本發(fā)明屬于種質(zhì)創(chuàng)新技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及將人工合成四倍體小麥自發(fā)產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)變異傳遞給普通小麥，培育部分同源染色體重組的新型六倍體小麥的方法。

背景技術(shù)：

禾本科小麥屬（triticum）包括二倍體小麥、四倍體小麥和六倍體小麥。其中四倍體小麥的硬粒小麥（t.turgidumssp.durum）和六倍體的普通小麥（t.aestivuml.）在世界各地廣泛種植，是重要的糧食作物。我國主要種植和食用六倍體普通小麥。國家的糧食安全需求及資源高效利用、生態(tài)環(huán)境保護(hù)的要求，對小麥新品種培育提出了更高的要求和更大的挑戰(zhàn)。但近年我國小麥育種一直處在瓶頸期，其中一個重要制約因素就是新種質(zhì)資源匱乏。

六倍體普通小麥（2n=42，基因組aabbdd）包含a、b、d三個亞基因組，每個亞基因組有14條染色體，三個亞基因組的染色體互稱為部分同源染色體。a亞基因組的二倍體供體為烏拉爾圖小麥（t.urartu，2n=14，基因組aa），d亞基因組的二倍體供體為粗山羊草（aegilopstauschii，2n=14，基因組dd），b亞基因組沒有確定的二倍體供體，但山羊草屬的擬斯卑爾托山羊草（ae.speltoides，2n=14,基因組ss）的s基因組與普通小麥b亞基因組的親緣關(guān)系最近。小麥有著復(fù)雜的進(jìn)化史，包含多次物種間雜交和基因組加倍。最新研究結(jié)果顯示，d亞基因組的祖先是由含有a與b基因組的祖先雜交而來，此后，在約50萬年前（0.5mya），烏拉爾圖小麥與一個含有s基因組的二倍體物種（與擬斯卑爾托山羊草ae.speltoides具有密切的親緣關(guān)系）發(fā)生了雜交和加倍，產(chǎn)生了四倍體小麥（t.turgiduml.，2n=28，基因組aabb）。四倍體小麥被馴化成多種人工栽培小麥，包括至今仍有種植的硬粒小麥（durum）。在大約8000年前，栽培的四倍體小麥與粗山羊草（ae.tauschii，2n=14，基因組dd）發(fā)生了第二次雜交和基因組加倍，形成異源六倍體普通小麥(t.aestivuml.，基因組為aabbdd）新物種。與大多數(shù)異源多倍體物種不同的是，天然形成的小麥，無論是四倍體還是六倍體，在染色體5b長臂上都含有一個關(guān)鍵基因——ph1基因，它嚴(yán)格控制減數(shù)分裂過程中部分同源染色體的配對和聯(lián)會。ph1基因是把“雙刃劍”，它不干涉正常的同源染色體配對、聯(lián)會，維持了基因組的穩(wěn)定，卻限制了部分同源染色體之間的重組，降低了遺傳變異。ph1基因的存在把六倍體小麥基因組內(nèi)三個亞基因組的資源“鎖”起來了，亞基因組之間基因不能相互流動。因此多倍體小麥中部分同源染色體間基本不發(fā)生重組和遺傳物質(zhì)的交換。也就是說，天然存在的四倍體和六倍體小麥都是不發(fā)生部分同源染色體重組的物種，這極大限制了遺傳多樣性的產(chǎn)生。

