本發(fā)明屬于動(dòng)物繁殖技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種豬精液體外低溫保存用稀釋劑及其制備方法。
背景技術(shù)：
瑞典、英國(guó)、加拿大及美國(guó)等國(guó)家，在家畜動(dòng)物育種及實(shí)際繁殖生產(chǎn)中已經(jīng)建立人工授精技術(shù)平臺(tái)并且形成產(chǎn)業(yè)化，經(jīng)濟(jì)效益顯著。而我國(guó)是一個(gè)養(yǎng)豬和消費(fèi)大國(guó)，年產(chǎn)生豬量約6億多頭，豬肉產(chǎn)量約為6500萬噸，隨著人們生活水平的提高，人均豬肉的消費(fèi)量逐年增加，養(yǎng)豬方式逐漸從傳統(tǒng)的庭院飼養(yǎng)方式轉(zhuǎn)變?yōu)楣S化、集約化和規(guī)?；?。我國(guó)由于飼養(yǎng)等因素，導(dǎo)致豬品種質(zhì)量下降，如何有效利用優(yōu)質(zhì)種豬資源進(jìn)行聯(lián)合育種，提高優(yōu)質(zhì)豬種質(zhì)資源的利用率是目前養(yǎng)殖業(yè)亟待解決的問題。隨著國(guó)家生豬改良政策支持及聯(lián)合育種的推廣，國(guó)外高端優(yōu)質(zhì)種公豬的引進(jìn)數(shù)量逐漸增加，優(yōu)質(zhì)種公豬的高效利用已經(jīng)引起廣泛重視。然而，缺乏可支撐體選育技術(shù)系，地方優(yōu)良品種以及引進(jìn)優(yōu)質(zhì)品種利用不足，導(dǎo)致整個(gè)繁育體系運(yùn)行呈現(xiàn)“引進(jìn)-擴(kuò)繁-退化-再引進(jìn)”依賴型循環(huán)狀態(tài)。優(yōu)質(zhì)種豬的利用率低等問題逐漸顯現(xiàn)，已經(jīng)成為目前養(yǎng)豬企業(yè)較為關(guān)注的突出問題。如何增強(qiáng)種豬的利用效率，提高繁殖生產(chǎn)效率，逐漸適應(yīng)國(guó)內(nèi)外消費(fèi)市場(chǎng)對(duì)豬肉產(chǎn)品的新要求，擴(kuò)大養(yǎng)豬企業(yè)生存和發(fā)展空間，實(shí)現(xiàn)上海地區(qū)養(yǎng)豬業(yè)可持續(xù)循環(huán)發(fā)展是目前亟待解決的問題。
家畜動(dòng)物牛、馬冷凍精子已經(jīng)成功用于繁殖生產(chǎn)中，但豬凍精繁殖缺乏相應(yīng)技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)沒有達(dá)到普及推廣，尤其是凍精繁殖受孕及產(chǎn)仔數(shù)降低是凍精利用推廣的瓶頸，目前全球豬凍精的使用率不足1％。實(shí)際豬繁殖生產(chǎn)中，普遍利用17℃保存的新鮮精液進(jìn)行人工輸精。然而，17℃保存的豬鮮精液有效利用期一般為3-5天，這樣在一定程度上限制優(yōu)質(zhì)公豬鮮精液的有效利用率。因此，生豬繁殖生產(chǎn)中，凍精保存時(shí)間長(zhǎng)，但繁殖受孕率、產(chǎn)仔數(shù)降低。相反，鮮精17℃人工輸精繁殖生產(chǎn)效率與自然交配繁殖率相似，但因保存溫度高，精子代謝相對(duì)超低溫冷凍保存時(shí)明顯增強(qiáng)，能量消耗過快致使精子體外存活時(shí)間縮短，因此精液有效利用期只有3-5天，致使優(yōu)質(zhì)種公豬精液利用率大大降低。如何在確保受孕率及產(chǎn)仔數(shù)的同時(shí)，又能延長(zhǎng)體外保存時(shí)間，最大限度利用優(yōu)質(zhì)種公豬資源，是目前養(yǎng)殖業(yè)亟待解決的關(guān)鍵問題。豬精液體外保存時(shí)溫度直接影響精子的代謝以及存活壽命，而與保存溫度相適應(yīng)的稀釋防護(hù)劑配制是人工授精繁殖涉及到的關(guān)鍵性技術(shù)之一。