抗心肌缺血缺氧性損傷。在移植心臟保存領(lǐng)域，預(yù)先給予DE可顯著促進(jìn)心臟保存后舒張功能的恢復(fù)，緩解心肌水腫程度。因此，可將DE直接添加在心麻痹液中進(jìn)行心臟保存。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種能有效防止減弱缺血再灌注損傷的多器官保存液及其制備方法。本發(fā)明是一種器官保存液，其特征在于，在1000ml器官保存液中含有甘露醇10.93g;組氨酸4.63g;谷胱甘肽0.92g;谷氨酸鈉3.74g;乳酸鈉6.90ml;KC1U2g;MgCl22.64g;0.1mol/LCaCl22.5ml;四氫生物蝶呤1.57mg;二氮嗪6.92mg;余量為雙蒸水。一種上述保存液的制備方法，其特征在于按照1000ml配置量的具體步驟如下(1)分別取四氫生物蝶呤1.57mg、二氮嗪6.92mg溶于lml二甲基亞砜(DMSO)作為母液備用;配制0.lmoI/L的CaCl21Oml備用;(2)將800ml雙蒸水加入〉1000ml容器中，再依次加入KC11.12g、MgCl22.64g、甘露醇10.93g、組氨酸4.63g、谷胱甘肽0.92g、谷氨酸鈉3.74g，攪拌至顏色變?yōu)榍逦?；加入乳酸鈉6.90ml，攪拌至顏色變?yōu)榍逦患尤隣.lmol/LCaCl22.5ml，攪拌至顏色變?yōu)榍逦患尤雮溆玫哪敢?，攪拌至顏色變?yōu)榍逦?3)pH調(diào)至7.3~7.5，滲透壓調(diào)至320Osm/L，雙蒸水定容至1000ml，放置4QC低溫保存待用。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于低溫能減慢心肌細(xì)胞的生化反應(yīng)速度和細(xì)胞內(nèi)的酶降解速度，延遲溶酶體類的亞細(xì)胞器官的消散。而Celsior液是一種新型的細(xì)胞外液型保存液，其心臟冷保存效果己被實(shí)驗(yàn)證實(shí)優(yōu)于UW液和St.Thomas液等傳統(tǒng)的器官保存液。它含有防滲透劑甘露醇、還原型谷胱甘肽等氧自由基清除劑、組氨酸緩沖系統(tǒng)及能量底物谷氨酸，能維持細(xì)胞內(nèi)外滲透壓的平衡、有效地對抗氧自由基損傷、有效抑制酸中毒的發(fā)生、提供心肌細(xì)胞無氧狀態(tài)下的能量來源、改善血管內(nèi)皮功能。四氫生物蝶呤(BH4)是一氧化氮合酶(NOS)重要的輔助因子，可與NOS緊密結(jié)合，促進(jìn)NO的合成與釋放。缺血再灌注損傷引起內(nèi)源性BH4減少，進(jìn)而導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞和心肌細(xì)胞功能減退。外源性供給BH4后明顯減少了NOS依賴的02—及其代謝產(chǎn)物H202的數(shù)量，并提高了NO的凈產(chǎn)量。適量的NO具有清除細(xì)胞內(nèi)低水平氧自由基的作用。增加的NO通過抑制ICAM-1表達(dá)和PMN膜結(jié)合NADPH氧化酶活性，直接中和超氧陰離子而減輕氧自由基對血管內(nèi)皮的損傷。同時，NO本身作為內(nèi)皮衍化舒張因子，具有強(qiáng)大的擴(kuò)張冠狀動脈的作用，因而可增加再灌注時的冠脈流量，促進(jìn)有害物質(zhì)排出，從而減輕心肌損傷。二氮嗪(diazoxide，DE)是一種線粒體ATP敏感性鉀通道的特異性開放劑，對心肌缺氧損傷后線粒體的膜結(jié)構(gòu)和功能的完整性具有較好的保存作用。