本發(fā)明涉及植物分子生物學(xué)領(lǐng)域，更具體地講，涉及影響雄性能育性。以電子方式提交的序列表的引用通過(guò)efs-web以電子方式將序列表的正式文本作為ascii格式的序列表文件提交，該文件名稱(chēng)為rts20250d-pct_st25.txt，最后修改日期為2015年9月21日，文件大小為79kb，并且該文件與本說(shuō)明書(shū)同時(shí)提交。在該ascii格式的文件中包含的序列表是本說(shuō)明書(shū)的一部分，并且全文以引用方式并入本文。
背景技術(shù)：
：雜交植物育種的發(fā)展已使產(chǎn)生的作物在質(zhì)量和數(shù)量方面取得相當(dāng)大的進(jìn)展成為可能。由于經(jīng)過(guò)了雜交過(guò)程，故收率增加，所需特性的組合諸如對(duì)病害和蟲(chóng)害的抗性、耐熱性和耐旱性，以及植物組成發(fā)生變化都可能出現(xiàn)。這些過(guò)程在很多情況下主要依賴(lài)于提供向雌性親本貢獻(xiàn)花粉的雄性親本以產(chǎn)生所得的雜交體。大田作物通過(guò)利用植物的授粉方法的技術(shù)進(jìn)行育種。如果來(lái)自植物的一朵花的花粉轉(zhuǎn)移到同一植物或遺傳上相同的植物的同一朵花或另一朵花，則植物自花授粉。如果花粉來(lái)自遺傳上不同的植物的花，則植物異花授粉。在某些物種中，諸如蕓苔(brassicacampestris)，植物通常自體不育，并且只能夠異花授粉。在主要為自花授粉的物種(諸如大豆、小麥和棉花)中，雄性和雌性植物處于解剖學(xué)上的并置關(guān)系，使得在天然授粉過(guò)程中，給定花的雄性繁殖器官對(duì)同一朵花的雌性繁殖器官授粉。普通小麥(triticumaestivum)是具有限定基因組a、b和d的三對(duì)同源染色體的六倍體植物。小麥籽粒的胚乳包括來(lái)自母本細(xì)胞的兩個(gè)單倍體補(bǔ)體和來(lái)自父本細(xì)胞的一個(gè)單倍體補(bǔ)體。小麥籽粒的胚包括來(lái)自母本細(xì)胞和父本細(xì)胞中的每一者的一個(gè)單倍體補(bǔ)體。六倍性被認(rèn)為是研究和開(kāi)發(fā)小麥的可用變體的過(guò)程中的重大障礙。實(shí)際上，人們對(duì)小麥的同源基因如何相互作用、如何調(diào)控這些同源基因的表達(dá)、以及由同源基因產(chǎn)生的不同蛋白質(zhì)如何獨(dú)立或協(xié)同地發(fā)揮作用方面知之甚少。操縱雄性能育性多核苷酸在小麥中的表達(dá)的策略將需要考慮各個(gè)小麥品種的倍性水平。普通小麥?zhǔn)前恢付閍、b和d的三個(gè)基因組的六倍體(n＝21)；每個(gè)基因組包含七對(duì)非同源染色體。單粒小麥品種是二倍體(n＝7)，而二粒小麥品種是四倍體(n＝14)。用遺傳性雄性不育體系進(jìn)行的大部分工作的必要方面是鑒定影響雄性能育性的基因。這種基因可以在包括本文所述的那些體系在內(nèi)的多種體系中使用以控制雄性能育性。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明提供了用于調(diào)節(jié)植物中的雄性能育性的組合物和方法。該組合物包含表達(dá)盒，該表達(dá)盒包含可操作地連接至啟動(dòng)子的一個(gè)或多個(gè)雄性能育性多核苷酸或者其片段或變體中，其中該多核苷酸的表達(dá)調(diào)節(jié)植物的雄性能育性。本發(fā)明提供了各種方法，其中影響雄性能育性的多核苷酸或多肽的水平和/或活性在植物或植物部分中受到調(diào)節(jié)。本發(fā)明還提供了用于鑒定和/或選擇對(duì)于誘導(dǎo)核隱性雄性不育的突變是純合的或雜合的小麥植物的方法。附圖說(shuō)明圖1示出了大麥(seqidno：3)和小麥(seqidno：5)ms1氨基酸序列的比對(duì)結(jié)果。圖2示出了msld、msle和mslf的等位基因系列序列蹤跡。