本發(fā)明涉及家畜選育技術(shù)領(lǐng)域，尤其是一種GHR基因敲除純合香豬的選育方法。

背景技術(shù)：

生長(zhǎng)激素受體(Growth hormone receptor，GHR)是一種跨膜蛋白，由單一基因編碼而成，是細(xì)胞因子受體超家族成員之一，GHR在動(dòng)物的發(fā)育生長(zhǎng)過(guò)程中及新陳代謝中發(fā)揮重要作用，其功能缺失會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物發(fā)育生長(zhǎng)變慢。豬GHR基因位于第16號(hào)染色體上，包含10個(gè)外顯子，全長(zhǎng)16.14kb，cDNA共編碼638個(gè)氨基酸，長(zhǎng)為1925bp，包括245個(gè)氨基酸構(gòu)成的胞外域(生長(zhǎng)激素結(jié)合域)、30個(gè)氨基酸構(gòu)成的跨膜域和345個(gè)氨基酸構(gòu)成的胞內(nèi)域，胞外區(qū)缺失是GHR基因功能缺失的主要原因，GHR基因胞外區(qū)包含1～6號(hào)外顯子。

從江香豬產(chǎn)地位于貴州省從江縣，是我國(guó)優(yōu)良的小型豬種，具有體型矮小的特點(diǎn)，是理想的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，具有較高的科研價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是：提供一種GHR基因敲除純合香豬的選育方法，根據(jù)該方法能選育獲得體型更小、更適合用于實(shí)驗(yàn)與科研的香豬。

本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的：GHR基因敲除純合香豬的選育方法，包括如下步驟：

1)父母本的選擇：將香豬利用鋅指核酸酶基因組編輯技術(shù)對(duì)生長(zhǎng)激素受體基因GHR進(jìn)行修飾敲除，獲得父本；以從江香豬作為母本；

2)F1代的選育：將父本與母本進(jìn)行雜交，獲得F1代，對(duì)F1代的血液樣品進(jìn)行DNA提取、PCR擴(kuò)增、測(cè)序，選留F1中測(cè)序結(jié)果為陽(yáng)性雜合子的群體；

3)F2代的選育：將F1代選留的群體進(jìn)行群內(nèi)雜交，獲得F2代，對(duì)F2代的血液樣品進(jìn)行DNA提取、PCR擴(kuò)增、測(cè)序后，選留出測(cè)序結(jié)果中缺失了4bp的堿基的群體，即獲得GHR基因敲除純合香豬。

用于PCR擴(kuò)增GHR的引物序列為：上游引物:5，

-AAGCGGTGTCTATGTGCTGATTCTC-3，，

下游引物:5，-TCAGTGGCTAGACTATATGATGTTG-3，。

由于采用了上述技術(shù)方案，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明采用從江香豬作為母本，利用鋅指核酸酶(ZFN)基因組編輯技術(shù)對(duì)生長(zhǎng)激素受體基因(GHR)進(jìn)行修飾敲除的香豬作為父本，選育獲得純合GHR基因敲除(GHR^-/-)的香豬，該方法選育獲得的香豬具有體型更小的優(yōu)點(diǎn)，為小型豬在生命科學(xué)研究中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。本發(fā)明簡(jiǎn)單易行，使用效果好。

附圖說(shuō)明

圖1為F2代香豬體尺指標(biāo)趨勢(shì)變化圖；

圖2為豬基因組DNA；

圖3為F1代和F2代豬GHR基因PCR產(chǎn)物電泳圖；

圖4為F2代GHR基因4bp堿基插入序列(GATG)測(cè)序結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明的實(shí)施例：GHR基因敲除純合香豬的選育方法，在2013年6月貴州大學(xué)香豬育種場(chǎng)開(kāi)始進(jìn)行試驗(yàn)，

1)父本母本的選擇：以貴州大學(xué)香豬場(chǎng)提供的從江香豬母豬為母本，中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室制備的GHR敲除雜合子(GHR^+/-)的香豬為父本；(父本3頭，母本6頭)

2)F1代的選育：2013年11月，上述父本母本雜交獲得F1代群體43頭，以數(shù)字標(biāo)記，每頭均取血液樣品進(jìn)行進(jìn)行DNA提取、PCR擴(kuò)增、測(cè)序后，檢測(cè)得知，其中20頭為陽(yáng)性雜合子，其余為陰性雜合子，選留所有陽(yáng)性雜合子，淘汰所有陰性雜合子。

3)F2代的選育：2015年5月，選留的F1代群體群內(nèi)雜交獲得F2代30頭，以英文字母標(biāo)記，每頭均取血液樣品進(jìn)行進(jìn)行DNA提取、PCR測(cè)序后，檢測(cè)得知，其中8頭為缺失了4bp的堿基的群體，選留該群體，淘汰其余的，即獲得GHR基因敲除純合香豬；

