本發(fā)明屬于化學(xué)組合物技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種無血清成分的眼角膜中期保存液及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

眼角膜的保存方法在臨床應(yīng)用方面多為活性保存。常見的角膜的活性保存(眼庫的重要技術(shù)之一)根據(jù)角膜內(nèi)皮細(xì)胞的活性的保存時(shí)間可分為短期、中期、長期3種。短期保存方法是將角膜組織無菌處理后濕房4℃保存，保存時(shí)間在24小時(shí)之內(nèi)。中期保存一般采用保存液保存，使用目前世界范圍內(nèi)最常用的是角膜活性保存液，如Optisol，可保存角膜內(nèi)皮細(xì)胞活性達(dá)14天。長期保存，如器官培養(yǎng)法，可保存角膜組織活性4周，以用于臨床。

鑒于短期保存的保存時(shí)間過于短暫，長期保存法的方法復(fù)雜，所需設(shè)備昂貴，不易推廣應(yīng)用，所以用角膜保存液進(jìn)行中期保存是當(dāng)前最受認(rèn)可的方法和研制的熱點(diǎn)。然而很多中期保存液內(nèi)用血清成分來維持組織的營養(yǎng)和細(xì)胞內(nèi)外液的平衡，雖有一定效用，但存在傳染某些特殊病毒的風(fēng)險(xiǎn)。因而應(yīng)用不含生物成分(血清)的各種離子來平衡細(xì)胞內(nèi)、外液的滲透壓是開發(fā)新型角膜保存液的方向。

我國角膜活性保存液如今仍依賴于進(jìn)口，如最常使用的Optisol保存液，雖然在保持角膜內(nèi)皮細(xì)胞活性方面功能顯著，但價(jià)格昂貴，且由于國內(nèi)無此產(chǎn)品的經(jīng)銷，無法推廣應(yīng)用。因此，我國目前多應(yīng)用短期方法保存角膜，這使得原本就嚴(yán)重匱乏的角膜供體材料來源因保存問題更添危機(jī)。由此可見，研制理想的，并符合我國國情的新型角膜中期保存液以最大限度的利用有限的供體材料是亟待解決的問題。

角膜保存液的研發(fā)，對(duì)我國眼庫的建設(shè)將起到重要作用，將有利于角膜供體的保存，以及其在單位間、地區(qū)間合理流動(dòng)，并對(duì)于充分合理的利用珍貴的角膜供體資源，救治更多的眼疾病患具有非常重要的意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了一種不含血清成分、以特定電解質(zhì)離子濃度來維持角膜細(xì)胞內(nèi)外壓平衡的眼角膜中期保存液的制備方案。

本發(fā)明所述的眼角膜保存液其成分為：

1、復(fù)方電解質(zhì)眼內(nèi)沖洗液作為保存液母液；

2、氯化鈉2.34-2.92g/L、硫酸鎂0.6-0.72g/L，磷酸二氫鉀2.72-4.08g/L，使晶體滲透壓維持在330-380mOsm/kgH2O之間；

3、硫酸軟骨素25-30g/L，玻璃酸鈉5-10g/L，來維持其液體的膠體滲透壓為310-350mOsm/kg H₂O之間。由于硫酸軟骨素、玻璃酸鈉的協(xié)同作用，可以減少角膜保存液中的負(fù)電荷，同時(shí)保持一定的膠體滲透壓，使被保存的眼角膜在保存期不發(fā)生水腫；

4、鹽酸地塞米松1-2mg/L，還原型谷胱苷肽1.5-3g/L，以穩(wěn)定角膜細(xì)胞溶酶體膜及生物膜，增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)內(nèi)毒素的抵御能力，更好地保持角膜細(xì)胞的形態(tài)和功能；

5、HEPES緩沖液20-25ml/L，用以調(diào)節(jié)pH值為7.2-7.5；

6、左氧氟沙星0.1-0.2g/L，用以殺滅供體攜帶的革藍(lán)氏陽性和陰性的病原菌。

本發(fā)明所述的角膜保存液為微紅色、透明液體；以20ml為一個(gè)瓶裝單位，用于單片角膜的保存。

附圖說明

圖1人新鮮角膜放入角膜保存液0天，眼庫用角膜內(nèi)皮鏡檢測(cè)，內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)2300個(gè)/mm²

圖2人新鮮角膜放入角膜保存液14天，眼庫用角膜內(nèi)皮鏡檢測(cè)，內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)2100個(gè)/mm²

圖3人新鮮角膜放入角膜保存液0天，茜蘇紅染色，50％角膜內(nèi)皮細(xì)胞為較典型的六邊形，細(xì)胞數(shù)2350個(gè)/mm²

圖4人新鮮角膜放入角膜保存液14天，茜蘇紅和胎盼藍(lán)聯(lián)合染色，45％角膜內(nèi)皮細(xì)胞為較典型的六邊形，約8-10％內(nèi)皮細(xì)胞核著色，說明細(xì)胞已失去活性，細(xì)胞數(shù)2150個(gè)/mm²

圖5貓鮮角膜放入角膜保存液14天，茜蘇紅染色，65％角膜內(nèi)皮細(xì)胞為較典型的五邊形，細(xì)胞數(shù)4150個(gè)/mm²

具體實(shí)施方式

下面通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體的描述，這些實(shí)施例只用于進(jìn)一步詳述說明本發(fā)明，不能理解為對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限定，在本發(fā)明保護(hù)范圍之內(nèi)做出非本質(zhì)的調(diào)整需本發(fā)明方授權(quán)。

