本發(fā)明涉及一種精子稀釋液及其配制方法和利用該稀釋液冷凍、冷藏保存精子的方法。

背景技術(shù)：

現(xiàn)有技術(shù)通常利用動物源稀釋液來存儲動物精子，而動物源稀釋液如卵黃稀釋液會引入其他動物源的病原微生物，給人工授精母畜群帶來疾病，特別是在配制稀釋液時加入大量的抗生素，不規(guī)范使用抗生素以致超級細(xì)菌產(chǎn)生。卵黃稀釋液現(xiàn)用現(xiàn)配不易保存,不用的卵黃膜內(nèi)含卵黃及蛋清和蛋殼在垃圾桶內(nèi)不及時處理,實(shí)驗(yàn)室容易有臭雞蛋的味道，污染環(huán)境。卵黃稀釋液在顯微鏡下觀察精子活力，由于存在卵黃顆粒使視野不清晰，不易于觀察。

也有研究者利用無動物源的物質(zhì)制備動物精子稀釋液，但是該稀釋液利用的物質(zhì)如咖啡因?qū)儆诮N藥品，不適合大批量推廣應(yīng)用，而且有精子活力不持久、存活時間短的問題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是為了解決傳統(tǒng)方法制備的動物精子稀釋液的觀察視野不清晰、易污染、存活時間短和不規(guī)范使用抗生素以致超級細(xì)菌產(chǎn)生的問題，而提供了動物精子稀釋液及其配制方法和利用該稀釋液冷凍、冷藏保存精子的方法。

本發(fā)明的動物精子稀釋液由丙三醇、葡萄糖、果糖、三羥甲基氨基甲烷、檸檬酸、脫脂小麥蛋白粉(蛋白質(zhì)、小麥蛋白肽)、脫脂豌豆蛋白粉(蛋白質(zhì)、K因子、胡蘿卜素、維生素Bt、維生素E、維生素C)、脫脂花生蛋白粉(蛋白質(zhì)、鈣、磷、鐵、硫胺素，棕櫚酸、維生素A、B、C、E、K、)、脫脂大豆蛋白粉(蛋白質(zhì)、卵磷脂、植物免疫因子、植物微量元素)和滅菌蒸餾水組成。

本發(fā)明的動物精子稀釋液的制備方法按以下步驟進(jìn)行：

一、用分析天平稱三羥甲基氨基甲烷和滅菌蒸餾水，在容量瓶中混合溶解，得混合物；所述三羥甲基氨基甲烷的質(zhì)量與滅菌蒸餾水的體積比為(20.00g-30.00g)：(180mL-190mL)；

二、分別稱取：0.5-1g脫脂大豆蛋白粉、0.1g-0.5g脫脂豌豆蛋白粉、0.5g-1g脫脂花生蛋白粉,0.1g-0.5g脫脂小麥蛋白粉溶于步驟一的混合物中，超聲波裂解大分子蛋白、細(xì)菌、病毒等微生物，獲得低分子蛋白或多肽混合的無菌溶液；放入0-8℃冷藏沉降24h-48h；

三、棄去步驟二中的沉淀物，得上清液；在分析天平上稱取10g-20g檸檬酸、10g-20g葡萄糖、10g-20g果糖和50mL-100mL丙三醇加入上述上清液中，超聲波混勻裂解細(xì)菌病毒等微生物，放入0-8℃冷藏得到濃縮比例為5×的動物精子稀釋液。

本發(fā)明利用動物精子稀釋液冷凍保存精子的方法按以下步驟進(jìn)行：

一、將采集到的動物精液放入保溫瓶內(nèi)，溫度保持在20-35℃，帶到實(shí)驗(yàn)室；

二、將步驟一中的動物精液用分光光度計(jì)測量密度，用本發(fā)明提供的動物精子稀釋液按精子數(shù)300-1000萬/mL稀釋，用0.25mL的凍精細(xì)管，用灌封機(jī)將稀釋好的精液灌裝到細(xì)管中并封口；

三、將步驟二中的細(xì)管精液放到降溫柜中，以0.1-0.5℃/min的速度降溫，降到0-4℃；

四、將步驟三中的細(xì)管精液平衡1h-2h；

五、將步驟四的細(xì)管精液放到液氮上邊，距離液氮面高度1.0cm-2.5cm，溫度約為零下100℃-120℃，熏蒸5min-15min，直接投到液氮里，在液氮里把細(xì)管凍精裝到紗布袋里備用。