將DE添加在心麻痹液中，開放mitoKATP通道，可通過降低線粒體膜電位，對抗線粒體鈣超載；調(diào)節(jié)線粒體基質(zhì)容積，提高氧代謝率和促進(jìn)線粒體呼吸；抑制氧應(yīng)激引起的細(xì)胞調(diào)亡。應(yīng)用該保存液可有效延長器官移植的存活時間，提高移植器官在宿主體內(nèi)的存活率，還可以減輕缺血再灌注損傷，它可以替代Cdsior液應(yīng)用于包括心臟、肝臟、腎臟等重要臟器的移植。具體實(shí)施例方式實(shí)施例1器官保存液的制備(以配制1000ml為例)原材料的準(zhǔn)備甘露醇10.93g;組氨酸4.63g;谷胱甘肽0.92g;谷氨酸鈉3.74g;乳酸鈉6.90ml;KCI1.12g;MgCl22.64g;0.1mol/LCaCl22.5ml;四氫生物蝶呤1.57mg;二氮嗪6.92mg;足量的雙蒸水。制備過程具體步驟如下分別取四氫生物蝶呤1.57mg、二氮嗪6.92mg溶于lml二甲基亞砜(DMSO)作為母液備用；配制0.1mol/L的CaCl210ml備用；將800ml雙蒸水加入M000ml容器中，再依次加入KC11.12g、MgCl22.64g、甘露醇10.93g、組氨酸4.63g、谷胱甘肽0.92g、谷氨酸鈉3.74g，攪拌至顏色變?yōu)榍逦?；加入乳酸鈉6.90ml，攪拌至顏色變?yōu)榍逦?；加入O.lmol/LCaCl22.5ml,攪拌至顏色變?yōu)榍逦?；加入備用的母液，攪拌至顏色變?yōu)榍逦?。pH調(diào)至7.37.5，滲透壓調(diào)至320Osm/L，雙蒸水定容至lOOOml，放置4DC低溫保存待用。實(shí)施例2器官保存液在Langendoff離體鼠心灌流和冷保存中的應(yīng)用受試對象雄性SD大鼠(體重230270g)將大鼠分為①對照組離體心臟保存于Celsior心麻痹液中保存，n=8;DE+BH4組離體心臟保存于實(shí)施例1提供的器官保存液(下稱"本器官保存液")，n=8。實(shí)施過程.-大鼠稱重后開胸，取出心臟后迅速轉(zhuǎn)移并固定于Langendoff灌流裝置上，用改良K一H液行常規(guī)逆行恒壓灌注(76mmHg)。整個灌注期間溫度保持在37^,灌注液用95%02+5%C02飽和。肺動脈跟部切開，是冠脈循環(huán)回流液充分引流。切開左心耳，壓力傳感器與MedLab生物信號采集系統(tǒng)連接。往左心室球囊內(nèi)緩慢注入適量生理鹽水，使左心室舒張末壓期壓力(LVEDP)維持在68mmHg，記錄球囊注水量。平衡灌注20~30min后測定心室血流動力學(xué)指標(biāo)。測定完成后，經(jīng)主動脈根部灌注4V的Cdsior液，灌注時間控制在3min以內(nèi)，待心臟停跳后置于不同的保存液中，于4GC保存8h后，心臟被重新置于Langendoff裝置上灌注60min,灌注條件同保存前保持一致。復(fù)灌的前10min作為復(fù)蘇穩(wěn)定期，10min后開始測定血流動力學(xué)指標(biāo)。實(shí)施例3對實(shí)施例2所述測定保存前后的心功能指標(biāo)，結(jié)果如下表l冷保存8h后左心室舒張末壓期壓力(LVEDP)的變化_GroupLVDEPduringreperfusion(%ofequilibrium)20min30min40min50min60minControl462.58±18.25451.54±12.01469.46±15.47475.82±15.66482.23±15.63DE+BH4324.47il9.49*321.31±11.04*317.82士12,7W315.90±16.18*325.83±15.35*_*p<0.05vscontrolgroup.