坐標(biāo)數(shù)對(duì)應(yīng)于seqidno：7中的位置。圖3是小麥ms1(也稱(chēng)為taltpg1)的結(jié)構(gòu)的圖示。圖4是多棱大麥(hordeumvulgare)(seqidno：3)、普通小麥(seqidno：5)、二穗短柄草(brachypodiumdistachyon)(seqidno：39)和水稻(oryzasativa)(seqidno：40)的ms1同系物的比對(duì)結(jié)果。具體實(shí)施方式現(xiàn)在將在下文中更全面地描述本發(fā)明；示出了本發(fā)明的一些但不是所有實(shí)施方案。事實(shí)上，這些
發(fā)明內(nèi)容可以多種不同形式呈現(xiàn)，并且不應(yīng)理解為受限于本文陳述的實(shí)施方案；相反，提供這些實(shí)施方案的目的是使本公開(kāi)滿(mǎn)足適用的法律要求。同樣的編號(hào)在全文中是指同樣的要素。借助前文的描述和隨附的附圖中給出的教導(dǎo)內(nèi)容，本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員將會(huì)想到本文示出的本發(fā)明的多種修改形式和其它實(shí)施方案。因此，應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明不限于所公開(kāi)的具體實(shí)施方案，旨在將修改形式和其它實(shí)施方案包括在所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。雖然本文中采用特定術(shù)語(yǔ)，但這些術(shù)語(yǔ)僅在一般性和描述性意義上使用，而并非用于限制目的。i.雄性能育性多核苷酸本文所公開(kāi)的組合物包含影響雄性能育性的多核苷酸和多肽。具體地講，本發(fā)明提供了分離的多核苷酸，其包含編碼seqidno：3、5、39或40示出的氨基酸序列或者它們的活性片段或變體的核苷酸序列。本發(fā)明還提供了具有由本文所述的多核苷酸編碼的氨基酸序列(例如，seqidno：3、5、39或40示出的氨基酸序列或者它們的活性片段或變體)的多肽。有性繁殖植物發(fā)育出用于產(chǎn)生雄性配子和雌性配子的特化組織。雄性配子的成功產(chǎn)生依賴(lài)于雄性繁殖組織的正確形成。體現(xiàn)植物的雄性繁殖器官的雄蕊包含各種細(xì)胞類(lèi)型，包括例如花絲、花粉囊、絨氈層和花粉。如本文所用，“雄性組織”是指有性繁殖植物中的負(fù)責(zé)產(chǎn)生雄性配子的特化組織。雄性組織包括但不限于雄蕊、花絲、花粉囊、絨氈層和花粉。成熟花粉粒形成的過(guò)程始于小孢子發(fā)生，其中性母細(xì)胞形成于花粉囊的造孢組織中。隨后是小配子發(fā)生，其中小孢子核發(fā)生不對(duì)稱(chēng)有絲分裂，以形成小配子體或花粉粒?！靶坌阅苡浴被颉靶坌阅苡钡臓顟B(tài)是指產(chǎn)生成熟花粉粒的那些植物，成熟花粉粒能夠使雌性配子受精以產(chǎn)生后代的后續(xù)世代。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“影響雄性能育性”或“調(diào)節(jié)雄性能育性”是指在與合適的對(duì)照比較時(shí)植物產(chǎn)生成熟花粉粒的能力的任何增強(qiáng)或下降?！俺墒旎ǚ哿！被颉俺墒旎ǚ邸笔侵溉魏文軌蚴勾菩耘渥邮芫援a(chǎn)生后代的的后續(xù)世代的花粉粒。同樣，術(shù)語(yǔ)“雄性能育性多核苷酸”或“雄性能育性多肽”是指調(diào)節(jié)雄性能育性的多核苷酸或多肽。雄性能育性多核苷酸可例如編碼參與小孢子發(fā)生或小配子發(fā)生過(guò)程的多肽。某些雄性不育基因諸如macl、ems1或gne2(sorensenetal.