研究表明，體外保存過程中，精子活力、存活時(shí)間以及質(zhì)膜、頂體完整率等質(zhì)量特性直接影響人工輸精的受孕率。豬精子與其它哺乳動(dòng)物的精子類似，在超低溫冷凍保存過程中，精子對(duì)低溫?fù)p傷及氧化損傷的抗性較弱，致使精子活力下降，質(zhì)膜完整率及頂體完整率亦明顯降低，人工授精的受孕率及胎仔數(shù)均低于自然繁殖(Watson，Anim Reprod Sci，2000，42：251～260.)。Petrunkina等(Theriogenology.2005)從理論上對(duì)動(dòng)物精子冷凍保存作了進(jìn)一步分析，認(rèn)為在凍融過程中質(zhì)膜結(jié)構(gòu)發(fā)生變化引起精子的損傷，進(jìn)而導(dǎo)致凍融精子的死亡或產(chǎn)生類似凋亡現(xiàn)象，從而引起母豬受孕率及產(chǎn)子數(shù)降低。理論上，4℃低溫保存能夠有效延長(zhǎng)精液保存時(shí)間，避免精子的冷凍及解凍損傷，使精液利用率最大化。然而，目前在實(shí)際生產(chǎn)中尚未使用4℃溫度保存的豬精液。研究證實(shí)，4℃低溫保存時(shí)可能破壞了精子頂體質(zhì)膜完整性，使細(xì)胞骨架發(fā)生不同程度遷移，導(dǎo)致細(xì)胞無法承受滲透壓變化，精子供能途徑受阻，細(xì)胞內(nèi)ATP供應(yīng)不足致使活力下降(Zhao等，Animal Science Journal，2013，84：600-606)；其次，精液在體外保存過程中，細(xì)胞內(nèi)會(huì)產(chǎn)生過多不穩(wěn)定的活性氧離子(ROS)，使ROS在精子細(xì)胞中沉積，引起細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，造成精子質(zhì)膜和頂體受損，導(dǎo)致活力下降(Roland等，Theriogenology，2006，66：1115-1123)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)中指出的針對(duì)低溫(4℃-5℃)溫度保存豬精液時(shí)所產(chǎn)生的不利因素，篩選出有利于維護(hù)豬精子結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性、增強(qiáng)精子抗氧化損傷的稀釋劑成分，提供一種豬精液體外低溫(4℃-5℃)保存用稀釋劑及其制備方法。利用該稀釋液低溫4℃保存豬精液時(shí)，顯著降低精子ROS氧化損傷，有利于維持豬精子的質(zhì)膜完整性及頂體完整性，能有效延長(zhǎng)豬精子低溫保存的存活時(shí)間，提高優(yōu)質(zhì)種公豬精液使用效率及人工養(yǎng)殖的經(jīng)濟(jì)效益。
本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的：
第一方面，本發(fā)明涉及一種豬精液體外低溫保存用稀釋劑，所述稀釋劑包括如下組分：D-果糖、2-氨基-2-羥甲基-1，3-丙二醇、檸檬酸三鈉、碳酸氫鈉、檸檬酸、乙二胺四乙酸二鈉、N-乙?；?半胱氨酸、脫脂奶粉、蛋黃凍干粉和廣譜抗生素抑菌劑。
優(yōu)選地，按所述稀釋劑體積為100mL計(jì)，包括：
所述稀釋劑的pH值為6.80～7.30，滲透壓為280～350mOsmo/mL。
優(yōu)選地，所述脫脂奶粉和蛋黃凍干粉的用量比為用量比為1∶0.31～1∶1.86。更優(yōu)選為1∶0.5～1∶1.4；在該用量范圍內(nèi)，稀釋劑中的脫脂奶粉和蛋黃凍干粉能協(xié)同發(fā)揮最佳的乳化作用以及非滲透性保護(hù)作用，進(jìn)而可以更好地維持豬精子活力各項(xiàng)參數(shù)，有效延長(zhǎng)豬精子體外存活的時(shí)間。
優(yōu)選地，所述脫脂奶粉為超聲波加工處理后的脫脂奶粉；所述蛋黃凍干粉為超聲波加工處理后的蛋黃凍干粉；超聲波的參數(shù)范圍：頻率范圍為20～25KHz，超聲時(shí)間為5～30min。