冷保存8h后，與單純的Celsior液相比較，本保存液可顯著抑制保存后LVEDP的抬高。表2冷保存8h后左心室發(fā)展壓力(LVDP)的變化_GroupLVDPduringreperfusion(%ofequilibrium)20min30min40min50min60minControl32.18±10.5946.72±10.5543.29±12.8940,51±11.0934.59±11.07DE+BH479.88±21.81**77.35±19.48**74.47±22.18**67.17±20.93**65.02±18.51****p<0.05vscontrolgroup.冷保存8h后，本保存液促進(jìn)LVDP恢復(fù)的作用明顯優(yōu)于單純的Celsior液。表3冷保存8h后冠脈流出量(CF)恢復(fù)率的變化<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>冷保存8h后，與單純的Celsior液相比較，本保存液可明顯提高CF恢復(fù)率。表5冷保存8h后乳酸脫氫酶(LDH)漏出量的變化<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>Mp<0.05vscontrolgroup.冷保存8h后，與單純的Celsior液相比較，本保存液LDH漏出量明顯降低。實(shí)驗(yàn)證明，本器官保存液和Celsior液相比，保存8h后，各項(xiàng)心功能和心肌酶學(xué)的指標(biāo)顯著改善，提示本發(fā)明中的器官保存液在心臟的保存十.優(yōu)于Celsior液。實(shí)施例4器官保存液在心臟移植手術(shù)中的應(yīng)用受試對象雄性SD大鼠(體重230270g)將大鼠分為①對照組離體心臟于Celsior心麻痹液中保存8h后進(jìn)行頸部異位移植；②DE+BH4組離體心臟保存于本器官保存液中保存8h后進(jìn)行頸部異位移植。實(shí)施過程供體手術(shù)將供體鼠以3X戊巴比妥鈉按40mg/kg腹腔內(nèi)注射麻醉，仰臥固定于手術(shù)板上，手術(shù)區(qū)備皮，常規(guī)PVP-I消毒。作腹部正中切口，顯露下腔靜脈，注入肝素5mg/kg。沿雙腋前線開胸至鎖骨，將整個胸前壁向上翻起。自下腔靜脈快速注入5-6ml冷停跳液，剪開下腔靜脈放血，供心停跳后，胸腔內(nèi)置冰屑?？拷呐K處分別結(jié)扎、切斷左右上、下腔靜脈和雙側(cè)肺靜脈，切斷左、右肺動脈，切斷降主動脈和頭、臂各動脈，摘取心臟，于0-0.9%氯化鈉溶液中修剪。剪開肺動脈末端的分叉，將肺動脈末端翻轉(zhuǎn)同定于套管外。剪開頭臂動脈末端的分又，于無頭臂動脈和左頸總動脈之間結(jié)扎主動脈弓，切除其遠(yuǎn)端部分。保存將取下的心臟按照不同的組分別放入WCcelsior液或本器官保存液中保存3h備用。受體手術(shù)將受體鼠以3%戊巴比妥鈉按40呢/kg腹腔內(nèi)注射麻醉，仰臥固定于手術(shù)板上，手術(shù)區(qū)備皮，常規(guī)PVP-I消毒。自受體鼠胸骨上緣至下頜骨下方做頸部正中切口，顯露右頸外靜脈，在其第l個屬支處結(jié)扎，留牽引線備用。切除右側(cè)頜下腺和胸鎖乳突肌，游離右側(cè)頸總動脈，以小血管夾夾住近心端，于頸內(nèi)、外動脈分叉處結(jié)扎、切斷頸總動脈。