(2002)plantj.29：581-594(sorensen等人，2002年，《植物雜志》，第29卷，第581-594頁(yè)))阻止四分孢子階段中的細(xì)胞生長(zhǎng)。sporocyteless/nozzle基因中的突變?cè)诎l(fā)育早期起作用，但不僅影響花粉囊形成而且影響胚珠形成，使得植物為雄性不育和雌性不育。擬南芥屬(arabidopsis)的sporocyteless基因是孢子發(fā)生的起始所必需的，并且編碼新型的核蛋白(genesdev.1999aug15；13(16)：2108-17(《基因與發(fā)育》，1999年8月15日，第13卷，第16期，第2108-2117頁(yè)))。本文所公開(kāi)的雄性能育性多核苷酸包括被示出影響雄性能育性的多核苷酸的同源物和直系同源物。例如，本文所公開(kāi)的雄性能育性多核苷酸及其活性片段和變體包括ms1的同源物和直系同源物。缺乏功能性ms1的植物在繁殖組織發(fā)育中表現(xiàn)出生理變化，并且是雄性不育的。ms1突變體的表型分析使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)進(jìn)行。例如，在gladius小麥中篩選雄性不育表型如下進(jìn)行：為了防止開(kāi)放式授粉的種子形成，在開(kāi)花之前用紙袋覆蓋穗，并用紙夾固定。每株植物覆蓋至少三個(gè)穗，用于定量分析能育性得分。為了確定定量分析能育性得分，對(duì)每個(gè)穗的小花數(shù)和每個(gè)穗的種子數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)，并表示為每朵小花形成的種子數(shù)。如在本文別處所公開(kāi)的，seqidno：4提供了小麥ms1編碼序列。seqidno：7提供了天然小麥ms1基因組序列。seqidno：9提供了變體ms1基因組序列。seqidno：39提供了來(lái)源于短柄草屬的ms1同系物。seqidno：40提供了來(lái)自稻的ms1同系物。染色體臂4bs上的普通小麥ms1基因座的突變體包括：·pugsley(msla)；參見(jiàn)○pugsley，a.t.andr.n.oram(1959)genicmalesterilityinwheat.aust.pl.breed.genet.newsl.no.14：10-11(pugsleya.t.和r.n.oram，1959年，“小麥基因雄性不育”，《aust.pl.breed.genet.newsl.》，第14卷，第10-11頁(yè))；○suneson，c.a.(1962)useofpugsley’ssterilewheatincrossbreeding.cropsci.2：534-535(sunesonc.a.，1962年，“pugsley不育小麥在雜交育種中的用途”，《作物科學(xué)》，第2卷，第534-535頁(yè))；以及○waninge，j.andzeven，a.c.(1968)chromosomenumbersinpugley’s(sic)malesterilewheat.euphytica17：378-380(waningej.和zevena.c.，1968年，“pugley(sic)雄性不育小麥中的染色體數(shù)”，《euphytica》，第17卷，第378-380頁(yè))。·probus(mslb)；參見(jiàn)fossati，a.andm.ingold(1970)amalesterilemutantintriticumaestivum.wheatinformationservice(kyoto)30：3-10(fossatia.和m.ingold，1970年，“普通小麥中的雄性不育突變體”，《wheatinformationservice》(京都)，第30卷，第3-10頁(yè))?！ornerstone(mslc)；參見(jiàn)driscoll，c.j.andk.k.barlow(1976)malesterilityinplants：induction，isolationandutilization.pp.123-131ininducedmutationincross-breeding，iaea，vienna，austria(driscollc.j.