該申請(qǐng)要求2010年2月16日遞交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/338263和2010年8月4日遞交的61/370713的權(quán)益，兩者通過(guò)引用以其整體結(jié)合到本文中。

背景

全血為活組織，其循環(huán)通過(guò)心臟、動(dòng)脈、靜脈和毛細(xì)血管，向身體組織輸送營(yíng)養(yǎng)物、電解質(zhì)、抗體、熱量和氧氣。全血包括懸浮于稱為血漿的蛋白質(zhì)流體中的紅細(xì)胞(RBC)、白細(xì)胞和血小板。如果血液被處理以防止凝血和允許保持在容器中，那么RBC將沉降至容器的底部，血漿將保持在上面，而白細(xì)胞將形成RBC上面的層。離心機(jī)通常用于加速這種分離。然后去除富含血小板的血漿，并置于無(wú)菌袋中用于進(jìn)一步處理，以分離例如血小板、凝血因子、白蛋白、免疫球蛋白等。

用于通常輸血需要的最重要的組分為紅細(xì)胞或RBC，其含有血紅蛋白，血紅蛋白為復(fù)雜的含鐵蛋白，其輸送氧氣經(jīng)過(guò)全身并賦予血液其紅顏色。由RBC組成的血量的百分?jǐn)?shù)稱為“血細(xì)胞比容”。成年男性體內(nèi)的平均血細(xì)胞比容為47%。在兩或三滴血液中存在約10億個(gè)RBC，并且每600個(gè)RBC存在約40個(gè)血小板和1個(gè)白細(xì)胞。

RBC在骨髓中制造，無(wú)核、雙凹面圓盤狀，其不斷產(chǎn)生、分解和消滅。雙凹面圓盤狀對(duì)于RBC的功能(呈現(xiàn)最大表面積用于在肺部捕獲氧氣及在組織釋放氧氣)至關(guān)重要。細(xì)胞為柔性的并且能夠彎曲，以穿過(guò)毛細(xì)血管床的微小細(xì)管。因?yàn)樵摷?xì)胞無(wú)核并且沒(méi)有線粒體，其不能進(jìn)行細(xì)胞修復(fù)過(guò)程并且必須依賴厭氧磷酸化獲得能量。在循環(huán)系統(tǒng)中平均120天之后，細(xì)胞衰老并被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的循環(huán)單核細(xì)胞或固定巨噬細(xì)胞吞噬。

RBC通過(guò)去除血漿自全血制備。當(dāng)輸血給患者時(shí)，血細(xì)胞比容升高，而血量增加減至最小，這對(duì)于患有充血性心力衰竭的患者尤其重要。通常將細(xì)胞懸浮于約一半的原始體積中；制劑稱為濃集紅細(xì)胞(packed red cell)。最受益于輸入RBC的患者包括由于諸如腎衰竭、惡性腫瘤、胃腸道出血或因創(chuàng)傷或手術(shù)造成的急性失血等病癥而患有慢性頑固性貧血的那些患者。

因?yàn)榛颊吆苌傩枰械乃薪M分，血庫(kù)的通常做法是將血液分離成各組分，并且僅輸入患者對(duì)于具體病況或疾病所需要的部分。這種治療，稱為“血液組分療法”，允許一些患者受益于每單位的血液。不幸的是，分離血液組分用于療法對(duì)于RBC不利，導(dǎo)致儲(chǔ)存損傷，其特征在于標(biāo)記物2,3-二磷酸甘油酸酯(2,3-DPG)減少，氧自由基的產(chǎn)生增加和形態(tài)學(xué)變化。

用于儲(chǔ)存全血的標(biāo)準(zhǔn)溶液包括檸檬酸鹽-磷酸鹽-葡萄糖溶液(CPD)和檸檬酸鹽-磷酸鹽-葡萄糖-腺嘌呤溶液(CPDA)。檸檬酸鹽或其它抗凝劑比如肝素對(duì)于防止凝血是必要的。因?yàn)檠簽楸３执x功能的活組織，甚至在冷藏溫度下亦如此，已經(jīng)認(rèn)為其對(duì)提供能源比如葡萄糖是必要的。磷酸鹽離子可用于緩沖自葡萄糖利用產(chǎn)生的乳酸鹽。

在最近的15年內(nèi)細(xì)胞保存液的改進(jìn)已將全血或RBC的冷藏保質(zhì)期從21天增加至42天。在42天后，丟棄血液，因?yàn)樵S多細(xì)胞已經(jīng)變得衰老，并可在輸給接受者時(shí)立即被吞噬。盡管紅細(xì)胞在儲(chǔ)存中可能呈現(xiàn)存活5或6周，但是它們迅速出現(xiàn)儲(chǔ)存損傷，其特征在于溶血和/或生物化學(xué)和生物力學(xué)變化，這些特征可損害其存活時(shí)間及其接受、運(yùn)輸和卸載氧氣至組織的能力。因此期望使用抽血后3周或更短時(shí)間內(nèi)的全血和血液制品。

仍然需要一種溶液，全血中的血細(xì)胞或濃集紅細(xì)胞懸浮液可在延長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)儲(chǔ)存在該溶液中并且當(dāng)輸給接受者時(shí)其在功能上存活。還仍然需要一種用于使功能欠佳的血液和RBC復(fù)原(rejuvenate)的方法。

概述

在輸血之前采集和儲(chǔ)存RBC的方法在改進(jìn)血庫(kù)實(shí)踐中仍然是一個(gè)挑戰(zhàn)。RBC可在4℃下儲(chǔ)存42天，但是雖有抗凝劑溶液和血液添加劑的改進(jìn)，超過(guò)這個(gè)時(shí)間則出現(xiàn)RBC儲(chǔ)存損傷。RBC的最顯著儲(chǔ)存損傷為a) 2,3-DPG貧乏，造成血液向組織卸載氧氣的能力降低，導(dǎo)致氧親和力增加；b) 減少細(xì)胞活力，增加脆弱性和減少變形性的形態(tài)改變，影響細(xì)胞穿過(guò)微循環(huán)的能力；和c) 釋放導(dǎo)致發(fā)熱、細(xì)胞損傷和組織功能障礙的生化物質(zhì)。這些儲(chǔ)存損傷主要起因于細(xì)胞能量(即三磷酸腺苷或ATP)貧乏以及與能量代謝減少有關(guān)的乳酸積聚。

減慢2,3-DPG貧乏和ATP損失速率的實(shí)驗(yàn)添加劑溶液為已知的，參見例如Dawson等, Prog Glin Biol Res. 1985;195:349-68; Dawson等, Transfusion 1984 Jul-Aug; 24(4):327-9; Dawson等, Hum Pathol. 1983 Mar; 14(3):213-7; Dawson等, Transfusion 1981 May-Jun; 21(3):285-90;和Dawson等, Transfusion 1981 Mar-Apr; 21(2):215。這些實(shí)驗(yàn)溶液通常包含一系列的無(wú)機(jī)磷酸鹽和肌苷。雖然這些溶液能夠在某種程度上保持2,3-DPG水平，但是對(duì)溶液組分的要求產(chǎn)生一些問(wèn)題，限制了其效用。一個(gè)問(wèn)題是肌苷的溶解性低，這造成向RBC中加入漿液，后來(lái)需要在輸血之前洗滌細(xì)胞。另一個(gè)問(wèn)題是生化進(jìn)程，該進(jìn)程導(dǎo)致形成潛在毒性的分解產(chǎn)物比如次黃嘌呤和尿酸。另外，輸血制品必須在輸血之前溫?zé)?小時(shí)，這影響這類添加劑溶液在目前血庫(kù)實(shí)踐中的實(shí)用性。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本文公開的血液儲(chǔ)存和/或復(fù)原組合物解決這些問(wèn)題中的一個(gè)或多個(gè)。