作物育種的基礎(chǔ)是遺傳多樣性的產(chǎn)生，為克服六倍體小麥遺傳基礎(chǔ)狹窄的問題，育種家研發(fā)了多種相關(guān)技術(shù)將外源遺傳物質(zhì)導(dǎo)入小麥背景。主要包括三種：小麥誘變育種，是通過電離輻射或化學(xué)誘變劑處理小麥與野生親緣物種的雜交種及后代。輻射可能誘導(dǎo)產(chǎn)生帶有堿基突變的材料，同時輻射也會導(dǎo)致染色體斷裂，在染色體進(jìn)行同源重組修復(fù)或者非同源末端連接修復(fù)的過程中，“強(qiáng)行”實現(xiàn)小麥與外源染色體之間發(fā)生重組；小麥遠(yuǎn)緣雜交育種，是將小麥與黑麥、偃麥草、簇毛麥等野生親緣物種雜交，通過染色體工程導(dǎo)入外源種質(zhì)的遺傳物質(zhì)，產(chǎn)生小麥與外源種質(zhì)的附加系、代換系、易位系等；人工合成六倍體小麥，是通過四倍體小麥（t.turgidum）和粗山羊草（a.tauschii）雜交，得到人工合成六倍體小麥，通過這種合成小麥作為中間親本向六倍體普通小麥同時導(dǎo)入四倍體小麥和粗山羊草的基因。

雖然這些育種方法都可以將外源遺傳物質(zhì)導(dǎo)入普通小麥產(chǎn)生遺傳變異，但它們也都存在各自的缺陷：物理或化學(xué)誘變手段能夠增加突變的頻率，但突變產(chǎn)生的位點隨機(jī)，有害突變多，有利突變少，產(chǎn)生的變異絕大多數(shù)不能遺傳；小麥遠(yuǎn)緣雜交則面臨雜交不結(jié)實、雜種不育和夭亡的難題，即使能獲得雜交種并得到附加系、代換系、易位系等材料，雜種衍生后代攜帶大量野生種的不利基因，需要多個世代的回交和分離才能去除；人工合成小麥的親本選擇局限于四倍體小麥和粗山羊草，而且ph1基因限制了兩親本之間的重組，該方法難以產(chǎn)生更豐富的后代類型。

人工合成四倍體小麥有兩種類型，它們的基因組分別為ssdd和aadd。aa基因組來源為六倍體普通小麥a亞基因組供體的二倍體烏拉爾圖小麥，ss基因組來源為與六倍體普通小麥b亞基因組供體親緣關(guān)系近的二倍體山羊草屬小麥，dd基因組來源為六倍體普通小麥d亞基因組供體的二倍體粗山羊草。由于這三種類型的二倍體小麥都沒有執(zhí)行類似六倍體小麥中ph1基因功能的基因，因此，經(jīng)人工雜交、加倍得到的人工合成四倍體小麥能夠進(jìn)行部分同源染色體之間的聯(lián)會、配對及重組。細(xì)胞學(xué)研究也證實：兩種人工合成四倍體小麥在部分同源染色體之間，即s與d亞基因組染色體和a與d亞基因組染色體之間能夠自然發(fā)生染色體易位等結(jié)構(gòu)變異，從而產(chǎn)生不同的四倍體小麥核型。在創(chuàng)制小麥新種質(zhì)的過程中，若要產(chǎn)生發(fā)生重組事件的六倍體小麥，除了傳統(tǒng)引入外源遺傳物質(zhì)的方式以外，充分利用部分同源染色體之間頻繁的重組，配合多種雜交轉(zhuǎn)育方式，就能夠?qū)⒇S富的遺傳變異傳遞給六倍體小麥。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于利用人工合成四倍體小麥自發(fā)產(chǎn)生的部分同源染色體結(jié)構(gòu)變異，在避免導(dǎo)入其它外源遺傳物質(zhì)的情況下，培育含有部分同源染色體重組的新型六倍體小麥新種質(zhì)。