本發(fā)明利用動物精子稀釋液冷藏保存精子的方法按以下步驟進(jìn)行：

一、將采集到的動物精液放入保溫瓶內(nèi)，溫度保持在20-35℃，帶到實(shí)驗(yàn)室；

二、將步驟一中的精液用分光光度計(jì)測量密度，用稀釋液按精子數(shù)300-1000萬/mL稀釋，用0.25mL的凍精細(xì)管，用灌封機(jī)將稀釋好的精液灌裝到凍精細(xì)管中并封口；

三、將步驟二中的細(xì)管精液放到降溫柜中，以0.1-0.5℃/min的速度降溫，降到0-4℃?zhèn)溆谩?/p>

本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)：

1.相對于現(xiàn)有技術(shù)而言，本發(fā)明的動物精子稀釋液中添加植物提取物(植物蛋白、植物多肽、植物微量元素、植物因子、卵磷脂、免疫因子、維生素、棕櫚酸、K因子等)，對提高冷凍或冷藏保存的精子活力和延長保存時間起了重要的作用，避免了添加興奮劑咖啡因，咖啡因雖能提高精子活力但縮短了存活時間，咖啡因是禁銷藥品，妨礙了大量配制和使用推廣；避免了添加抗生素和濫用抗生素以致超級細(xì)菌產(chǎn)生。避免了動物源稀釋液如卵黃稀釋液會引入其他動物源的病原微生物，給人工授精母畜群帶來疾病。

2.在原技術(shù)添加大豆蛋白粉的基礎(chǔ)上又改進(jìn)添加脫脂大豆蛋白粉、脫脂花生蛋白粉、脫脂豌豆蛋白粉和脫脂小麥蛋白粉，與現(xiàn)有技術(shù)相比本方法制得的動物精子稀釋液使冷凍的精子活力提高1％-3％個點(diǎn)，冷藏保存的精子存活時間延長1-2天。

3.經(jīng)過改進(jìn)動物精子稀釋液現(xiàn)有配制方法，得到5倍濃縮和保質(zhì)期24個月的精子稀釋液。

4.可以工廠化生產(chǎn)動物精子稀釋液來冷凍、冷藏保存精子，省時省力，推廣應(yīng)用前景廣闊。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明技術(shù)方案不局限于以下所列舉具體實(shí)施方案，還包括各具體實(shí)施方式間的任意組合。

具體實(shí)施方式一：本實(shí)施方式的動物精子稀釋液由丙三醇、葡萄糖、果糖、三羥甲基氨基甲烷、檸檬酸、脫脂小麥蛋白粉、脫脂豌豆蛋白粉、脫脂花生蛋白粉、脫脂大豆蛋白粉和滅菌蒸餾水組成。

具體實(shí)施方式二：如具體實(shí)施方式一所述的動物精子稀釋液的制備方法按以下步驟進(jìn)行：

一、用分析天平稱三羥甲基氨基甲烷和滅菌蒸餾水，在容量瓶中混合溶解，得混合物；所述三羥甲基氨基甲烷的質(zhì)量與滅菌蒸餾水的體積比為(20.00g-30.00g)：(180mL-190mL)；

二、分別稱?。?.5-1g脫脂大豆蛋白粉、0.5g-1g脫脂豌豆蛋白粉、0.5g-1g脫脂花生蛋白粉,0.1g-0.5g脫脂小麥蛋白粉溶于步驟一的混合物中，超聲波裂解大分子蛋白、細(xì)菌和病毒，獲得低分子蛋白或多肽混合的無菌溶液；放入0-8℃冷藏沉降24h-48h；

三、棄去步驟二中的沉淀物，得上清液；在分析天平上稱取10g-20g檸檬酸、10g-20g葡萄糖、10g-20g果糖和50mL-100mL丙三醇加入上述上清液中，超聲波混勻裂解細(xì)菌和病毒，放入4℃冷藏得到動物精子稀釋液。

具體實(shí)施方式三：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式二不同的是，所述三羥甲基氨基甲烷的質(zhì)量與滅菌蒸餾水的體積比為20.00g：180mL。其他步驟與參數(shù)與具體實(shí)施方式二相同。