一方面，本公開提供血液儲(chǔ)存和/或復(fù)原組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，組合物包含D-核糖和L-精氨酸和/或D-精氨酸(并且優(yōu)選地為L(zhǎng)-精氨酸)。任選地，組合物可進(jìn)一步包含丙酮酸鈉、無(wú)機(jī)磷酸鹽和肌苷中的一種或更多種。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，組合物為水溶液。亦公開了使用這種組合物的方法。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，血液儲(chǔ)存和/或復(fù)原組合物包含：75-1500 mM L-精氨酸和/或D-精氨酸(并且優(yōu)選地為L(zhǎng)-精氨酸)；和75-1500 mM肌苷，其中組合物為水溶液。任選地，組合物可進(jìn)一步包含濃度為例如75-1500 mM的D-核糖。任選地，組合物可進(jìn)一步包含濃度為例如75-1500 mM的丙酮酸鈉。任選地，組合物可進(jìn)一步包含濃度為例如75-1500 mM的無(wú)機(jī)磷酸鹽。當(dāng)用于儲(chǔ)存和/或復(fù)原血液時(shí)，組合物通常被稀釋約30倍，以提供最終濃度為2.5-50 mM的L-精氨酸和/或D-精氨酸(并且優(yōu)選地為L(zhǎng)-精氨酸)；2.5-50 mM的肌苷；和任選地2.5-50 mM的D-核糖、2.5-50 mM的丙酮酸鈉和/或2.5-50 mM的無(wú)機(jī)磷酸鹽。

在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，血液儲(chǔ)存和/或復(fù)原組合物包含：150-900 mM L-精氨酸和/或D-精氨酸(并且優(yōu)選地為L(zhǎng)-精氨酸)；和150-900 mM肌苷，并且組合物為水溶液。任選地，組合物可進(jìn)一步包含濃度為例如150-900 mM的D-核糖。任選地，組合物可進(jìn)一步包含濃度為例如150-900 mM的丙酮酸鈉。任選地，組合物可進(jìn)一步包含濃度為例如150-900 mM的無(wú)機(jī)磷酸鹽。當(dāng)用于儲(chǔ)存和/或復(fù)原血液時(shí)，組合物通常被稀釋約30倍，以提供最終濃度為5-30 mM的L-精氨酸和/或D-精氨酸(并且優(yōu)選地為L(zhǎng)-精氨酸)；和5-30 mM的肌苷；和任選地5-30 mM的D-核糖、5-30 mM的丙酮酸鈉和/或5-30 mM的無(wú)機(jī)磷酸鹽。

在其它優(yōu)選的實(shí)施方案中，血液儲(chǔ)存和/或復(fù)原組合物包含：300-600 mM L-精氨酸和/或D-精氨酸(并且優(yōu)選地為L(zhǎng)-精氨酸)；和300-600 mM肌苷，并且組合物為水溶液。任選地，組合物可進(jìn)一步包含濃度為例如300-600 mM的D-核糖。任選地，組合物可進(jìn)一步包含濃度為例如300-600 mM的丙酮酸鈉。任選地，組合物可進(jìn)一步包含濃度為例如300-600 mM的無(wú)機(jī)磷酸鹽。當(dāng)用于儲(chǔ)存和/或復(fù)原血液時(shí)，組合物通常被稀釋約30倍，以提供最終濃度為10-20 mM的L-精氨酸和/或D-精氨酸(并且優(yōu)選地為L(zhǎng)-精氨酸)；和10-20 mM的肌苷；和任選地10-20 mM的D-核糖、10-20 mM的丙酮酸鈉和/或10-20 mM的無(wú)機(jī)磷酸鹽。

在某些實(shí)施方案中，L-精氨酸與肌苷的摩爾比為0.5:1-1.5:1。在其它某些實(shí)施方案中，L-精氨酸與肌苷的摩爾比為0.8:1-1.2:1。在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，L-精氨酸與肌苷的摩爾比為1:1。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，血液儲(chǔ)存和/或復(fù)原組合物包含：300 mM L-精氨酸、300 mM肌苷、300 mM D-核糖、300 mM丙酮酸鈉和300 mM無(wú)機(jī)磷酸鹽，其中組合物為水溶液。當(dāng)用于儲(chǔ)存和/或復(fù)原血液時(shí)，組合物通常被稀釋約30倍，以提供最終濃度為10 mM的L-精氨酸、10 mM的肌苷、10 mM的D-核糖、10 mM的丙酮酸鈉和10 mM的無(wú)機(jī)磷酸鹽。

在某些實(shí)施方案中，本文描述的血液儲(chǔ)存和/或復(fù)原組合物可進(jìn)一步包含氯化鈉、葡萄糖、腺嘌呤、甘露醇、檸檬酸鈉和檸檬酸中的一種或更多種。

對(duì)于一個(gè)實(shí)例，血液儲(chǔ)存和/或復(fù)原組合物可為包含以下的添加劑溶液：L-精氨酸、肌苷、D-核糖、丙酮酸鈉、無(wú)機(jī)磷酸鹽、氯化鈉、葡萄糖、腺嘌呤和甘露醇。這類添加劑溶液特別可用于含有選自以下的抗凝劑的儲(chǔ)存和/或復(fù)原血液：ACD、CPD、CPDA-1及其組合。

對(duì)于另一個(gè)實(shí)例，血液儲(chǔ)存和/或復(fù)原組合物可為包含以下的添加劑溶液：L-精氨酸、肌苷、D-核糖、丙酮酸鈉、無(wú)機(jī)磷酸鹽、氯化鈉、葡萄糖、腺嘌呤、檸檬酸鈉和檸檬酸。這類添加劑溶液特別可用于儲(chǔ)存和/或復(fù)原含有CP2D抗凝劑的血液。

本文描述了用于儲(chǔ)存和/或復(fù)原RBC的方法。例如在美國(guó)專利申請(qǐng)公開號(hào)2007/0111191 Al (St. Cyr等)、美國(guó)專利號(hào)7687468 (St. Cyr等)和與此同一天遞交的標(biāo)題為“NUCLEOSIDE-CONTAINING COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING RED BLOOD CELLS (含有核苷的組合物和用于處理紅細(xì)胞的方法)”(律師備案號(hào)374.0003010 1)的同時(shí)待審美國(guó)專利申請(qǐng)系列號(hào)中描述了另外的方法。

另一方面，本公開進(jìn)一步提供改進(jìn)儲(chǔ)存的RBC的抗氧化防護(hù)的方法。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括使RBC與本文描述的血液儲(chǔ)存和/或復(fù)原組合物接觸。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括使包含RBC和抗凝劑的組合物與本文描述的添加劑溶液接觸，其中抗凝劑選自ACD、CPD、CPDA-1及其組合。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括使包含RBC和抗凝劑的組合物與本文描述的添加劑溶液接觸，其中抗凝劑為CP2D。

在該申請(qǐng)中描述的技術(shù)描述了RBC儲(chǔ)存和/或復(fù)原組合物，該組合物在優(yōu)選的實(shí)施方案中不呈現(xiàn)與肌苷有關(guān)的溶解困難，不產(chǎn)生高水平的分解產(chǎn)物，和/或不需要在輸血之前溫?zé)酭BC。本文描述的儲(chǔ)存和/或復(fù)原組合物包含戊糖碳水化合物(例如D-核糖)，其可用于輔助嘌呤核苷酸(包括ATP)的從頭合成和代謝再利用。儲(chǔ)存和/或復(fù)原組合物也可包含無(wú)機(jī)磷酸鹽(可用作磷酸解的底物)和/或丙酮酸鈉(可用作NAD源和使得1,3-二磷酸甘油酸酯轉(zhuǎn)化為2,3-DPG或3-磷酸甘油酸酯)。在一個(gè)實(shí)施方案中，L-精氨酸用于充分溶解肌苷。