優(yōu)選地，所述廣譜抗生素抑菌劑包括硫酸丁胺卡那霉素、阿莫斯林、慶大霉素、青霉素、頭孢類抗生素中的一種或幾種。
優(yōu)選地，所述豬精液體外低溫保存用稀釋劑中低溫指的是4℃～5℃。
優(yōu)選地，按所述稀釋劑體積為100mL計(jì)，包括：
優(yōu)選地，按所述稀釋劑體積為100mL計(jì)，包括：
第二方面，本發(fā)明還涉及一種前述的豬精液體外低溫保存用稀釋劑的制備方法，所述方法包括如下步驟：
S1、稱取所述D-果糖、2-氨基-2-羥甲基-1，3-丙二醇、檸檬酸三鈉、碳酸氫鈉、檸檬酸、乙二胺四乙酸二鈉、N-乙酰基-半胱氨酸溶于重蒸水或者超純水中；
S2、依次加入脫脂奶粉、蛋黃凍干粉，超聲混合；
S3、加入廣譜抗生素抑菌劑，最后用重蒸水或者超純水混合均勻定容至100mL即可。
優(yōu)選地，步驟S2中，所述超聲混合是以60～80頻率振幅超聲5～10分鐘。
本發(fā)明采用D-果糖、2-氨基-2-羥甲基-1，3-丙二醇、檸檬酸三鈉、碳酸氫鈉、檸檬酸、乙二胺四乙酸二鈉等成分，N-乙?；?半胱氨酸、脫脂奶粉、蛋黃凍干粉、硫酸丁胺卡那霉素等常規(guī)抑菌劑配制成豬精液體外低溫保存的稀釋劑。該稀釋劑能有利于維持豬精子代謝功能，為精子提供充足的ATP用于保存自身一定的活力，有效延長(zhǎng)豬精子低溫體外保存過程中的存活時(shí)間。
本發(fā)明的新型豬精液體外低溫(4℃-5℃)保存稀釋劑，有提供能量代謝基礎(chǔ)的糖類、離子中間載體、滲透壓調(diào)節(jié)劑、抗氧化劑、維持精子質(zhì)膜結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的乳化劑以及廣譜抗菌劑等多種成分。利用該新型稀釋劑體外低溫(4℃-5℃)保存豬精液過程中，體現(xiàn)如下特點(diǎn)：能夠在低溫條件下，為處于似休眠狀態(tài)的精子提供充分的能量，用以維持正常的代謝活動(dòng)；能夠?yàn)樘幱诘蜏丨h(huán)境中的豬精子提供適宜滲透壓、pH內(nèi)環(huán)境，保證精子的正常生理機(jī)能；具有良好的抗氧化作用，有效抑制ROS的產(chǎn)生及精子凋亡，增強(qiáng)精子的抗氧化損傷能力；具有較高的乳化作用，有效抑制精子質(zhì)膜與活性氧離子(ROS)接觸而發(fā)生的過氧化反應(yīng)，有效地保護(hù)精子質(zhì)膜結(jié)構(gòu)的完整性。本發(fā)明的稀釋劑，能有效克服低溫對(duì)豬精子的機(jī)械損傷，延長(zhǎng)豬精子低溫體外保存過程中的存活時(shí)間，利于維持豬精子的質(zhì)膜完整性及頂體完整性，能有效延長(zhǎng)豬精子低溫保存的存活時(shí)間，提高優(yōu)質(zhì)種公豬精液使用效率及人工養(yǎng)殖的經(jīng)濟(jì)效益。本發(fā)明涉及的硫酸丁胺卡那霉素等常規(guī)抑菌劑，包括廣譜抗生素等抑菌劑，這屬于本領(lǐng)域的常識(shí)。
本發(fā)明采用N-乙?；?半胱氨酸作為抗氧化劑，具有較好的抗氧化作用。研究證實(shí)，豬精液低溫體外保存過程中，精子細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生氧化物質(zhì)ROS，一定量的ROS能引起精子自身的氧化損傷，導(dǎo)致精子細(xì)胞色素C功能變化以及質(zhì)膜內(nèi)層磷脂酰絲氨酸外移，引起凋亡相關(guān)蛋白酶活性及精子代謝異常，進(jìn)而誘導(dǎo)精子進(jìn)入凋亡狀態(tài)。本發(fā)明中利用N-乙?；?半胱氨酸能夠減少超氧自由基的生成，有效抑制ROS的產(chǎn)生及精子凋亡，增強(qiáng)精子的抗氧化損傷能力，表現(xiàn)出明顯的抗氧化作用。因此，體外低溫保存過程中，N-乙?；?半胱氨酸作為一種非酶類抗氧化劑，可以有效阻止ROS在細(xì)胞中沉積過多，避免精子細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激，能有效減少豬精子的氧化損傷，延長(zhǎng)豬精子的存活時(shí)間，從而提高豬精子的有效利用率。