本發(fā)明的內(nèi)容是，不導(dǎo)入人工合成四倍體基因組組成以外的外源遺傳物質(zhì)，利用人工合成四倍體小麥自發(fā)重組產(chǎn)生的亞基因組間部分同源染色體結(jié)構(gòu)變異，通過雜交途徑，以人工合成四倍體小麥為雜交親本，將這種結(jié)構(gòu)變異轉(zhuǎn)移給六倍體小麥，創(chuàng)制六倍體普通小麥新種質(zhì)。具體為：以發(fā)生大量部分同源染色體重組的人工合成四倍體小麥為雜交親本，與六倍體普通小麥或者二倍體小麥雜交，將在四倍體小麥水平產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)變異導(dǎo)入六倍體普通小麥，由于其中大量結(jié)構(gòu)變異的存在，將導(dǎo)致相應(yīng)基因表達(dá)水平的可遺傳改變，進(jìn)而產(chǎn)生具有新表型的種質(zhì)，成為能夠在育種上直接被利用的六倍體小麥新種質(zhì)。

為了實現(xiàn)以上目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

利用已創(chuàng)制的含有部分同源染色體重組的人工合成四倍體小麥為雜交親本，通過包括人工合成四倍體小麥與普通小麥雜交及回交、人工合成四倍體小麥直接與二倍體小麥雜交，最終得到含有部分同源染色體重組的新型六倍體小麥新種質(zhì)。

1、人工合成四倍體小麥與普通小麥雜交及回交：將含有部分同源染色體重組的人工合成四倍體小麥與普通小麥雜交，在得到的五倍體雜交種小麥與六倍體普通小麥的回交后代中篩選六倍體小麥。

親本選擇：含有部分同源染色體重組的人工合成四倍體小麥，基因組為aadd。含有部分同源染色體重組的人工合成四倍體小麥，基因組為ssdd。六倍體普通小麥，基因組為aabbdd。

雜交組合：

（1）人工合成四倍體小麥（aadd）與六倍體普通小麥（aabbdd）雜交，在得到的五倍體雜交種小麥與六倍體普通小麥的回交后代中篩選六倍體小麥。

（2）人工合成四倍體小麥（ssdd）與六倍體普通小麥（aabbdd）雜交，在得到的五倍體雜交種小麥與六倍體普通小麥的回交后代中篩選六倍體小麥。

2、人工合成四倍體小麥直接與二倍體小麥雜交：含有部分同源染色體重組的人工合成四倍體小麥與二倍體小麥雜交，將三倍體雜交種小麥經(jīng)染色體加倍得到包含染色體結(jié)構(gòu)變異的六倍體小麥。

親本選擇：含有部分同源染色體重組的人工合成四倍體小麥，基因組為aadd。含有部分同源染色體重組的人工合成四倍體小麥，基因組為ssdd。二倍體小麥為烏拉爾圖小麥，基因組為aa。與六倍體普通小麥b亞基因組供體親緣關(guān)系近的二倍體山羊草屬小麥，基因組為ss。

雜交組合：

（1）人工合成四倍體小麥（aadd）與二倍體山羊草屬小麥（ss）雜交，將雜交種三倍體小麥（asd）基因組加倍得到六倍體小麥（aassdd）。

（2）人工合成四倍體小麥（ssdd）與二倍體烏拉爾圖小麥（aa）雜交，將雜交種三倍體小麥（asd）基因組加倍得到六倍體小麥（aassdd）。

附圖說明

圖1為含有染色體結(jié)構(gòu)變異的人工合成四倍體小麥at1（ssdd）的基因組原位雜交圖。其中s亞基因組染色體為紅色，d亞基因組染色體為綠色。箭頭指示含有結(jié)構(gòu)變異的染色體。

圖2為人工合成四倍體小麥at1與六倍體普通小麥taa10雜交所得五倍體植株。

圖3為含有染色體結(jié)構(gòu)變異的人工合成四倍體小麥at2（aadd）的基因組原位雜交圖。其中d亞基因組染色體為紅色，a亞基因組染色體為綠色。箭頭指示含有結(jié)構(gòu)變異的染色體。