定義

術(shù)語(yǔ)“包含”及其變體，當(dāng)這些術(shù)語(yǔ)在說(shuō)明書和權(quán)利要求書中出現(xiàn)時(shí)，不具有限定的含義。

本文使用的“一個(gè)”、“一種”、“該”、“至少一個(gè)”和“一個(gè)或更多個(gè)”可互換使用。

而且本文通過(guò)端點(diǎn)敘述的數(shù)值范圍包括包含在該范圍內(nèi)的所有數(shù)值(例如1-5包括1、1.5、2、2.75、3、3.80、4、5等)。

ACD (檸檬酸葡萄糖)為抗凝劑和防腐劑溶液，據(jù)報(bào)道其1升在水中含有22.0 g檸檬酸三鈉(二水合物)、8.0 g檸檬酸(一水合物)和24.5 g葡萄糖(一水合物)。

CPD (檸檬酸鹽磷酸鹽葡萄糖)為抗凝劑和防腐劑溶液，據(jù)報(bào)道其1升在水中含有26.30 g檸檬酸三鈉(二水合物)、3.27 g檸檬酸(一水合物)、2.22 g磷酸二氫鈉(一水合物)和25.5 g葡萄糖(一水合物)。

CPDA-1 (檸檬酸鹽磷酸鹽葡萄糖腺嘌呤)為抗凝劑和防腐劑溶液，據(jù)報(bào)道其1升在水中含有26.30 g檸檬酸三鈉(二水合物)、3.27 g檸檬酸(一水合物)、2.22 g磷酸二氫鈉(一水合物)、31.9 g葡萄糖(一水合物)和0.275 g腺嘌呤。

CP2D (檸檬酸鹽磷酸鹽雙葡萄糖)為抗凝劑和防腐劑溶液，據(jù)報(bào)道其1升在水中含有26.30 g檸檬酸三鈉(二水合物)、3.27 g檸檬酸(一水合物)、2.22 g磷酸二氫鈉(一水合物)和51.1 g葡萄糖(一水合物)。

AS1為與檸檬酸鹽磷酸鹽葡萄糖型抗凝劑溶液(例如CPD和CPDA-1)一起使用的添加劑溶液，據(jù)報(bào)道其100 ml含有2.20 g葡萄糖(一水合物)、27 mg腺嘌呤、750 mg甘露醇和900 mg氯化鈉。添加劑溶液通常在RBC與血漿分離之后加入到RBC中。

AS3為與CP2D抗凝劑溶液一起使用的添加劑溶液，據(jù)報(bào)道其100 ml含有1.1 g葡萄糖(無(wú)水)、30 mg腺嘌呤、276 mg磷酸二氫鈉(一水合物)、410 mg氯化鈉、588 mg檸檬酸鈉(二水合物)和42 mg檸檬酸(一水合物)。添加劑溶液通常在RBC與血漿分離之后加入到RBC中。

AS5為與檸檬酸鹽磷酸鹽葡萄糖型抗凝劑溶液(例如CPD和CPDA-1)一起使用的添加劑溶液，據(jù)報(bào)道其100 ml含有900 mg葡萄糖(一水合物)、30 mg腺嘌呤、525 mg甘露醇和877 mg氯化鈉。添加劑溶液通常在RBC與血漿分離之后加入到RBC中。

以上本發(fā)明各種實(shí)施方案的簡(jiǎn)述并非意欲描述本發(fā)明的每個(gè)實(shí)施方案或每一實(shí)施。相反，考慮到附圖并通過(guò)參照以下描述和權(quán)利要求書，本發(fā)明的更完整理解將變得顯而易見和意識(shí)到。進(jìn)一步應(yīng)該理解，可采用其它實(shí)施方案并可進(jìn)行結(jié)構(gòu)變化而不背離本發(fā)明的范圍。

附圖簡(jiǎn)述

圖1為顯示2,3-DPG水平(無(wú)2,3-DPG; 正常水平的2,3-DPG; 和增加2,3-DPG)的影響的氧解離曲線的圖示，血氧飽和度(%)標(biāo)繪在y-軸，和P₀₂ (mm Hg)標(biāo)繪在x-軸。

圖2為顯示對(duì)于人血使用本發(fā)明的實(shí)施方案(溶液A)和對(duì)照的2,3-DPG水平(毫摩爾2,3-DPG/升紅細(xì)胞)相對(duì)于儲(chǔ)存時(shí)間(天)的圖解說(shuō)明。

圖3為顯示對(duì)于人血使用本發(fā)明的實(shí)施方案(溶液A)和對(duì)照的ATP水平(ATP, %基線)相對(duì)于儲(chǔ)存時(shí)間(天)的圖解說(shuō)明。

圖4為顯示對(duì)于人血使用本發(fā)明的實(shí)施方案(溶液A)和對(duì)照的還原型谷胱甘肽水平(%基線)相對(duì)于儲(chǔ)存時(shí)間(天)的圖解說(shuō)明。

圖5為顯示對(duì)于人血使用本發(fā)明的實(shí)施方案(溶液A)和對(duì)照的P50水平(mm Hg)相對(duì)于儲(chǔ)存時(shí)間(天)的圖解說(shuō)明。

圖6為顯示對(duì)于人血使用本發(fā)明的實(shí)施方案(溶液D和E)和對(duì)照的2,3-DPG水平(毫摩爾2,3-DPG/升紅細(xì)胞)相對(duì)于儲(chǔ)存時(shí)間(天)的圖解說(shuō)明。

圖7為顯示對(duì)于人血使用本發(fā)明的實(shí)施方案(溶液D和E)和對(duì)照的ATP水平(ATP, %基線)相對(duì)于儲(chǔ)存時(shí)間(天)的圖解說(shuō)明。

圖8為顯示對(duì)于人血使用本發(fā)明的實(shí)施方案(溶液D和E)和對(duì)照的pH相對(duì)于儲(chǔ)存時(shí)間(天)的圖解說(shuō)明。

圖9為顯示對(duì)于人血使用本發(fā)明的實(shí)施方案(溶液D和E)和對(duì)照的還原型谷胱甘肽水平(%)相對(duì)于儲(chǔ)存時(shí)間(天)的圖解說(shuō)明。

說(shuō)明性實(shí)施方案的詳述

在1915年，首次嘗試從捐獻(xiàn)者直接向接受者輸血。在第一次世界大戰(zhàn)之后的數(shù)年間，實(shí)踐隨著使用檸檬酸鹽葡萄糖溶液采集血液、使用冷藏和血型檢定而改進(jìn)。然后，在20世紀(jì)60年代和20世紀(jì)70年代，改進(jìn)持續(xù)，此時(shí)用耐用塑料袋替代玻璃瓶?jī)?chǔ)存、開發(fā)了更好的抗凝劑以及加入甘露醇和腺嘌呤使得RBC能夠儲(chǔ)存42天。參見例如Bartlett等, J Clin. Invest. 1960; 39:56; Bunn等, J Clin. Invest. 1969; 48:311; Akerblom等, Scand. J. Clin. Lab. Invest. 1968; 21:245-248; 和Delivoria-Papadopoulos等, Science 1969; 165:601-602?，F(xiàn)今，血液仍然用包含腺嘌呤和檸檬酸鹽的各種抗凝劑溶液保存。血液于4℃下儲(chǔ)存，用塑料血袋采集，并且如果在42天內(nèi)未使用，則丟棄，這是因?yàn)樵谀侵驲BC活力極大喪失。當(dāng)RBC死亡，溶解的細(xì)胞釋放更持久的血紅蛋白分子，后者具有低的P50，并且呈現(xiàn)對(duì)氧氣擴(kuò)散的阻擋?，F(xiàn)今有人估計(jì)在美國(guó)每年輸血約1600萬(wàn)單位的RBC。