近心端動脈用微型剪縱行剪開血管壁1.0mm，將頸總動脈末端分成兩部分，8-O尼龍線牽引頸總動脈通過套管，將頸總動脈斷端翻轉(zhuǎn)于套管之外。將供心的頭臂動脈套在受體頸總動脈套管外，結(jié)扎固定?？v行剪開受體的右頸外靜脈，將供心肺動脈插入受體右頸外靜脈內(nèi)，結(jié)扎固定。開放動脈夾，移植心臟自動復(fù)跳或由心室顫動轉(zhuǎn)為正常心搏。仔細(xì)放好移植心臟位置后關(guān)閉皮膚切□。受體鼠在術(shù)后O.5-2h即可清醒，能爬行、飲水。通過視診可觀察到，本保存液保存后的移植心臟較Cdsior液移植心臟的搏動情況好。實(shí)驗(yàn)證明本器官保存液和Celsior液相比，由于本器官保存液使用一氧化氮合酶輔助因子四氫生物蝶呤可促進(jìn)NO的合成與釋放，中和超氧陰離子，減輕心肌細(xì)胞損傷。同時添加了一種線粒體ATP敏感性鉀通道的特異性開放劑二氮嗪，對心肌缺氧損傷后線粒體的膜結(jié)構(gòu)和功能的完整性具有較好的保存作用。這些添加的藥物可彌補(bǔ)Celsior液的不足，因此，本器官保存液可以替代Cdsior液應(yīng)用于多種器官移植手術(shù)中的臟器保存，尤其是心臟。權(quán)利要求1、一種器官保存液，其特征在于，在每1000ml器官保存液中含有甘露醇10.93g；組氨酸4.63g；谷胱甘肽0.92g；谷氨酸鈉3.74g；乳酸鈉6.90ml；KCl1.12g；MgCl22.64g；0.1mol/LCaCl22.5ml；四氫生物蝶呤1.57mg；二氮嗪6.92mg；余量為雙蒸水。2、按權(quán)利要求1所述器官保存液的制備方法，其特征在于按照每lOOOml配置量的具體步驟如下(1)分別取四氫生物蝶呤1.57mg、二氮嗉6.92mg溶于lml二甲基亞砜(DMSO)作為母液備用;配制O.lmol/L的CaCl210ml備用;(2)將800ml雙蒸水加入lOOOml容器中，再依次加入KC11.12g、MgCl22.64g、甘露醇10.93g、組氨酸4.63g、谷胱甘肽0.92g、谷氨酸鈉3.74g，攪拌至顏色變?yōu)榍逦?；加入乳酸鈉6.90ml，攪拌至顏色變?yōu)榍逦?；加入O.lmol/LCaCl22.5ml，攪拌至顏色變?yōu)榍逦?；加入備用的母液，攪拌至顏色變?yōu)榍逦?3)pH調(diào)至7.37.5，滲透壓調(diào)至320Osm/L，雙蒸水定容至lOOOml，放置4GC低溫保存。全文摘要本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)生物學(xué)技術(shù)，涉及一種器官保存液及其制備，按照每1000ml配制量的步驟包括分別取四氫生物蝶呤1.57mg、二氮嗪6.92mg溶于1ml二甲基亞砜作為母液；配制0.1mol/L的CaCl₂10ml備用；將800ml雙蒸水加入1000ml容器中，依次加入KCl1.12g、MgCl₂2.64g、甘露醇10.93g、組氨酸4.63g、谷胱甘肽0.92g、谷氨酸鈉3.74g，攪拌至清晰；加入乳酸鈉6.90ml，攪拌至清晰；加入0.1mol/LCaCl₂2.5ml，攪拌至清晰；加入備用液和母液，攪拌至清晰。pH調(diào)至7.3～7.5，滲透壓調(diào)至320Osm/L，雙蒸水定容至1000ml。放置4℃低溫保存。文檔編號A01N1/02GK101167450SQ20071015700公開日2008年4月30日申請日期2007年11月13日優(yōu)先權(quán)日2007年11月13日發(fā)明者張曉明,朱一苗,沈岳良,王麗娜,鄭鳴之申請人:浙江大學(xué)