圖4為二倍體山羊草屬小麥tb01（ss）與at2雜交所得三倍體。

具體實施方式

為了使本發(fā)明技術(shù)方案更加清晰，以下實施例將對本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說明。需要指出的是，此處所描述的具體實施例僅用以解釋本發(fā)明。實施例中所述的試驗方法如無特殊說明均為常規(guī)操作方法，所用的試劑均可從商業(yè)途徑獲得。

實施例1：含有部分同源染色體重組的人工合成四倍體小麥與普通小麥雜交及回交，獲得含有部分同源染色體重組的六倍體小麥。技術(shù)步驟如下：

1、鑒定人工合成四倍體小麥at1核型（圖1）：目的為從人工合成四倍體小麥中鑒定出含有部分同源染色體重組的個體。細(xì)胞學(xué)鑒定核型方法：

a)種子萌發(fā)：在鋪有濾紙的培養(yǎng)皿中用水浸泡at1種子，待種子露白后將水倒掉，始終將培養(yǎng)皿放置于20℃以上的室內(nèi)黑暗處，并保持濾紙濕潤。

b)獲取根尖：在根長達(dá)到1.5~2.0cm時，剪取根尖部分裂旺盛的區(qū)域1cm，放置于提前扎孔和濕潤的0.5ml離心管中。通入一氧化二氮氣體處理2小時后，在冰上用95%的冰醋酸固定5分鐘，用去離子水清洗兩次，最后用75%乙醇保存。

c)染色體制片：用去離子水洗去離心管中的酒精，取根尖分生區(qū)2mm放置于纖維素酶（0.02g/ml）和果膠酶（0.01g/ml）混合液中，37℃酶解35分鐘。用75%的乙醇洗凈酶液，將根尖研磨成勻漿狀，渦旋離心后加入100%冰醋酸25μl，取8μl滴于玻璃蓋玻片上，在濕盒中放置5分鐘。

d)原位雜交和信號觀察：

熒光原位雜交（fish）和基因組原位雜交（gish）探針：fish使用兩種重復(fù)序列探針pas1和psc119.2。gish用s和d基因組dna做探針雜交at1的根尖染色體，s和d基因組dna分別提取自擬斯卑爾托山羊草和粗山羊草。探針需要避光，原位雜交過程要完全避免強(qiáng)光照射。

熒光原位雜交：取探針pas1和psc119.2各100ng，用2ⅹssc/1ⅹte緩沖液配成6μl/片的體系，在80℃的濕盒中變性雜交5分鐘，在55℃的濕盒中復(fù)性、延伸8小時。用2xssc緩沖液輕輕洗去塑料蓋玻片，滴加dapi12μl/片，蓋上玻璃蓋玻片，用熒光顯微鏡檢測熒光信號。

基因組原位雜交：取基因組dna探針各100ng，用2ⅹssc/1ⅹte緩沖液配成6μl/片的體系，在80℃的濕盒中變性雜交5分鐘，在55℃的濕盒中復(fù)性、延伸10小時。用2ⅹssc緩沖液輕輕洗去塑料蓋玻片，滴加dapi12μl/片，蓋上玻璃蓋玻片，用熒光顯微鏡檢測熒光信號。

e)核型分析：用photoshop軟件，結(jié)合at1根尖染色體fish和gish信號，區(qū)分at1（ssdd）每一條染色體，確定產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)變異類型。

2、分期播種雜交親本。

雜交親本為含有部分同源染色體重組的人工合成四倍體小麥at1（ssdd）和六倍體普通小麥taa10（aabbdd）。

以10天為間隔，分3期種植at1。在種植第二期at1材料時，同期種植普通小麥taa10（aabbdd）。所有at1親本都要先鑒定核型，將核型已知含有部分同源染色體重組的幼苗從培養(yǎng)皿移栽到土里。所有含有部分同源染色體重組的人工合成四倍體小麥和六倍體普通小麥放在有自然光照的玻璃溫室培養(yǎng)，每天光照16小時，溫室溫度保持在25℃。