RBC在儲(chǔ)存期間經(jīng)歷重大生化和生物力學(xué)變化，這些變化影響其輸血后的性能。最近的流行病學(xué)研究顯示，輸入儲(chǔ)存較陳舊的血液與死亡率增加、嚴(yán)重感染、多器官功能衰竭和醫(yī)院住院時(shí)間相關(guān)聯(lián)。參見例如Walsh等, Crit. Care Med. 2004; 32:364-371; Van de Watering等, Transfusion 2006; 46:1712-1718; Vamvakas等, Transfusion 2000; 40:101-109; 和Hebert等, Anesthesia & Analgesia. 2005; 100:1433-1438。2,3-DPG的損失證明了RBC儲(chǔ)存損傷，2,3-DPG為人紅細(xì)胞的主要有機(jī)磷酸酯。細(xì)胞中的2,3-DPG含量與氧-血紅蛋白解離曲線的位置相關(guān)聯(lián)，如通過(guò)P50 (血紅蛋白被50%飽和時(shí)的氧(O₂)分壓)反映的那樣。在于常規(guī)血庫(kù)條件下儲(chǔ)存的血液中，2,3-DPG水平急劇下降，并且到儲(chǔ)存10天時(shí)，2,3-DPG水平僅為其初始水平的20-25%。在儲(chǔ)存21天內(nèi)，其下降至其初始含量的10% (Van de Watering等, Transfusion 2006; 46:1712-1718和Vamvakas等, Transfusion 2000; 40:101-109。

儲(chǔ)存損傷仍然是輸血醫(yī)學(xué)中的重大關(guān)注和主要研究焦點(diǎn)。有證據(jù)表明，在長(zhǎng)的時(shí)間段內(nèi)儲(chǔ)存RBC導(dǎo)致氧氣遞送減少，并且輸入較陳舊的血液(即儲(chǔ)存多于14天)已被確定為發(fā)生多器官功能衰竭的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。參見例如(Fitzgerald等, Crit. Care Med. 1997; 25:726-732; Marik等, JAMA, 1993; 269:3024-3029; Raat等, Crit. Care Med., 2005; 33:39-45和Zallen等, Am. J. Surg., 1999; 178:570-572)。

基于早期研究的結(jié)果(例如Van de Watering等, Transfusion 2006; 46:1712-1718和Vamvakas等, Transfusion 2000; 40:101-109)，已經(jīng)認(rèn)為RBC中的2,3-DPG水平在輸血24小時(shí)內(nèi)復(fù)原。這些研究在沒(méi)有循環(huán)問(wèn)題和具有正常血量的健康志愿者進(jìn)行。不知這樣的恢復(fù)是否可發(fā)生于患有嚴(yán)重失血、循環(huán)問(wèn)題或與潛在醫(yī)學(xué)病況有關(guān)問(wèn)題的患者。進(jìn)一步地，在輸血后早期數(shù)小時(shí)的關(guān)鍵時(shí)間內(nèi)，輸入的RBC不能向組織遞送氧氣可顯著影響臨床結(jié)果。盡管某些研究表明，輸入的RBC的儲(chǔ)存期(age)在某些情況下對(duì)臨床結(jié)果具有很少或者沒(méi)有影響(例如Hebert等, Anesthesia & Analgesia. 2005; 100:1433-1438)，但其它的研究表明相反的結(jié)論，顯示RBC的儲(chǔ)存持續(xù)時(shí)間與不利的結(jié)果有關(guān)(Oski等, Blood 1971; 37:52-58)。

主要文獻(xiàn)表明，開發(fā)可限制或逆轉(zhuǎn)儲(chǔ)存損傷的RBC儲(chǔ)存溶液對(duì)于輸血醫(yī)學(xué)相當(dāng)重要，并可有助于使RBC輸入更加安全和更加有效。參見例如Fitzgerald等, Crit. Care Med. 1997; 25:726-732; Marik等, JAMA, 1993; 269:3024-3029; Raat等, Crit. Care Med., 2005; 33:39-45; Zallen等, Am. J. Surg., 1999; 178:570-572; Buetler等, J. Lab. Clin. Med., 1969; 74:300和Valerie等, J. Lab. Clin. Med., 1969; 73:722-733。假定目前公開的RBC儲(chǔ)存和/或復(fù)原組合物將提供這種復(fù)原益處。

一方面，本公開提供血液儲(chǔ)存和/或復(fù)原組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，組合物包含D-核糖和L-精氨酸和/或D-精氨酸(并且優(yōu)選地為L(zhǎng)-精氨酸)。任選地，組合物可進(jìn)一步包含丙酮酸鈉、無(wú)機(jī)磷酸鹽和肌苷中的一種或更多種。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，組合物為水溶液。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，組合物為具有6-8.5的pH的含水組合物。亦公開了使用這種組合物的方法。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，血液儲(chǔ)存和/或復(fù)原組合物包含：75-1500 mM L-精氨酸和/或D-精氨酸(并且優(yōu)選地為L(zhǎng)-精氨酸)；和75-1500 mM肌苷，其中組合物為水溶液。任選地，組合物可進(jìn)一步包含濃度為例如75-1500 mM的D-核糖。任選地，組合物可進(jìn)一步包含濃度為例如75-1500 mM的丙酮酸鈉。任選地，組合物可進(jìn)一步包含濃度為例如75-1500 mM的無(wú)機(jī)磷酸鹽。當(dāng)用于儲(chǔ)存和/或復(fù)原血液時(shí)，組合物通常被稀釋約30倍，以提供最終濃度為2.5-50 mM的L-精氨酸和/或D-精氨酸(并且優(yōu)選地為L(zhǎng)-精氨酸)；2.5-50 mM的肌苷；和任選地2.5-50 mM的D-核糖、2.5-50 mM的丙酮酸鈉和/或2.5-50 mM的無(wú)機(jī)磷酸鹽。

在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，血液儲(chǔ)存和/或復(fù)原組合物包含：150-900 mM L-精氨酸和/或D-精氨酸(并且優(yōu)選地為L(zhǎng)-精氨酸)；和150-900 mM肌苷，并且組合物為水溶液。任選地，組合物可進(jìn)一步包含濃度為例如150-900 mM的D-核糖。任選地，組合物可進(jìn)一步包含濃度為例如150-900 mM的丙酮酸鈉。任選地，組合物可進(jìn)一步包含濃度為例如150-900 mM的無(wú)機(jī)磷酸鹽。當(dāng)用于儲(chǔ)存和/或復(fù)原血液時(shí)，組合物通常被稀釋約30倍，以提供最終濃度為5-30 mM的L-精氨酸和/或D-精氨酸(并且優(yōu)選地為L(zhǎng)-精氨酸)；和5-30 mM的肌苷；和任選地5-30 mM的D-核糖、5-30 mM的丙酮酸鈉和/或5-30 mM的無(wú)機(jī)磷酸鹽。