和k.k.barlow，1976年，“植物中的雄性不育”，《在雜交育種中誘導(dǎo)突變-誘導(dǎo)、分離與利用》，第123-131頁(yè)，奧地利維也納，iaea)。probus和cornerstone中的突變是輻射誘導(dǎo)的，并且據(jù)推測(cè)是由染色體臂4bs的末端缺失引起的。pugsley突變體被單獨(dú)歸為自發(fā)突變體。已將ms1基因的位置物理地映射到包含16％的遠(yuǎn)端4bs染色體臂的區(qū)域(endoetal.(1991)thejapanesejournalofgenetics66(3)：291-295(endo等人，1991年，《日本遺傳學(xué)雜志》，第66卷，第3期，第291-295頁(yè))；klindworthetal.(2002)cropsci.42：1447-1450(klindworth等人，2002年，《作物科學(xué)》，第42卷，第1447-1450頁(yè))；cencietal.(2003)theor.appl.genet107(5)：931-9(cenci等人，2003年，《理論與應(yīng)用遺傳學(xué)》，第107卷，第5期，第931-939頁(yè)))。本文提供了ms1突變msld、msle、mslf和mslh的因果變化，以及與染色體4bs上的ms1基因緊密連接的標(biāo)記。標(biāo)記包括et0487、et0488、et0489、et0490、et0491、et0495、007-0033.1和007-0046.1；參見(jiàn)seqidno：24-29和32-33。這些標(biāo)記可用于在隨后的含有msld、msle、mslf或mslh突變的小麥品系的自交和雜交中追蹤msld、msle、mslf或mslh，從而確保雄性不育性狀有利地在小麥育種程序中得以遺傳。ms1突變msld、msle和mslf是使用甲磺酸乙酯在chris小麥品種中誘導(dǎo)的ms1基因的隱性突變(klindworthetal.2002.cropsci.42：1447-1450(klindworth等人，2002年，《作物科學(xué)》，第42卷，第1447-1450頁(yè)))。外顯子1中的mslh突變是通過(guò)tilling(靶向誘導(dǎo)基因組局部突變技術(shù))(mccallumetal.(2000)nat.biotechnol.18：455-457(mccallum等人，2000年，《自然生物技術(shù)》，第18卷，第455-457頁(yè)))產(chǎn)生的。有利的是，植物育種人員可使用分子標(biāo)記通過(guò)鑒定標(biāo)記等位基因來(lái)鑒定含有ms1突變的個(gè)體，所述標(biāo)記等位基因顯示與雄性不育共分離的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的概率，表現(xiàn)為連鎖不平衡。這被稱(chēng)為標(biāo)記輔助選擇(mas)。因此，本發(fā)明還提供了用于選擇對(duì)于ms1基因的突變(諸如但不限于msld、msle和mslf)是純合的或雜合的突變體小麥植物的方法。為了進(jìn)行mas，在來(lái)自待選擇植物的生物樣品中檢測(cè)對(duì)應(yīng)于標(biāo)記核酸等位基因的核酸。這種檢測(cè)可采取探針核酸與標(biāo)記等位基因或其擴(kuò)增子進(jìn)行雜交的形式，例如使用等位基因特異性雜交、southern分析、northern分析、原位雜交、引物雜交然后對(duì)標(biāo)記區(qū)域進(jìn)行pcr擴(kuò)增、對(duì)pcr擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行dna測(cè)序等。