3、含有部分同源染色體重組的人工合成四倍體小麥at1與普通小麥taa10雜交。

在抽穗期，用at1作為雜交的母本。取at1未散粉的幼穗，只保留每個穗基部的兩朵小花，去掉每朵小花的雄蕊，套上雜交袋并標(biāo)注去雄日期。授粉期間，取父本taa10新鮮花粉抖落到已經(jīng)去雄的at1幼穗柱頭上。

4、雜交種幼胚拯救。

在授粉后16天取幼胚進(jìn)行胚拯救，使用ms培養(yǎng)基。

ms培養(yǎng)基的成份為：ms干粉培養(yǎng)基4.32g/l，蔗糖30g/l，瓊脂7g/l，調(diào)節(jié)ph=5.8。121℃高壓滅菌15分鐘，滅菌結(jié)束溫度降至70℃時將培養(yǎng)基分裝至各培養(yǎng)瓶中，每個培養(yǎng)瓶分裝50ml。

胚拯救操作：將培養(yǎng)基、鑷子、培養(yǎng)皿、酒精燈等用具放入超凈工作臺，超凈工作臺用紫外燈滅菌30分鐘。將幼胚從穗軸上剝落，順次用75%乙醇洗1分鐘，滅菌水洗1分鐘，次氯酸鈉浸泡8分鐘，滅菌水重復(fù)洗3次、每次各1分鐘。然后把幼胚放置于裝有滅菌濾紙的培養(yǎng)皿上，用鑷子剝出幼胚放于培養(yǎng)瓶中，在瓶壁上標(biāo)注好日期和材料名稱。

5、幼苗移栽

在胚拯救的7天后，幼胚膨大并萌發(fā)成苗，幼苗長至10厘米時，用鑷子將幼苗從培養(yǎng)瓶中取出并移栽到裝有滅菌土的紙杯里，放于培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)箱的溫度及光周期為23℃/16h光照和15℃/8h黑暗。

6、五倍體幼苗的核型鑒定

在幼苗長出三片葉子時取根尖，用細(xì)胞學(xué)方法鑒定核型，真實雜交種為五倍體小麥（absdd）（圖2）。

獲取根尖：選擇紙杯中幼苗的茁壯新根進(jìn)行染色體制片。

基因組原位雜交探針體系：探針為a和d基因組dna探針各100ng，封阻為1000ng的s基因組dna，用2ⅹssc/1ⅹte緩沖液配成6μl/片的體系。

鑒定具體操作方法如以上步驟1所述。完成鑒定的五倍體小麥幼苗移動到溫室繼續(xù)培養(yǎng)。

7、五倍體小麥與普通小麥taa10回交

移栽五倍體小麥的同時種植六倍體普通小麥taa10。

在抽穗期，以五倍體小麥作為母本，取幼穗去雄、套袋，以六倍體小麥taa10為父本，取其新鮮花粉授給去雄的幼穗。

8、雜交種幼胚拯救、幼苗移栽

操作步驟同以上步驟4、5所述。

9、幼苗的核型鑒定

在幼苗長出三片葉子時取根尖進(jìn)行細(xì)胞學(xué)方法鑒定核型，鑒定方法、步驟如步驟1和6所述。

在多種類型的非整倍植株中篩選具有42條染色體（染色體組成為aassdd）并且包含染色體結(jié)構(gòu)變異的新型六倍體小麥材料nhw-1。

以含有部分同源染色體重組的人工合成四倍體小麥at2（aadd）和六倍體普通小麥taa10（aabbdd）為親本，采用與上述方法相同的步驟，得到另一種親本組合的新型六倍體小麥材料nhw-2。