在其它優(yōu)選的實(shí)施方案中，血液儲(chǔ)存和/或復(fù)原組合物包含：300-600 mM L-精氨酸和/或D-精氨酸(并且優(yōu)選地為L(zhǎng)-精氨酸)；和300-600 mM肌苷，并且組合物為水溶液。任選地，組合物可進(jìn)一步包含濃度為例如300-600 mM的D-核糖。任選地，組合物可進(jìn)一步包含濃度為例如300-600 mM的丙酮酸鈉。任選地，組合物可進(jìn)一步包含濃度為例如300-600 mM的無(wú)機(jī)磷酸鹽。當(dāng)用于儲(chǔ)存和/或復(fù)原血液時(shí)，組合物通常被稀釋約30倍，以提供最終濃度為10-20 mM的L-精氨酸和/或D-精氨酸(并且優(yōu)選地為L(zhǎng)-精氨酸)；和10-20 mM的肌苷；和任選地10-20 mM的D-核糖、10-20 mM的丙酮酸鈉和/或10-20 mM的無(wú)機(jī)磷酸鹽。

在某些實(shí)施方案中，L-精氨酸與肌苷的摩爾比為0.5:1-1.5:1。在其它某些實(shí)施方案中，L-精氨酸與肌苷的摩爾比為0.8:1-1.2:1。在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，L-精氨酸與肌苷的摩爾比為1:1。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，血液儲(chǔ)存和/或復(fù)原組合物包含：300 mM L-精氨酸、300 mM肌苷、300 mM D-核糖、300 mM丙酮酸鈉和300 mM無(wú)機(jī)磷酸鹽，其中組合物為水溶液。當(dāng)用于儲(chǔ)存和/或復(fù)原血液時(shí)，組合物通常被稀釋約30倍，以提供最終濃度為10 mM的L-精氨酸、10 mM的肌苷、10 mM的D-核糖、10 mM的丙酮酸鈉和10 mM的無(wú)機(jī)磷酸鹽。

在某些實(shí)施方案中，本文描述的血液儲(chǔ)存和/或復(fù)原組合物可進(jìn)一步包含氯化鈉、葡萄糖、腺嘌呤、甘露醇、檸檬酸鈉和檸檬酸中的一種或更多種。

對(duì)于一個(gè)實(shí)例，血液儲(chǔ)存和/或復(fù)原組合物可為包含以下的添加劑溶液：L-精氨酸、肌苷、D-核糖、丙酮酸鈉、無(wú)機(jī)磷酸鹽、氯化鈉、葡萄糖、腺嘌呤和甘露醇。這類添加劑溶液特別可用于含有選自以下的抗凝劑的儲(chǔ)存和/或復(fù)原血液：ACD、CPD、CPDA-1及其組合。

對(duì)于另一個(gè)實(shí)例，血液儲(chǔ)存和/或復(fù)原組合物可為包含以下的添加劑溶液：L-精氨酸、肌苷、D-核糖、丙酮酸鈉、無(wú)機(jī)磷酸鹽、氯化鈉、葡萄糖、腺嘌呤、檸檬酸鈉和檸檬酸。這類添加劑溶液特別可用于儲(chǔ)存和/或復(fù)原含有CP2D抗凝劑的血液。

本文描述的組合物可用于例如儲(chǔ)存血液的方法中。在某些實(shí)施方案中，所述方法包括使RBC (例如濃集的RBC或在全血中)與本文描述的血液儲(chǔ)存和/或復(fù)原組合物接觸。

或者，或除此以外，本文描述的組合物可用于例如復(fù)原血液(例如濃集的RBC或在全血中)的方法中。在某些實(shí)施方案中，所述方法包括使RBC與本文描述的血液儲(chǔ)存和/或復(fù)原組合物接觸。

在一些實(shí)施方案中，本文公開的血液儲(chǔ)存和/或復(fù)原組合物可呈添加劑溶液的形式，其可在采集全血時(shí)加入到RBC中；或者在去除血漿之前、期間和/或之后加入到RBC中，和/或在儲(chǔ)存之前、期間和/或之后加入到濃集的RBC中。

在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，復(fù)原血液的方法包括：提供具有低于新鮮抽取血液的2,3-DPG值的2,3-DPG值的RBC (例如濃集的RBC或在全血中)；并在有效增加2,3-DPG值的條件下使RBC與血液儲(chǔ)存和/或復(fù)原組合物混合，其中所述血液儲(chǔ)存和/或復(fù)原組合物包含L-精氨酸和/或D-精氨酸。在某些實(shí)施方案中，有效增加2,3-DPG值的條件包括在4℃-37℃的溫度下，并且在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中為在室溫的溫度下，用血液儲(chǔ)存和/或復(fù)原組合物溫育細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，有效增加2,3-DPG值的條件包括用血液儲(chǔ)存和/或復(fù)原組合物溫育細(xì)胞至少10分鐘的時(shí)間，在優(yōu)選的實(shí)施方案中為10分鐘-48小時(shí)的時(shí)間，在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中為10分鐘-4小時(shí)的時(shí)間，和在其它優(yōu)選的實(shí)施方案中為30分鐘-2小時(shí)的時(shí)間。有效增加2,3-DPG值的示例性條件包括在37℃下，用血液儲(chǔ)存和/或復(fù)原組合物溫育細(xì)胞10分鐘-4小時(shí)。有效增加2,3-DPG值的其它示例性條件包括在室溫下，用血液儲(chǔ)存和/或復(fù)原組合物溫育細(xì)胞10分鐘-24小時(shí)，在一些實(shí)施方案中為10分鐘-8小時(shí)，和在一些實(shí)施方案中為10分鐘-4小時(shí)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，血液儲(chǔ)存和/或復(fù)原組合物包括本文描述的血液儲(chǔ)存和/或復(fù)原組合物中的一種或更多種。

在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，復(fù)原血液的方法包括：提供具有低于新鮮抽取血液的ATP值的ATP值的RBC (例如濃集的RBC或在全血中)；并在有效增加ATP值的條件下使RBC與血液儲(chǔ)存和/或復(fù)原組合物混合，其中所述血液儲(chǔ)存和/或復(fù)原組合物包含L-精氨酸和/或D-精氨酸。在某些實(shí)施方案中，有效增加ATP值的條件包括在4℃-37℃的溫度下，并且在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中為在室溫的溫度下，用血液儲(chǔ)存和/或復(fù)原組合物溫育細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，有效增加ATP值的條件包括用血液儲(chǔ)存和/或復(fù)原組合物溫育細(xì)胞至少10分鐘的時(shí)間，在優(yōu)選的實(shí)施方案中為10分鐘-48小時(shí)的時(shí)間，在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中為10分鐘-4小時(shí)的時(shí)間，和在其它優(yōu)選的實(shí)施方案中為30分鐘-2小時(shí)的時(shí)間。有效增加ATP值的示例性條件包括在37℃下，用血液儲(chǔ)存和/或復(fù)原組合物溫育細(xì)胞10分鐘-4小時(shí)。有效增加ATP值的其它示例性條件包括在室溫下，用血液儲(chǔ)存和/或復(fù)原組合物溫育細(xì)胞10分鐘-24小時(shí)，在一些實(shí)施方案中為10分鐘-8小時(shí)，和在一些實(shí)施方案中為10分鐘-4小時(shí)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，血液儲(chǔ)存和/或復(fù)原組合物包括本文描述的血液儲(chǔ)存和/或復(fù)原組合物中的一種或更多種。