本發(fā)明采用脫脂奶粉、蛋黃凍干粉等成分，經(jīng)過超聲波加工處理后，能夠產(chǎn)生大量低密度脂蛋白及磷脂顆粒，具有一定乳化作用。豬精子體外保存過程中，在低溫刺激等機(jī)械損傷后，精子質(zhì)膜極易受到破壞，尤其是低溫導(dǎo)致質(zhì)膜及頂體膜產(chǎn)生融合，從而引起質(zhì)膜破裂以及頂體囊泡的形成，使精子進(jìn)入似獲能狀態(tài)，致使精子存活時(shí)間縮短。本發(fā)明中，脫脂奶粉、蛋黃凍干粉作為一種非滲透性保護(hù)劑，超聲波加工處理后產(chǎn)生的低密度脂蛋白及磷脂顆粒，可以通過清除離子和小分子維持精子質(zhì)膜兩側(cè)的滲透壓，并且可以阻止精子質(zhì)膜與活性氧離子(ROS)接觸而發(fā)生的過氧化反應(yīng)，有效地保護(hù)精子質(zhì)膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證實(shí)，添加了脫脂奶粉及蛋黃凍干粉的稀釋液可以有效維持豬精子活力各項(xiàng)參數(shù)，有效延長(zhǎng)豬精子體外存活的時(shí)間。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下的有益效果：
(1)本發(fā)明的新型稀釋劑低溫4℃條件下體外保存豬精液，既克服超低溫冷凍保存對(duì)精子造成的機(jī)械性損傷，又能避免17℃條件下體外保存過程中精子壽命縮短的缺陷。在維持精子結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的同時(shí)，有效延長(zhǎng)豬鮮精液體外保存時(shí)間，顯著提高優(yōu)質(zhì)種公豬精液的使用效率，同時(shí)節(jié)省飼養(yǎng)成本。
(2)本發(fā)明能有效提高豬精子的抗氧化能力，在乳化劑的平衡保護(hù)下，有效維持豬精子質(zhì)膜、頂體結(jié)構(gòu)的完整性，延長(zhǎng)豬精子低溫環(huán)境下的存活時(shí)間，效果顯著。
(3)本發(fā)明的產(chǎn)品取材容易，成本價(jià)格低廉，易于推廣。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。以下實(shí)施例將有助于本領(lǐng)域的技術(shù)人員進(jìn)一步理解本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)。這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
實(shí)施例1
本實(shí)施例涉及一種新型低溫(4℃-5℃)保存豬精液的稀釋劑；所述豬精液稀釋劑包括如下各組分：按豬精液稀釋劑體積為100mL計(jì)，D-果糖(3250mg)、2-氨基-2-羥甲基-1，3-丙二醇(580mg)、檸檬酸三鈉(720mg)、碳酸氫鈉(120mg)、檸檬酸(380mg)、乙二胺四乙酸二鈉(265mg)、N-乙?；?半胱氨酸(18.5mg)、脫脂奶粉(800mg)、蛋黃凍干粉(520mg)、硫酸丁胺卡那霉素(30mg)。
本實(shí)施例還涉及前述的新型豬精液體外低溫(4℃-5℃)保存稀釋劑的制備方法，所述方法包括如下步驟：
配置100mL的新型豬精液體外低溫(4℃-5℃)保存稀釋劑：稱取D-果糖(3250mg)、2-氨基-2-羥甲基-1，3-丙二醇(580mg)、檸檬酸三鈉(720mg)、碳酸氫鈉(120mg)、檸檬酸(380mg)、乙二胺四乙酸二鈉(265mg)、N-乙?；?半胱氨酸(18.5mg)，以此溶于一定體積重蒸水或純凈水中。依次加入脫脂奶粉(800mg)、蛋黃凍干粉(520mg)，用60頻率振幅超聲8分鐘，然后加入硫酸丁胺卡那霉素等常用抗生素(30mg)，最后混合均勻定容100mL，pH為7.10，滲透壓為330mOsmo/mL即可。