具體實(shí)施方式四：利用具體實(shí)施方式一所述的動物精子稀釋液冷凍保存精子的方法按以下步驟進(jìn)行：

一、將采集到的動物精液放入保溫瓶內(nèi)，溫度保持在20-35℃，帶到實(shí)驗(yàn)室；

二、將步驟一中的動物精液用分光光度計(jì)測量密度，用本發(fā)明提供的動物精子稀釋液按精子數(shù)300-1000萬/mL稀釋，用0.25mL的凍精細(xì)管，用灌封機(jī)將稀釋好的精液灌裝到細(xì)管中并封口；

三、將步驟二中的細(xì)管精液放到降溫柜中，以0.1-0.5℃/min的速度降溫，降到0-4℃；

四、將步驟三中的細(xì)管精液平衡1h-2h；

五、將步驟四的細(xì)管精液放到液氮上邊，距離液氮面高度1.0cm-2.0cm，溫度約為零下100℃-120℃，熏蒸5min-15min，直接投到液氮里，在液氮里把細(xì)管凍精裝到紗布袋里備用。

具體實(shí)施方式五：利用具體實(shí)施方式一所述的動物精子稀釋液冷藏保存精子的方法按以下步驟進(jìn)行：

一、將采集到的動物精液放入保溫瓶內(nèi)，溫度保持在20-35℃，帶到實(shí)驗(yàn)室；

二、將步驟一中的精液用分光光度計(jì)測量密度，用稀釋液按精子數(shù)300-1000萬/mL稀釋，用0.25mL的凍精細(xì)管，用灌封機(jī)將稀釋好的精液灌裝到凍精細(xì)管中并封口；

三、將步驟二中的細(xì)管精液放到降溫柜中，以0.1-0.5℃/min的速度降溫，降到0-4℃?zhèn)溆谩?/p>

實(shí)施例1

本實(shí)施例的動物精子稀釋液的制備方法按以下步驟進(jìn)行：

一、用分析天平稱三羥甲基氨基甲烷和滅菌蒸餾水，在容量瓶中混合溶解，得混合物；所述三羥甲基氨基甲烷的質(zhì)量與滅菌蒸餾水的體積比為20.00g：180mL；

二、分別稱?。?.5g脫脂大豆蛋白粉、0.1g脫脂豌豆蛋白粉、0.5g脫脂花生蛋白粉,0.2g脫脂小麥蛋白粉溶于步驟一的混合物中，超聲波裂解大分子蛋白、細(xì)菌、病毒等微生物，獲得低分子蛋白或多肽混合的無菌溶液；放入4℃冷藏沉降24h；

三、棄去步驟二中的沉淀物，得上清液；在分析天平上稱取12g檸檬酸、15g葡萄糖、10g果糖和50mL丙三醇加入上述上清液中，超聲波混勻裂解蛋白、細(xì)菌、病毒等微生物，放入4℃冷藏得到動物精子稀釋液。

利用動物精子稀釋液冷凍保存精子的方法按以下步驟進(jìn)行：

一、將采集到的狗的精液放入保溫瓶內(nèi)，溫度保持在28℃；

二、將步驟一中的動物精液用分光光度計(jì)測量密度，用本發(fā)明提供的動物精子稀釋液按精子數(shù)500萬/mL稀釋，用0.25mL的凍精細(xì)管，用灌封機(jī)將稀釋好的精液灌裝到細(xì)管中并封口；

三、將步驟二中的細(xì)管精液放到降溫柜中，以0.2℃/min的速度降溫，降到4℃；

四、將步驟三中的細(xì)管精液平衡1h；

五、將步驟四的細(xì)管精液放在液氮上方，距離液氮面高度2.5cm，溫度約為零下110℃，熏蒸10min，直接投到液氮里，在液氮里把細(xì)管凍精裝到紗布袋里備用。

本發(fā)明利用動物精子稀釋液冷藏保存精子的方法按以下步驟進(jìn)行：

一、將采集到的狗的精液放入保溫瓶內(nèi)，溫度保持在28℃；

二、將步驟一中的精液用分光光度計(jì)測量密度，用稀釋液按精子數(shù)600萬/mL稀釋，用0.25mL的凍精細(xì)管，用灌封機(jī)將稀釋好的精液灌裝到凍精細(xì)管中并封口；

三、將步驟二中的細(xì)管精液放到降溫柜中，以0.4℃/min的速度降溫，降到4℃?zhèn)溆谩?/p>

本實(shí)施例得到的動物精子稀釋液冷凍保存的精子活力為0.48，存活時間為7-12天，冷藏保存的精子的精子活力為0.6，存活時間為10-15天。