在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，復(fù)原血液的方法包括：提供具有低于新鮮抽取血液的還原型谷胱甘肽值的還原型谷胱甘肽值的RBC (例如濃集的RBC或在全血中)；并在有效增加還原型谷胱甘肽值的條件下使RBC與血液儲(chǔ)存和/或復(fù)原組合物混合，其中所述血液儲(chǔ)存和/或復(fù)原組合物包含L-精氨酸和/或D-精氨酸。在某些實(shí)施方案中，有效增加還原型谷胱甘肽值的條件包括在4℃-37℃的溫度下，并且在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中為在室溫的溫度下，用血液儲(chǔ)存和/或復(fù)原組合物溫育細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，有效增加還原型谷胱甘肽值的條件包括用血液儲(chǔ)存和/或復(fù)原組合物溫育細(xì)胞至少10分鐘的時(shí)間，在優(yōu)選的實(shí)施方案中為10分鐘-48小時(shí)的時(shí)間，在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中為10分鐘-4小時(shí)的時(shí)間，和在其它優(yōu)選的實(shí)施方案中為30分鐘-2小時(shí)的時(shí)間。有效增加還原型谷胱甘肽值的示例性條件包括在37℃下，用血液儲(chǔ)存和/或復(fù)原組合物溫育細(xì)胞10分鐘-4小時(shí)。有效增加還原型谷胱甘肽值的其它示例性條件包括在室溫下，用血液儲(chǔ)存和/或復(fù)原組合物溫育細(xì)胞10分鐘-24小時(shí)，在一些實(shí)施方案中為10分鐘-8小時(shí)，和在一些實(shí)施方案中為10分鐘-4小時(shí)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，血液儲(chǔ)存和/或復(fù)原組合物包括本文描述的血液儲(chǔ)存和/或復(fù)原組合物中的一種或更多種。

在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，復(fù)原血液的方法包括：提供具有低于新鮮抽取血液的氧解離P50值的氧解離P50值的RBC (例如濃集的RBC或在全血中)；并在有效增加氧解離P50值的條件下使RBC與血液儲(chǔ)存和/或復(fù)原組合物混合，其中所述血液儲(chǔ)存和/或復(fù)原組合物包含L-精氨酸和/或D-精氨酸。在某些實(shí)施方案中，有效增加氧解離P50值的條件包括在4℃-37℃的溫度下，并且在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中為在室溫的溫度下，用血液儲(chǔ)存和/或復(fù)原組合物溫育細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，有效增加氧解離P50值的條件包括用血液儲(chǔ)存和/或復(fù)原組合物溫育細(xì)胞至少10分鐘的時(shí)間，在優(yōu)選的實(shí)施方案中為10分鐘-48小時(shí)的時(shí)間，在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中為10分鐘-4小時(shí)的時(shí)間，和在其它優(yōu)選的實(shí)施方案中為30分鐘-2小時(shí)的時(shí)間。有效增加氧解離P50值的示例性條件包括在37℃下，用血液儲(chǔ)存和/或復(fù)原組合物溫育細(xì)胞10分鐘-4小時(shí)。有效增加氧解離P50值的其它示例性條件包括在室溫下，用血液儲(chǔ)存和/或復(fù)原組合物溫育細(xì)胞10分鐘-24小時(shí)，在一些實(shí)施方案中為10分鐘-8小時(shí)，和在一些實(shí)施方案中為10分鐘-4小時(shí)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，血液儲(chǔ)存和/或復(fù)原組合物包括本文描述的血液儲(chǔ)存和/或復(fù)原組合物中的一種或更多種。

另一方面，本公開進(jìn)一步提供改進(jìn)儲(chǔ)存的RBC的抗氧化防護(hù)的方法。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括使RBC與本文描述的血液儲(chǔ)存和/或復(fù)原組合物接觸。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括使包含RBC和抗凝劑的組合物與本文描述的添加劑溶液接觸，其中抗凝劑選自ACD、CPD、CPDA-1及其組合。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括使包含RBC和抗凝劑的組合物與本文描述的添加劑溶液接觸，其中抗凝劑為CP2D。

通過(guò)增加應(yīng)激RBC中的2,3-DPG濃度，假定本文公開的RBC儲(chǔ)存和/或復(fù)原組合物可在輸血后減少氧親和力和增加向受影響組織的氧遞送。進(jìn)一步地，通過(guò)保持細(xì)胞能量，假設(shè)本文公開的儲(chǔ)存和/或復(fù)原組合物可減少細(xì)胞脆弱性和增加變形性，從而改進(jìn)經(jīng)過(guò)毛細(xì)血管的流動(dòng)。最終結(jié)果將是在輸血后儲(chǔ)存損傷減少以及向受影響組織的氧遞送更多。

在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本文公開的血液儲(chǔ)存和/或復(fù)原組合物具有保持和增強(qiáng)儲(chǔ)存的紅細(xì)胞的抗氧化防護(hù)，從而減少儲(chǔ)存損傷的另外益處。認(rèn)為通過(guò)提供將RBC儲(chǔ)存損傷的影響減至最小并且改進(jìn)儲(chǔ)存的RBC功能的組合物，儲(chǔ)存溶液可對(duì)血庫(kù)和輸血技術(shù)產(chǎn)生積極的影響。

由2,3-DPG和細(xì)胞內(nèi)ATP損失引起的RBC功能變化均被充分記載。RBC低溫儲(chǔ)存已導(dǎo)致RBC成功儲(chǔ)存最多42天。然而，一些目前的儲(chǔ)存溶液并未防止對(duì)紅細(xì)胞的時(shí)間依賴性氧化攻擊，導(dǎo)致形成活性氧簇、變性血紅蛋白附著于膜磷脂和在整個(gè)儲(chǔ)存期間釋放含有血紅蛋白的膜微泡(Kanias等, FEBS Journal, 2009; 277:343-356)。

據(jù)報(bào)道自發(fā)性脂質(zhì)過(guò)氧化為紅細(xì)胞老化的主要原因之一。參見例如等, Clin. Chim. Acta., 1997年11月28日; 267(2):129-142; Dormandy, Br. J. Haematol, 1971; 20:457-461; Halliwell等, Biochem. J., 1984; 219:1-14; Chiu等, Seminars in Hematology, 1989; 26:257-276; Knight等, Transfusion, 1992; 32:354-357和Jain, Biochim. Biophys. Acta, 1988; 937:205-210。氧化通常為細(xì)胞損傷的重要原因，并且造成脂質(zhì)氧化的反應(yīng)最終產(chǎn)物積聚、膜蛋白和核酸結(jié)構(gòu)的修飾、以及酶活性的減少(Dumaswala等, Free Rad. Res., 2000, 33:517-529)。在健康的紅細(xì)胞中，由小的抗氧化化合物比如谷胱甘肽(GSH)、維生素E、維生素C和酶比如GSH-過(guò)氧化物酶(GSH-PX)、過(guò)氧化氫酶和超氧化物歧化酶(SOD)組成的非常有效的抗氧化系統(tǒng)，防止顯著的氧化損傷。還原型GSH與GSH-PX一起為RBC中活性氧簇的主要清除劑之一。GSH占細(xì)胞內(nèi)非蛋白硫醇的90%，并因此為RBC的重要細(xì)胞內(nèi)還原劑。據(jù)報(bào)道RBC的低溫儲(chǔ)存誘導(dǎo)時(shí)間依賴性的GSH喪失，這繼而導(dǎo)致潛在毒性過(guò)氧化物(例如過(guò)氧化氫)增加。另外，已經(jīng)表明，GSH濃度下降伴隨GSH-PX減少及膜脂質(zhì)和蛋白的氧化修飾包括丙二醛(MDA)的增加(Deneke等, Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol., 1989; 257:L163-L173)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本文公開的血液儲(chǔ)存和/或復(fù)原組合物防止對(duì)低溫儲(chǔ)存期間的RBC的氧化攻擊。