對(duì)于本文所述的任何標(biāo)記序列，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將理解如何使用已知的dna擴(kuò)增和測(cè)序技術(shù)在特定小麥品系或品種的標(biāo)記基因座處獲得等位基因。出于本文所述的目的，所用的品系或品種是公眾可獲得的。因此，可以獲得dna，并且本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可使用所提供的引物或從所提供的參考序列研發(fā)引物，以在每個(gè)品系或品種的每個(gè)標(biāo)記基因座處擴(kuò)增和獲得序列。在驗(yàn)證生物樣品中存在(或不存在)特定標(biāo)記等位基因之后，選擇植物并與第二植物(任選地來(lái)自?xún)?yōu)良品系的小麥植物)雜交?？蓪?duì)由雜交產(chǎn)生的子代植物中的特定標(biāo)記等位基因進(jìn)行評(píng)估，并且將只選擇具有所需標(biāo)記等位基因的那些子代植物。通過(guò)標(biāo)記輔助選擇，植物育種人員可通過(guò)控制雜交來(lái)跟蹤雄性不育性狀的存在，以在需要時(shí)獲得在純合或雜合狀態(tài)含有ms1突變的新植物，從而維持ms1突變。此外，標(biāo)記輔助選擇可用于產(chǎn)生將用作雌株(即需要花粉供體植物授粉的植物)的突變體雄性不育種子親本，以產(chǎn)生具有商業(yè)價(jià)值的種子。或者，標(biāo)記輔助選擇可用于產(chǎn)生在雜合狀態(tài)含有ms1突變的f1雜交體。本文提供的任何標(biāo)記，以及與任何這些標(biāo)記連接并關(guān)聯(lián)的任何標(biāo)記，均可用于雄性不育性狀的標(biāo)記輔助選擇。術(shù)語(yǔ)“連鎖”用于描述一個(gè)標(biāo)記基因座與另一個(gè)標(biāo)記基因座或某個(gè)其它基因座(例如，雄性不育基因座)“相關(guān)聯(lián)”的程度。連鎖的常見(jiàn)量度是性狀共分離的頻率。這可表示為共分離百分比(重組頻率)，或用厘摩(cm)表示。cm是基因重組頻率的量度單位。1cm等于由于在一個(gè)世代中的交換導(dǎo)致的在一個(gè)基因座上的性狀將與在另一個(gè)基因座上的性狀分離的概率為1％(意味著性狀在99％的情況下共分離)。連鎖可表示為所期望的界限或范圍。例如，在一些實(shí)施方案中，當(dāng)標(biāo)記的間隔距離小于50、40、30、25、20或15個(gè)圖距單位(或cm)時(shí)，任何標(biāo)記與任何其它標(biāo)記(或基因座諸如ms1)連接(遺傳上和物理上)。進(jìn)一步的連鎖可通過(guò)間隔14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1個(gè)圖距單位(或cm)來(lái)描述。在某些方面，限定相等范圍的連鎖(例如介于10cm和20cm之間、介于10cm和30cm之間、或者介于10cm和40cm之間)是有利的。標(biāo)記與第二基因座連接越緊密，標(biāo)記越可能變成第二基因座的指示。因此，“緊密連接的基因座”(諸如標(biāo)記基因座和第二基因座)顯示的基因座間重組頻率為10％或更低、或者約9％或更低、或者約8％或更低、或者約7％或更低、或者約6％或更低、或者約5％或更低、或者約4％或更低、或者約3％或更低、或者約2％或更低。在其它實(shí)施方案中，關(guān)聯(lián)基因座顯示的重組頻率為約1％或更低，例如約0.75％或更低、或者約0.5％或更低，或者約0.25％或更低。如果兩個(gè)基因座位于同一染色體上，并且它們間的距離使得兩個(gè)基因座間的重組發(fā)生頻率小于10％(例如約9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.75％、0.5％、0.25％或更低)，那么也說(shuō)這兩個(gè)基因座彼此“鄰近”。