實(shí)施例2
本實(shí)施例涉及一種新型低溫(4℃-5℃)保存豬精液的稀釋劑，所述豬精液稀釋劑包括如下各組分：按豬精液稀釋劑體積為100mL計(jì)，D-果糖(2250mg)、2-氨基-2-羥甲基-1，3-丙二醇(425mg)、檸檬酸三鈉(460mg)、碳酸氫鈉(80mg)、檸檬酸(285mg)、乙二胺四乙酸二鈉(180mg)、N-乙?；?半胱氨酸(14.5mg)、脫脂奶粉(350mg)、蛋黃凍干粉(250mg)、硫酸丁胺卡那霉素(22mg)。
本實(shí)施例還涉及前述的新型豬精液體外低溫(4℃-5℃)保存稀釋劑的制備方法，所述方法包括如下步驟：
配置100mL的新型豬精液體外低溫(4℃-5℃)保存稀釋劑：稱取D-果糖(2250mg)、2-氨基-2-羥甲基-1，3-丙二醇(425mg)、檸檬酸三鈉(460mg)、碳酸氫鈉(80mg)、檸檬酸(280mg)、乙二胺四乙酸二鈉(180mg)、N-乙?；?半胱氨酸(13.5mg)，依次溶于一定體積重蒸水或純凈水中。依次加入脫脂奶粉(350mg)、蛋黃凍干粉(250mg)，用60頻率振幅超聲5分鐘，然后加入硫酸丁胺卡那霉素等常用抗生素(20mg)，最后混合均勻定容100mL，pH為7.05，滲透壓為285mOsmo/mL即可。
實(shí)施例3
本實(shí)施例涉及一種新型低溫(4℃-5℃)保存豬精液的稀釋劑，所述豬精液稀釋劑包括如下各組分：按豬精液稀釋劑體積為100mL計(jì)，D-果糖(2750mg)、2-氨基-2-羥甲基-1，3-丙二醇(565mg)、檸檬酸三鈉(690mg)、碳酸氫鈉(100mg)、檸檬酸(290mg)、乙二胺四乙酸二鈉(235mg)、N-乙酰基-半胱氨酸(16.2mg)、脫脂奶粉(580mg)、蛋黃凍干粉(320mg)、硫酸丁胺卡那霉素(20mg)。
本實(shí)施例還涉及前述的新型豬精液體外低溫(4℃-5℃)保存稀釋劑的制備方法，所述方法包括如下步驟：
配置100mL的新型豬精液體外低溫(4℃-5℃)保存稀釋劑：稱取D-果糖(2750mg)、2-氨基-2-羥甲基-1，3-丙二醇(565mg)、檸檬酸三鈉(690mg)、碳酸氫鈉(100mg)、檸檬酸(290mg)、乙二胺四乙酸二鈉(235mg)、N-乙?；?半胱氨酸(16mg)，以此溶于一定體積重蒸水或純凈水中。依次加入脫脂奶粉(580mg)、蛋黃凍干粉(320mg)，用80頻率振幅超聲10分鐘，然后加入硫酸丁胺卡那霉素等常用抗生素(20mg)，最后混合均勻定容100mL，pH為7.20，滲透壓為320mOsmo/mL即可。
實(shí)施例4
本實(shí)施例涉及一種新型低溫(4℃-5℃)保存豬精液的稀釋劑，所述豬精液稀釋劑包括如下各組分：按豬精液稀釋劑體積為100mL計(jì)，D-果糖(2860mg)、2-氨基-2-羥甲基-1，3-丙二醇(520mg)、檸檬酸三鈉(720mg)、碳酸氫鈉(80mg)、檸檬酸(320mg)、乙二胺四乙酸二鈉(210mg)、N-乙?；?半胱氨酸(15mg)、脫脂奶粉(400mg)、蛋黃凍干粉(560mg)、硫酸丁胺卡那霉素(25mg)。
本實(shí)施例還涉及前述的新型豬精液體外低溫(4℃-5℃)保存稀釋劑的制備方法，所述方法包括如下步驟：
配置100mL的新型豬精液體外低溫(4℃-5℃)保存稀釋劑：稱取D-果糖(2860mg)、2-氨基-2-羥甲基-1，3-丙二醇(520mg)、檸檬酸三鈉(720mg)、碳酸氫鈉(80mg)、檸檬酸(320mg)、乙二胺四乙酸二鈉(210mg)、N-乙?；?半胱氨酸(15mg)，依次溶于一定體積重蒸水或純凈水中。依次加入脫脂奶粉(400mg)、蛋黃凍干粉(560mg)，用70頻率振幅超聲8分鐘，然后加入硫酸丁胺卡那霉素等常用抗生素(25mg)，最后混合均勻定容100mL，pH為6.90，滲透壓為310mOsmo/mL即可。
實(shí)施例5