實施例2：人工合成四倍體小麥直接用二倍體小麥雜交、加倍獲得含有部分同源染色體重組的六倍體小麥。技術(shù)步驟如下：

1、鑒定人工合成四倍體小麥at2核型（圖3）

細(xì)胞學(xué)鑒定方法：

熒光原位雜交（fish）和基因組原位雜交（gish）探針：fish使用兩種重復(fù)序列探針pas1和psc119.2。gish用a和d基因組dna做探針雜交at2的根尖染色體，a和d基因組dna分別提取自烏拉爾圖小麥和粗山羊草。

參見實施例1中步驟1的方法。

2、分期播種雜交親本。

雜交親本為二倍體山羊草屬小麥tb01（ss）和人工合成四倍體小麥at2（aadd）。

分三期播種tb01，每期相隔10天，在種第二期tb01時，將染色體核型鑒定中發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)變異的at2材料從培養(yǎng)皿移栽到土里。

3、二倍體小麥tb01直接與四倍體小麥at2雜交

以tb01作為雜交的母本，在抽穗期取未散粉的幼穗，每個幼穗保留基部一朵小花，去掉被保留小花的雄蕊，套好雜交袋并標(biāo)注去雄日期。以at2為父本，取新鮮花粉授給tb01去雄的小花。

4、雜交種幼胚拯救

采用與實施例1中步驟4中相同的方法進(jìn)行。

5、秋水仙素加倍幼苗

幼苗選擇：在胚拯救后7天左右，幼胚膨大并長成幼苗（圖4）。待幼苗長至6厘米左右，并能用肉眼觀察到在培養(yǎng)基中生長的根時可以進(jìn)行秋水仙素加倍。

秋水仙素溶液配制：取一個用錫箔紙包裹的螺口瓶，用去離子水配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的秋水仙素，每100ml溶液加入2mldmso，用0.22μm無菌濾膜抽濾滅菌，每次根據(jù)用量現(xiàn)用現(xiàn)配。

加倍操作：將1ml移液器，1ml槍頭放入超凈工作臺滅菌30分鐘，通風(fēng)10分鐘后，用酒精棉擦凈培養(yǎng)瓶和秋水仙素玻璃瓶外壁，放入超凈工作臺內(nèi)。打開培養(yǎng)瓶，將2ml秋水仙素溶液注入培養(yǎng)基及表面，蓋好瓶蓋，放入25℃的暗培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時。

加倍后清洗：將滅菌水放入超凈工作臺滅菌30分鐘，通風(fēng)10分鐘后進(jìn)行操作。打開培養(yǎng)瓶，向瓶中輕輕倒入無菌水，搖晃清洗5分鐘，將水倒出。重復(fù)清洗5次。完成清洗的幼苗繼續(xù)放入暗培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時。

6、幼苗移栽

將暗培養(yǎng)24小時的幼苗用鑷子取出，移栽到土里，放于培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)箱的溫度及光周期為23℃/16h光照和15℃/8h黑暗。

7、加倍幼苗的核型鑒定

加倍后的幼苗大部分出現(xiàn)萎蔫死亡。正常生長的幼苗每天澆水保持土壤濕潤，待幼苗有兩個分蘗時，從土里取10個根尖進(jìn)行細(xì)胞學(xué)鑒定。

除了獲取根尖的途徑和基因組原位雜交的探針外，鑒定方法如實施例1中步驟1所述。

獲取根尖：選擇紙杯中幼苗茁壯的新根進(jìn)行染色體制片。

基因組原位雜交探針體系：探針為a和d基因組dna探針各100ng，封阻為1000ng的s基因組dna，用2ⅹssc/1ⅹte緩沖液配成6μl/片的體系。

篩選得到染色體加倍成功的單株，即擁有42條染色體（染色體組成為aassdd）的新型六倍體小麥nhw-3。

完成鑒定的幼苗移動到溫室繼續(xù)培養(yǎng)。

以含有部分同源染色體重組的人工合成四倍體小麥at1（ssdd）和二倍體烏拉爾圖小麥tmu38（aa）為親本，采用與上述方法相同的步驟，得到另一種親本組合的新型六倍體小麥材料nhw-4。