本發(fā)明的實(shí)施例1

角膜保存液的制備：

1、復(fù)方電解質(zhì)眼內(nèi)沖洗液500ml作為母液待用；

2、取硫酸軟骨素25g加入去離子水275ml加熱溶解高壓滅菌，制成硫酸軟骨素溶液；氯化鈉2.93g、硫酸鎂0.6g，磷酸二氫鉀2.72g加入注射用水100ml溶解高壓滅菌，制成鈉鎂鉀鹽溶液；玻璃酸鈉5g，加入注射用水100ml溶解高壓滅菌，制成玻璃酸鈉溶液；

3、取無菌容器加入復(fù)方電解質(zhì)眼內(nèi)沖洗液500ml，高壓滅菌硫酸軟骨素275ml，鈉鎂鉀鹽溶液100ml，玻璃酸鈉溶液100ml；加入還原型谷胱苷肽3g，地塞米松注射液1.5mg，左氧氟沙星注射液0.2g混勻；

4、Hepes緩沖液調(diào)節(jié)PH值至7.2

5、調(diào)節(jié)晶體滲透壓為340mOsm/kgH₂O；

6、調(diào)節(jié)膠體滲透壓為350mOsm/kgH₂O；

7、分裝為每20ml的保存瓶中，4度冷藏備用。

本發(fā)明的實(shí)施例2

對(duì)角膜保存液的效果檢測(cè)：

1、取新鮮(宰后2小時(shí)內(nèi)取得)豬眼球，無菌處理，并剪取帶1-2mm鞏膜緣的全角膜，分別置于20ml實(shí)施例1制備的角膜保存液和20ml作為對(duì)照的Optisol角膜活性保存液中；

2、于4℃條件下保存3天、7天和14天，以備對(duì)保存效果檢測(cè)。

3、于保存3天取出角膜片，行錐蘭染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)角膜活性保存液保存的角膜內(nèi)皮細(xì)胞的數(shù)量、六邊形態(tài)及角膜的透明度與對(duì)照的Optisol角膜活性保存液之間沒有差別；

4、于保存1周時(shí)取出角膜片，行錐蘭染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)角膜活性保存液保存的角膜內(nèi)皮細(xì)胞的數(shù)量、六邊形態(tài)及角膜的透明度與對(duì)照的Optisol角膜活性保存液之間沒有差別；

5、于保存至2周時(shí)取出角膜片，行錐蘭染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)角膜活性保存液保存的角膜內(nèi)皮細(xì)胞的數(shù)量、六邊形態(tài)及角膜的透明度在與對(duì)照的Optisol角膜活性保存液之間沒有差別，角膜活性保存液組內(nèi)皮細(xì)胞的數(shù)量下降，但角膜片內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)在1800個(gè)/mm²以上，角膜透明度良好。

本發(fā)明的實(shí)施例3

角膜中期保存液保存貓角膜用穿透性角膜移植：

1、取新鮮(宰后2小時(shí)內(nèi)取得)貓角膜植片于實(shí)施例1所配角膜保存液中，4℃冷藏保存2周，待移植；

2、健康家貓6只，行麻醉后，常規(guī)應(yīng)用直徑7.0mm環(huán)鉆，鉆切中央角膜；切下角膜后，取保存2周的貓角膜植片置于切割枕上，用7.25mm直徑的環(huán)鉆從內(nèi)皮面鉆取植片，覆蓋在貓角膜植孔上，10/0尼龍縫線間斷縫合，水密形成前房；

3、術(shù)后1天、3天、5天、7天及14天用裂隙燈觀察角膜植片透明度，14天用角膜內(nèi)皮鏡檢測(cè)角膜植片內(nèi)皮數(shù)；結(jié)果發(fā)現(xiàn)，術(shù)后1-3天，植片透明，輕度水腫，術(shù)后5天，植片透明度一直保持良好，術(shù)后14天，角膜內(nèi)皮鏡檢查內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)均在1800個(gè)/mm²以上。

本發(fā)明的實(shí)施例4

人新鮮角膜保存后的角膜內(nèi)皮細(xì)胞密度及角膜內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)的檢查：

1、人角膜組織(各種原因死亡的捐獻(xiàn)者，6小時(shí)內(nèi)取材)共40例，放置于眼庫用角膜保存瓶內(nèi)，每個(gè)角膜材料均使用20ml保存液，其中20片角膜放入實(shí)施例1所配保存液中，另20片放入進(jìn)口的Optisol角膜中期保存液，封口膜封好瓶口，放于4℃冰箱保存。

2、使用眼庫專用內(nèi)皮顯微鏡對(duì)角膜材料進(jìn)行監(jiān)測(cè)，進(jìn)行內(nèi)皮細(xì)胞計(jì)數(shù)和形體分析，檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)分別為0天、1天、3天、7天和14天。

3、結(jié)果發(fā)現(xiàn)，保存時(shí)間7天，角膜內(nèi)皮細(xì)胞密度與0天無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在保存14天后，角膜內(nèi)皮細(xì)胞計(jì)數(shù)為2252±32(個(gè)/mm²)；內(nèi)皮細(xì)胞六邊行比率從0天的45％，到14天的32％；角膜內(nèi)皮細(xì)胞死亡率為(9.10±4.4)％。本發(fā)明的保存液和Optisol角膜中期保存液的效用沒有差別。使用該實(shí)施例1所配角膜中期保存液存放角膜期間，角膜內(nèi)皮細(xì)胞活性穩(wěn)定，變化較小。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。