本實(shí)施例涉及一種新型低溫(4℃-5℃)保存豬精液的稀釋劑，所述豬精液稀釋劑包括如下各組分：按豬精液稀釋劑體積為100mL計(jì)，D-果糖(2350mg)、2-氨基-2-羥甲基-1，3-丙二醇(425mg)、檸檬酸三鈉(560mg)、碳酸氫鈉(85mg)、檸檬酸(220mg)、乙二胺四乙酸二鈉(285mg)、N-乙?；?半胱氨酸(15.5mg)、脫脂奶粉(550mg)、蛋黃凍干粉(450mg)、硫酸丁胺卡那霉素(28mg)。
本實(shí)施例還涉及前述的新型豬精液體外低溫(4℃-5℃)保存稀釋劑的制備方法，所述方法包括如下步驟：
配置100mL的新型豬精液體外低溫(4℃-5℃)保存稀釋劑：稱取D-果糖(2350mg)、2-氨基-2-羥甲基-1，3-丙二醇(425mg)、檸檬酸三鈉(560mg)、碳酸氫鈉(85mg)、檸檬酸(220mg)、乙二胺四乙酸二鈉(285mg)、N-乙?；?半胱氨酸(15.5mg)，依次溶于一定體積重蒸水或純凈水中。依次加入脫脂奶粉(550mg)、蛋黃凍干粉(450mg)，用70頻率振幅超聲8分鐘，然后加入硫酸丁胺卡那霉素等常用抗生素(28mg)，最后混合均勻定容100mL，pH為6.85，滲透壓為290mOsmo/mL即可。
實(shí)施例6
本實(shí)施例涉及一種新型低溫(4℃-5℃)保存豬精液的稀釋劑，所述豬精液稀釋劑包括如下各組分：按豬精液稀釋劑體積為100mL計(jì)，D-果糖(2550mg)、2-氨基-2-羥甲基-1，3-丙二醇(610mg)、檸檬酸三鈉(710mg)、碳酸氫鈉(110mg)、檸檬酸(325mg)、乙二胺四乙酸二鈉(280mg)、N-乙?；?半胱氨酸(13mg)、脫脂奶粉(650mg)、蛋黃凍干粉(280mg)、硫酸丁胺卡那霉素(28mg)。
本實(shí)施例還涉及前述的新型豬精液體外低溫(4℃-5℃)保存稀釋劑的制備方法，所述方法包括如下步驟：
配置100mL的新型豬精液體外低溫(4℃-5℃)保存稀釋劑：稱取D-果糖(2550mg)、2-氨基-2-羥甲基-1，3-丙二醇(610mg)、檸檬酸三鈉(710mg)、碳酸氫鈉(110mg)、檸檬酸(325mg)、乙二胺四乙酸二鈉(280mg)、N-乙?；?半胱氨酸(13mg)，依次溶于一定體積重蒸水或純凈水中。依次加入脫脂奶粉(650mg)、蛋黃凍干粉(280mg)，用70頻率振幅超聲8分鐘，然后加入硫酸丁胺卡那霉素等常用抗生素(28mg)，最后混合均勻定容100mL，pH為6.95，滲透壓為295mOsmo/mL即可。
實(shí)施例7、實(shí)施效果
設(shè)置對(duì)照組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，對(duì)照組為普通豬精液體外保存稀釋劑(TCM稀釋劑)，實(shí)驗(yàn)組是本發(fā)明的新型低溫(4℃-5℃)保存豬精液的稀釋劑，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下；表1為體外低溫(4℃-5℃)保存七天后對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組中精子活力參數(shù)值比較，由表1可以看出，實(shí)驗(yàn)組中運(yùn)動(dòng)性精子比例MOT、前向運(yùn)動(dòng)精子比例PRO、精子平均路徑運(yùn)動(dòng)速率VAP等參數(shù)明顯高于對(duì)照組；表2為體外低溫(4℃-5℃)保存十五天后對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組中精子成活率、質(zhì)膜完整率及頂體完整率，由表2可以看出，實(shí)驗(yàn)組中精子的成活率、質(zhì)膜完整率及頂體完整率等指標(biāo)均優(yōu)于對(duì)照組；表3為體外低溫(4℃-5℃)保存七天后對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組中精子凋亡狀況的比較結(jié)果，由表3可以看出，實(shí)驗(yàn)組中精子的正常比率、高膜電位精子比率明顯高于對(duì)照組，而精子凋亡率要明顯低于對(duì)照組。