上述試驗(yàn)中，母豬圈舍為單列式，鋼筋混凝土結(jié)構(gòu)，水泥地面的普通級(jí)豬舍。圈欄由采食區(qū)、臥息區(qū)和運(yùn)動(dòng)場(chǎng)三部分組成。采用單圈飼養(yǎng)公豬；母豬5頭左右一圈，產(chǎn)仔前45天左右對(duì)孕豬進(jìn)行分欄，其中分娩欄為獨(dú)立圈舍，并安裝有保暖燈。從江香豬飼料分為種母豬料、種公豬料和哺乳仔豬料，日飼喂糧量按體重的4％左右進(jìn)行調(diào)整，日喂三次，分別為上午9:00、下午3:00和晚上8:00，每天沖洗圈舍一次，用鴨嘴飲水器自由飲水。

提取的GHR基因敲除香豬F1代和F2代基因組DNA取5μL DNA樣與1μL 6×Loading Buffer充分混合后，1.0％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，提取的DNA條帶整齊、完整、明亮，可直接用于PCR擴(kuò)增(見(jiàn)圖2)。用于PCR測(cè)序的引物為上游引物:5’-AAGCGGTGTCTATGTGCTGATTCTC-3’，下游引物:5’-TCAGTGGCTAGACTATATGATGTTG-3’，由生工生物工程(上海)有限公司合成，ddH₂O溶解，-20℃保存。20μL反應(yīng)體系為PCR Master Mix 10ul，ddH₂O 7ul，DNA模板1ul，上游引物1ul，下游引物1ul；GHR基因PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5min，94℃變性45s，55℃退火40s，72℃延伸45s，35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min，4℃保存。GHR基因PCR產(chǎn)物片段大小于預(yù)期大小一致(見(jiàn)圖3)。PCR產(chǎn)物送北京諾塞生物有限公司測(cè)序，從測(cè)序結(jié)果可知成功選育獲得了GHR基因敲除純合香豬(見(jiàn)圖4)。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證本發(fā)明的技術(shù)效果，申請(qǐng)人對(duì)結(jié)果進(jìn)行了如下對(duì)比驗(yàn)證：

對(duì)比1、F2代選留的GHR基因敲除純合香豬(GHR^-/-)；

對(duì)比2、F1代選留的陽(yáng)性雜合子(GHR^+/-)；

對(duì)比3、F1代淘汰的陰性豬(GHR^+/+)；

對(duì)比4、F2代淘汰的陽(yáng)性雜合子豬(GHR^+/-)；

對(duì)比5、從江香豬純繁后代(從江♂×從江♀)；

根據(jù)觀察對(duì)比，F(xiàn)2代GHR基因敲除香豬體尺指標(biāo)隨年齡增加F2代陽(yáng)性豬體重明顯小于陰性豬，6月齡時(shí)，GHR基因敲除陽(yáng)性豬體重減少了35％；陽(yáng)性豬的體長(zhǎng)，胸圍，腹圍等指標(biāo)隨年齡增加同樣明顯小于陰性豬；但隨年齡增加，陽(yáng)性豬的體高與陰性豬相比變化不大，6月齡時(shí)趨向一致(見(jiàn)圖1，表1)。F1代GHR基因敲除陽(yáng)性豬與陰性豬在體重、體尺方面的差異均不顯著(P>0.05)(見(jiàn)表2)。2、3、4、5、6月齡時(shí)體重、體長(zhǎng)、體高、胸圍GHR+/+香豬與GHR+/-香豬差異不顯著(P>0.05)，GHR+/+香豬、GHR+/-香豬均小于從江香豬且差異顯著(P<0.05)；GHR+/+香豬、GHR+/-香豬、從江香豬在2-4月齡生長(zhǎng)速度逐漸加快，5-6月齡逐漸降低，最高出現(xiàn)在4月齡。

表1 F2代GHR基因敲除豬生長(zhǎng)指標(biāo)測(cè)定結(jié)果

備注：同行帶*者表示差異顯著(0.01＜P＜0.05)，帶**者表示差異極顯著(P＜0.01)

表2 F1代GHR基因敲除香豬、從江香豬生長(zhǎng)發(fā)育指標(biāo)測(cè)定結(jié)果

注：1,2,3分別代表GHR+/-香豬，GHR+/+香豬，從江香豬；表中數(shù)值為最小二乘均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤。同時(shí)期時(shí)同列中不同肩標(biāo)小寫字母表示差異性顯著(P<0.05)。

SEQUENCE LISTING

序列表

<110> 貴州大學(xué)

<120> GHR基因敲除純合香豬的選育方法

<130> nm:

<160> 2

<170> PatentIn version

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>根據(jù)豬GHR基因片段序列設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物，用Primer5.0軟件設(shè)計(jì),以用于PCR擴(kuò)增。

<400> 1

AAGCG GTGTC TATGT GCTGA TTCTC 25

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>根據(jù)豬GHR基因片段序列設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物，用Primer5.0軟件設(shè)計(jì),以用于PCR擴(kuò)增。

<400> 2

TCAGT GGCTA GACTA TATGA TGTTG 25