在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本文公開的血液儲(chǔ)存和/或復(fù)原組合物保持低溫儲(chǔ)存的RBC的GSH水平，其繼而在儲(chǔ)存的血液中保持抗氧化活性。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本文公開的血液儲(chǔ)存和/或復(fù)原組合物包含在溶液中的D-核糖，其可允許繞過(guò)葡萄糖代謝的戊糖磷酸途徑的限速步驟，以刺激PRPP合成。

本發(fā)明通過(guò)以下實(shí)施例進(jìn)行說(shuō)明。應(yīng)該理解，具體實(shí)例、材料、數(shù)量和程序?qū)⒏鶕?jù)本文闡述的本發(fā)明范圍和精神進(jìn)行廣泛解釋。

實(shí)施例

實(shí)施例1

制備作為漿液且包含濃度均為300 mM的D-核糖、肌苷、丙酮酸鈉和無(wú)機(jī)磷酸鹽的儲(chǔ)存和/或復(fù)原組合物。當(dāng)用于儲(chǔ)存和/或復(fù)原RBC時(shí)，將該漿液稀釋30倍至最終濃度為10 mM，以形成溶液。該組合物在儲(chǔ)存RBC中恢復(fù)2,3-DPG水平和自基線值增加ATP含量方面呈現(xiàn)顯著性結(jié)果。在一項(xiàng)研究中，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)血庫(kù)實(shí)踐采集RBC并在4℃下儲(chǔ)存平均21天。向儲(chǔ)存21天的RBC加入各種RBC儲(chǔ)存和/或復(fù)原組合物，并在37℃下保持1-4小時(shí)，之后測(cè)試2,3-DPG濃度。使用可得自Roche Diagnostics Corp. (目錄號(hào)10148334001)的2,3-二磷酸甘油酸酯(DPG)診斷試劑盒，在全部實(shí)施例中測(cè)量2,3-DPG水平。RBC的正常2,3-DPG濃度在一經(jīng)收獲時(shí)為4.0 μmol/ml。在儲(chǔ)存后平均2,3-DPG濃度降至0.17 μmol/ml (表1)。加入RBC儲(chǔ)存和/或復(fù)原組合物使?jié)舛然謴?fù)至大于正常收獲后水平的50%。認(rèn)為增加至1.0 μmol/ml為顯著改進(jìn)。這一系列的試驗(yàn)證實(shí)了RBC儲(chǔ)存和/或復(fù)原組合物增加ATP含量和2,3-DPG水平。然而，在血庫(kù)實(shí)踐中采用的溶液的實(shí)用性可能由于肌苷的低溶解性以及需要在輸血之前溫?zé)嵫?例如1小時(shí))而受到限制

表1：含有RBC儲(chǔ)存和/或復(fù)原組合物的儲(chǔ)存RBC的2,3-DPG水平

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設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案以找出增加肌苷溶解性的方法。發(fā)現(xiàn)在等分子溶液中的L-精氨酸提高肌苷的溶解性，使得肌苷在室溫下保持在濃度高于50 mM的溶液中。將包含各300 mM的肌苷、L-精氨酸、丙酮酸鈉、D-核糖和無(wú)機(jī)磷酸鹽的儲(chǔ)存和/或復(fù)原組合物稀釋30倍至儲(chǔ)存21天的RBC中。將一組儲(chǔ)存的血樣在室溫下溫育60分鐘，而另一組在37℃下溫育60分鐘。如在表2中顯示的那樣，含有L-精氨酸的儲(chǔ)存和/或復(fù)原組合物成功恢復(fù)2,3-DPG和ATP水平而與溫?zé)崮Ｊ綗o(wú)關(guān)。該結(jié)果證實(shí)使用室溫溫育和溶液復(fù)原2,3-DPG和ATP沒(méi)有與漿液和在輸血之前洗滌紅細(xì)胞有關(guān)的問(wèn)題

表2：用含有L-精氨酸的溶液儲(chǔ)存的RBC的2,3-DPG和ATP

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實(shí)施例2

設(shè)計(jì)另外的實(shí)驗(yàn)方案以確定肌苷以外的核苷是否可成功幫助恢復(fù)2,3-DPG和ATP水平，并潛在地減少分解產(chǎn)物次黃嘌呤和尿酸的形成。鳥苷，一種由通過(guò)其N9氮與核糖的C1碳鍵合的鳥嘌呤組成的嘌呤核苷，被選作受試核苷酸。表3呈現(xiàn)了使用包含終濃度各為10 mM的鳥苷、丙酮酸鈉、無(wú)機(jī)磷酸鹽和D-核糖的儲(chǔ)存和/或復(fù)原組合物得到的數(shù)據(jù)

表3：用含有鳥苷的溶液儲(chǔ)存的RBC的2,3-DPG和ATP

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當(dāng)加熱至37℃保持60分鐘時(shí)，10 mM鳥苷溶液能夠恢復(fù)2,3-DPG水平。濃縮的鳥苷組合物未完全溶解，并且在稀釋時(shí)，在室溫溫育后并未恢復(fù)2,3-DPG水平，但ATP水平升高。

實(shí)施例3

表4呈現(xiàn)了使用包含各10 mM的無(wú)機(jī)磷酸鹽和D-核糖以及所示濃度的鳥苷的儲(chǔ)存和/或復(fù)原組合物得到的數(shù)據(jù)。該溶液不包含丙酮酸鈉。在37℃下溫育60分鐘觀測(cè)到復(fù)原

表4

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實(shí)施例4

表5呈現(xiàn)了使用包含終濃度各為10 mM的L-精氨酸、鳥苷、D-核糖、丙酮酸鈉和無(wú)機(jī)磷酸鹽的儲(chǔ)存和/或復(fù)原組合物得到的數(shù)據(jù)。在37℃下溫育10分鐘和60分鐘后觀測(cè)到復(fù)原

表5

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當(dāng)在包含各10 mM的D-核糖、丙酮酸鈉和無(wú)機(jī)磷酸鹽的儲(chǔ)存和/或復(fù)原組合物中用不同濃度的一磷酸肌苷替代肌苷時(shí)，在37℃下溫育60分鐘未觀測(cè)到復(fù)原。

實(shí)施例6

當(dāng)在包含各10 mM的D-核糖、丙酮酸鈉和無(wú)機(jī)磷酸鹽的儲(chǔ)存和/或復(fù)原組合物中用不同濃度的核糖-5-磷酸替代肌苷時(shí)，在37℃下溫育60分鐘未觀測(cè)到復(fù)原。

實(shí)施例7

用包含各10 mM的肌苷、D-核糖、丙酮酸鈉和無(wú)機(jī)磷酸鹽的儲(chǔ)存和/或復(fù)原組合物，在4℃下溫育10分鐘未觀測(cè)到復(fù)原。

實(shí)施例8：氧解離評(píng)價(jià)

氧解離曲線(ODC)提供在不同氧分壓下血紅蛋白百分比飽和度的量度。ODC提供P50值，其為紅細(xì)胞被氧氣飽和50%時(shí)壓力的量度。

1904年S-形O₂平衡曲線和玻爾效應(yīng)的發(fā)現(xiàn)促進(jìn)了對(duì)血液呼吸功能和血紅蛋白(Hb)變構(gòu)機(jī)制的多產(chǎn)和持續(xù)研究。玻爾效應(yīng)(pH/CO₂對(duì)HbO₂親和力的影響)和相互的霍爾丹效應(yīng)(HbO₂飽和度對(duì)H⁺/CO₂結(jié)合的影響)源自Hb氧合-脫氧構(gòu)象變化和O₂與H⁺/CO₂結(jié)合位點(diǎn)之間的變構(gòu)相互作用。在穩(wěn)態(tài)下，H⁺跨RBC膜被動(dòng)分布，并且細(xì)胞內(nèi)pH (pHi)變化與細(xì)胞外pH變化、Hb-O₂飽和和RBC有機(jī)磷酸酯含量有關(guān)。當(dāng)Hb分子在動(dòng)脈-靜脈氣體運(yùn)輸中在氧合和脫氧構(gòu)象之間變換時(shí)，其遞送O₂并吸收組織毛細(xì)血管中的CO₂和H⁺ (Jensen, Acta Physiol Scand, 2004年11月, 182(3):215-27)。