采用本發(fā)明實(shí)施例2～6獲得的新型低溫(4℃-5℃)保存豬精液的稀釋劑進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，均能取得比對(duì)照組優(yōu)異的實(shí)驗(yàn)效果；其中實(shí)施例3和實(shí)施例4制備的稀釋劑的使用的效果尤其顯著；采用實(shí)施例3制備的稀釋劑，在對(duì)低溫(4℃-5℃)保存豬精液的實(shí)驗(yàn)中，同對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組中運(yùn)動(dòng)性精子比例MOT、前向運(yùn)動(dòng)精子比例PRO等指標(biāo)分別提高21.6、18.1個(gè)百分點(diǎn)，精子平均路徑運(yùn)動(dòng)速率VAP及VSL等參數(shù)分別提高12.2μm/S和13.3μm/S；在對(duì)低溫體外保存精子的成活率、質(zhì)膜完整率及頂體完整率實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)組中精子的成活率、質(zhì)膜完整率及頂體完整率分別提高21.2、15.5及7.2個(gè)百分點(diǎn)，有效提高精子質(zhì)膜及頂體結(jié)構(gòu)的完整性。
采用實(shí)施例4制備的新型低溫(4℃-5℃)保存豬精液的稀釋劑，在對(duì)精子線粒體膜電位及凋亡率的影響實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)組中豬精子的正常精子比率及高線粒體膜電位精子比例明顯高于對(duì)照組，而凋亡精子比例及畸形精子比例明顯低于對(duì)照組。同對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組正常精子比率及高線粒體膜電位精子比例分別增加19.6、22.6個(gè)百分點(diǎn)，而凋亡精子比例及畸形精子比例分別降低15.4及8.9個(gè)百分點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明的新型稀釋劑有助于維持豬精子線粒體膜電位，降低精子的氧化損傷，減少精子的凋亡比例。
對(duì)于實(shí)施例3和4制備的新型低溫(4℃-5℃)保存豬精液的稀釋劑所具有的優(yōu)異性能，其原因是實(shí)施例3和4配制的稀釋劑各種組分在用量了實(shí)現(xiàn)了均衡的配比，其中D-果糖的添加劑量能為精子提供充足的能量，滿足了精子的營(yíng)養(yǎng)需求；而2-氨基-2-羥甲基-1，3-丙二醇、檸檬酸三鈉、碳酸氫鈉、檸檬酸及乙二胺四乙酸二鈉等成分為精子提供適宜的滲透壓及PH值環(huán)境，有利于維持低溫下豬精子正常的生理狀態(tài)；尤其是添加適宜劑量的脫脂奶粉、蛋黃凍干粉等成分，經(jīng)過超聲波加工處理后，能夠產(chǎn)生大量低密度脂蛋白及磷脂顆粒，通過一定乳化作用，可清有效維持精子質(zhì)膜兩側(cè)的滲透壓，并且可以阻止精子質(zhì)膜與活性氧離子(ROS)接觸而發(fā)生的過氧化反應(yīng)，有效地保護(hù)精子質(zhì)膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。尤其是一定劑量的N-乙?；?半胱氨酸能夠減少超氧自由基的生成，