因?yàn)?cm是重組頻率為1％的兩個(gè)遺傳標(biāo)記之間的距離，所以任何標(biāo)記以例如等于或小于10cm的距離與緊鄰的任何其它標(biāo)記緊密連接(遺傳上和物理上)。在同一染色體上的兩個(gè)緊密連接的標(biāo)記可定位為彼此相距9、8、7、6、5、4、3、2、1、0.75、0.5、0.25、0.1、0.075、0.05、0.025或0.01cm或更近。盡管特定標(biāo)記等位基因可顯示與雄性不育表型共分離，但需要注意的是，標(biāo)記不一定是負(fù)責(zé)表達(dá)雄性不育的基因座的一部分。例如，并沒(méi)有要求標(biāo)記多核苷酸序列是ms1基因的一部分。特定標(biāo)記等位基因和雄性不育表型之間的關(guān)聯(lián)，是由于在ms1突變起源的小麥品系中，標(biāo)記等位基因和ms1突變之間的最初“偶聯(lián)”連鎖相。因?yàn)閙sld、msle和mslf起源于品種chris，所以ms1區(qū)域內(nèi)的chris中的標(biāo)記等位基因可用于追蹤后續(xù)世代中的msld、msle和mslf突變。本文公開(kāi)了分離的或?qū)嵸|(zhì)上純化的核酸分子或蛋白質(zhì)組合物?！胺蛛x的”或“純化的”核酸分子、多核苷酸、多肽或蛋白質(zhì)，或者它們的生物活性部分，實(shí)質(zhì)上或基本上不含通常在該多核苷酸或蛋白質(zhì)的天然存在的環(huán)境中存在的、與該多核苷酸或蛋白質(zhì)相伴隨或相互作用的組分。因此，分離的或純化的多核苷酸或多肽或蛋白質(zhì)，當(dāng)通過(guò)重組技術(shù)產(chǎn)生時(shí)實(shí)質(zhì)上不含其它細(xì)胞物質(zhì)或培養(yǎng)基，或者當(dāng)通過(guò)化學(xué)法合成時(shí)實(shí)質(zhì)上不含化學(xué)前體或其它化學(xué)品。最優(yōu)的是，“分離的”多核苷酸不含在衍生該多核苷酸的生物體的基因組dna中天然位于該多核苷酸的旁側(cè)的序列(即，位于該多核苷酸的5′和3′端的序列)(最佳的是蛋白質(zhì)編碼序列)。例如，在各種實(shí)施方案中，分離的多核苷酸可含有少于約5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的在衍生該多核苷酸的細(xì)胞的基因組dna中天然位于該多核苷酸的旁側(cè)的核苷酸序列。實(shí)質(zhì)上不含細(xì)胞物質(zhì)的蛋白質(zhì)包括具有小于約30％、20％、10％、5％或1％(以干重計(jì))的污染性蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)制備物。當(dāng)本文所公開(kāi)的多肽或其生物活性部分用重組法產(chǎn)生時(shí)，最佳的是，培養(yǎng)基具有少于約30％、20％、10％、5％或1％(以干重計(jì))的化學(xué)前體或非目的蛋白質(zhì)的化學(xué)品。“受試植物”或“受試植物細(xì)胞”是其中已針對(duì)目的基因?qū)崿F(xiàn)了遺傳改變(諸如轉(zhuǎn)化)的植物或植物細(xì)胞，或者是從經(jīng)如此改變的植物或細(xì)胞遺傳下來(lái)并包含該改變的植物或植物細(xì)胞?！皩?duì)照”、“對(duì)照植物”或“對(duì)照植物細(xì)胞”提供用于測(cè)量受試植物或植物細(xì)胞的表型變化的基準(zhǔn)點(diǎn)。對(duì)照植物或植物細(xì)胞可包括例如：(a)野生型植物或植物細(xì)胞，即具有與用于進(jìn)行遺傳改變的起始材料相同的基因型的植物或植物細(xì)胞，該遺傳改變得到受試植物或細(xì)胞；(b)具有與起始材料相同的基因型但已用無(wú)效構(gòu)建體(即用對(duì)目的性狀不具有已知效果的構(gòu)建體，諸如包含標(biāo)記基因的構(gòu)建體)轉(zhuǎn)化的植物或植物細(xì)胞；(c)為受試植物或植物細(xì)胞的子代中的非轉(zhuǎn)化分離子的植物或植物細(xì)胞；(d)在遺傳上與受試植物或植物細(xì)胞相同但不暴露于會(huì)誘導(dǎo)目的基因的表達(dá)的條件或刺激因素的植物或植物細(xì)胞；或者(e)處于目的基因不被表達(dá)的條件下的受試植物或者植物細(xì)胞本身。