RBC儲(chǔ)存和/或復(fù)原組合物優(yōu)選地升高ATP含量，并增加2,3-DPG水平。然而，也期望所述儲(chǔ)存和/或復(fù)原組合物導(dǎo)致從紅細(xì)胞至組織的氧解離增加。目前公開的RBC儲(chǔ)存和/或復(fù)原組合物已經(jīng)顯示有效增強(qiáng)氧解離。

2,3-DPG降低O₂對(duì)血紅蛋白的結(jié)合親和力，這使曲線向右移動(dòng)。2,3-DPG對(duì)氧解離的影響在圖1中進(jìn)行說(shuō)明。

P50值使用Hemox Analzer (TCS Medical, South Hampton PA)進(jìn)行評(píng)價(jià)。在室溫和37℃下氧解離評(píng)價(jià)的概述顯示在表6中。在以下列出的所有試驗(yàn)中，評(píng)價(jià)了以下儲(chǔ)存和/或復(fù)原組合物：10 mM的以下組分(核糖、丙酮酸鈉、L-精氨酸、無(wú)機(jī)磷酸鹽、肌苷)。評(píng)價(jià)的袋為CDPA-AS1

表6

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實(shí)施例9：儲(chǔ)存試驗(yàn)

用檸檬酸鹽磷酸鹽葡萄糖抗凝劑溶液(AS1, Fenwal Inc., Lake Zurich, IL)制備D-核糖、肌苷、L-精氨酸、丙酮酸鈉和無(wú)機(jī)磷酸鹽的30X濃度儲(chǔ)備溶液，產(chǎn)生溶液A，配制溶液A以提供最終血液濃度為10 mM的D-核糖、10 mM的肌苷、10 mM的L-精氨酸、10 mM的丙酮酸鈉和10 mM的無(wú)機(jī)磷酸鹽。據(jù)報(bào)道檸檬酸鹽磷酸鹽葡萄糖抗凝劑溶液每70 ml溶液含有1.8 g檸檬酸三鈉、1.78 g葡萄糖、209 mg檸檬酸和155 mg磷酸二氫鈉。用HCl將溶液A的pH調(diào)節(jié)至6.25。

用溶液A以1:8的溶液A與血液體積比，自正常捐獻(xiàn)者采集人血：通過(guò)在注射器中預(yù)先填充2.5 mL的溶液A，然后將20 mL捐獻(xiàn)者血液直接采集到含有溶液A的注射器中。作為對(duì)照，使用AS1添加劑溶液替代溶液A制備樣品。

樣品用20 ml袋熱封并在4℃下儲(chǔ)存。

如本文描述的那樣測(cè)量2,3-DPG水平、pH、ATP和P50，并且結(jié)果顯示在表7和圖2-5中。使用來(lái)自O(shè)xis Research的Bioxytech GSH-420試劑盒測(cè)量還原型谷胱甘肽

表7

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實(shí)施例10：復(fù)原實(shí)驗(yàn)

過(guò)期的濃集RBC (45-47天)得自美國(guó)紅十字會(huì)(Chicago, IL)，其含有AS3或AS5作為添加劑。

用AS3添加劑(Pall)制備D-核糖、肌苷、L-精氨酸、丙酮酸鈉和無(wú)機(jī)磷酸鹽的30X濃度儲(chǔ)備溶液，產(chǎn)生溶液B，配制溶液B以提供最終血液濃度為10 mM的D-核糖、10 mM的肌苷、10 mM的L-精氨酸、10 mM的丙酮酸鈉和10 mM的無(wú)機(jī)磷酸鹽。將10 mL溶液B加入到300 mL的47天陳舊的濃集RBC中。作為對(duì)照，使用AS3添加劑替代溶液B制備樣品。

用AS5添加劑(Terumo)制備D-核糖、肌苷、L-精氨酸、丙酮酸鈉和無(wú)機(jī)磷酸鹽的30X濃度儲(chǔ)備溶液，產(chǎn)生溶液C，配制溶液C以提供最終血液濃度為10 mM的D-核糖、10 mM的肌苷、10 mM的L-精氨酸、10 mM的丙酮酸鈉和10 mM的無(wú)機(jī)磷酸鹽。將10 mL溶液C加入到300 mL的45天陳舊的濃集RBC中。作為對(duì)照，使用AS5添加劑替代溶液C制備樣品。

復(fù)原條件為伴隨混合下在37℃下60分鐘。測(cè)量2,3-DPG水平并且結(jié)果顯示在表8中

表8

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實(shí)施例11：儲(chǔ)存實(shí)驗(yàn)

如本文以下描述的那樣，除了使用AS3和AS5添加劑溶液替代AS1添加劑溶液，如在實(shí)施例9中描述的那樣實(shí)施儲(chǔ)存實(shí)驗(yàn)。

用AS3添加劑溶液(Pall)制備D-核糖、肌苷、L-精氨酸、丙酮酸鈉和無(wú)機(jī)磷酸鹽的30X濃度儲(chǔ)備溶液，產(chǎn)生溶液D，配制溶液D以提供最終血液濃度為10 mM的D-核糖、10 mM的肌苷、10 mM的L-精氨酸、10 mM的丙酮酸鈉和10 mM的無(wú)機(jī)磷酸鹽。用溶液D以1:8的溶液D與血液體積比，自正常捐獻(xiàn)者采集人血：通過(guò)在注射器中預(yù)先填充2.5 mL的溶液D，然后將20 mL捐獻(xiàn)者血液直接采集到含有溶液D的注射器中。

用AS5添加劑溶液(Terumo)制備D-核糖、肌苷、L-精氨酸、丙酮酸鈉和無(wú)機(jī)磷酸鹽的30X濃度儲(chǔ)備溶液，產(chǎn)生溶液E，配制溶液E以提供最終血液濃度為10 mM的D-核糖、10 mM的肌苷、10 mM的L-精氨酸、10 mM的丙酮酸鈉和10 mM的無(wú)機(jī)磷酸鹽。用溶液E以1:8的溶液E與血液體積比，自正常捐獻(xiàn)者采集人血：通過(guò)在注射器中預(yù)先填充2.5 mL的溶液E，然后將20 mL捐獻(xiàn)者血液直接采集到含有溶液E的注射器中。

作為對(duì)照，使用AS1添加劑溶液替代溶液D或溶液E制備樣品。

樣品用20 ml袋熱封并在4℃下儲(chǔ)存。

如本文描述的那樣測(cè)量2,3-DPG水平、pH、P50和ATP，并且結(jié)果顯示在表9和圖6-9中。使用來(lái)自O(shè)xis Research的Bioxytech GSH-420試劑盒測(cè)量還原型谷胱甘肽

表10

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本文引用的所有專利、專利申請(qǐng)和出版物以及可電子獲得的材料(例如遞交的GenBank氨基酸和核苷酸序列，以及遞交的蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)(pdb))的完整公開內(nèi)容通過(guò)引用結(jié)合到文本中。給出上述詳述和實(shí)施例僅為了理解清楚。不應(yīng)由此理解為不必要的限制。本發(fā)明不限于所顯示和描述的準(zhǔn)確細(xì)節(jié)，對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的變化將包括在權(quán)利要求書限定的本發(fā)明內(nèi)。