有效抑制ROS的產(chǎn)生及精子凋亡，增強(qiáng)精子的抗氧化損傷能力，表現(xiàn)出明顯的抗氧化作用。因此，低溫保存過程中，N-乙酰基-半胱氨酸作為一種非酶類抗氧化劑，可以有效阻止ROS在細(xì)胞中沉積過多，避免精子細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激，能有效減少豬精子的氧化損傷，延長(zhǎng)豬精子的存活時(shí)間。采用其他抗氧化劑代替本發(fā)明的N-乙?；?半胱氨酸，例如抗壞血酸及維生素E替代N-乙?；?半胱氨酸均不能實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的效果(見表4數(shù)據(jù)證明)。而單獨(dú)采用脫脂奶粉或蛋黃凍干粉成分，也均不能實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的效果(見表5數(shù)據(jù)證明，其中，單加脫脂奶粉組是以稀釋劑總體積100mL計(jì)，在TCM稀釋劑中加入脫脂奶粉580mg；單加蛋黃凍干粉組是以稀釋劑總體積計(jì)，在TCM稀釋劑中加入蛋黃凍干粉320mg；脫脂奶粉加蛋黃凍干粉組是以稀釋劑總體積100mL計(jì)，在TCM稀釋劑中加入脫脂奶粉580mg，蛋黃凍干粉320mg。)
表1新型豬精液稀釋劑與TCM稀釋劑實(shí)驗(yàn)對(duì)比數(shù)據(jù)(4℃-5℃保存豬精液至15天)
同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同字母表示差異顯著(P＜0.05)，n＝15；
表2新型豬精液稀釋劑與TCM稀釋劑實(shí)驗(yàn)對(duì)比數(shù)據(jù)(4℃-5℃保存豬精液至15天)
同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同字母表示差異顯著(P＜0.05)，n＝15；
表3新型豬精液稀釋劑與TCM稀釋劑實(shí)驗(yàn)對(duì)比數(shù)據(jù)(4℃-5℃保存豬精液至15天)
同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同字母表示差異顯著(P＜0.05)，n＝15；
表4新型豬精液稀釋劑中N-乙?；?半胱氨酸與與其他抗氧化劑實(shí)驗(yàn)對(duì)比數(shù)據(jù)(4℃-5℃保存豬精液至15天)
同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同字母表示差異顯著(P＜0.05)，n＝15；
表5新型豬精液稀釋劑與單獨(dú)使用脫脂奶粉及蛋黃凍干粉實(shí)驗(yàn)對(duì)比數(shù)據(jù)(4℃-5℃保存豬精液至15天)
同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同字母表示差異顯著(P＜0.05)，n＝15；
綜上所述，本實(shí)施例1～6制得的新型豬精液稀釋劑，既克服超低溫冷凍保存對(duì)精子造成的機(jī)械性損傷，又能避免17℃條件下體外保存過程中精子壽命縮短的缺陷。在維持精子結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的同時(shí)，有效延長(zhǎng)豬鮮精液體外保存時(shí)間，顯著提高優(yōu)質(zhì)種公豬精液的使用效率，同時(shí)節(jié)省飼養(yǎng)成本。本發(fā)明能有效提高豬精子的抗氧化能力，在乳化劑的平衡保護(hù)下，有效維持豬精子質(zhì)膜、頂體結(jié)構(gòu)的完整性，延長(zhǎng)豬精子低溫環(huán)境下的存活時(shí)間，效果顯著。本實(shí)施例1～6制得的新型豬精液低溫保存稀釋劑劑，可在4℃-5℃溫度條件下體外保存豬精液，有效維持精子的生理代謝機(jī)能，延長(zhǎng)精子存活時(shí)間。
以上對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施例進(jìn)行了描述。需要理解的是，本發(fā)明并不局限于上述特定實(shí)施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在權(quán)利要求的范圍內(nèi)做出各種變形或修改，這并不影響本發(fā)明的實(shí)質(zhì)內(nèi)容。