還提供了本發(fā)明所公開(kāi)的多核苷酸的片段和變體以及由其編碼的蛋白質(zhì)。所謂“片段”，意指多核苷酸的一部分或由其編碼的氨基酸序列從而由其編碼的蛋白質(zhì)的一部分。多核苷酸的片段可編碼保留該天然蛋白質(zhì)的生物活性從而影響雄性能育性的蛋白質(zhì)片段；這些片段在本文中可被稱(chēng)為“活性片段”?；蛘?，可用作雜交探針或在下調(diào)或靶向序列修飾的構(gòu)建體和策略中有用的多核苷酸片段通常不編碼保留生物活性的蛋白質(zhì)片段，但仍可影響雄性能育性。因此，核苷酸序列的片段的范圍可為本文所公開(kāi)的編碼多肽的至少約20個(gè)核苷酸、約50個(gè)核苷酸、約100個(gè)核苷酸、直至全長(zhǎng)多核苷酸。編碼影響雄性能育性的多肽的生物活性部分的多核苷酸的片段將編碼至少15、25、30、50、100、150或200個(gè)連續(xù)氨基酸，或最多編碼存在于影響雄性能育性的全長(zhǎng)多肽(例如，seqidno：3、5、39或40)中的氨基酸總數(shù)?？捎米麟s交探針或pcr引物或者在下調(diào)構(gòu)建體或靶向修飾方法中可用的雄性能育性多核苷酸的片段通常不需要編碼多肽的生物活性部分，但可影響雄性能育性。因此，本文所公開(kāi)的雄性能育性多核苷酸的片段可編碼雄性能育性多肽的生物活性部分，或者其可以是可使用本領(lǐng)域已知的或下文所公開(kāi)的方法被用作雜交探針或pcr引物或者在下調(diào)構(gòu)建體或靶向修飾方法中可用的片段。雄性能育性多肽的生物活性部分可通過(guò)以下過(guò)程制備：分離本文所公開(kāi)的雄性能育性多核苷酸中的一者的一部分，表達(dá)雄性能育性蛋白質(zhì)的編碼部分(例如，通過(guò)體外重組表達(dá))，并且評(píng)估雄性能育性多肽的編碼部分的活性。作為雄性能育性多核苷酸的片段的多核苷酸包含至少16、20、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、800、900、1000、1200、1400、1600、1800、2000、2200、2400、2600、2800、3000、3200、3400、3600、3800或4000個(gè)核苷酸，或最多包含存在于本文所公開(kāi)的全長(zhǎng)雄性能育性多核苷酸(例如，seqidno：1、2、4、7、42、43、44或45，或者編碼seqidno：39或40的多核苷酸)中的核苷酸數(shù)。“變體”旨在意指實(shí)質(zhì)上相似的序列。對(duì)于多核苷酸，變體包含在天然多核苷酸內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)處發(fā)生一個(gè)或多個(gè)核苷酸的缺失和/或添加，和/或在天然多核苷酸中的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)處發(fā)生一個(gè)或多個(gè)核苷酸的置換。如本文所用，“天然”或“野生型”多核苷酸或多肽分別包含天然存在的核苷酸序列或氨基酸序列。對(duì)于多核苷酸，保守變體包括由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性而編碼本文所公開(kāi)的雄性能育性多肽的氨基酸序列的那些序列。天然等位基因變體(如這些)可用熟知的分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行鑒定，例如用下文所述的聚合酶鏈反應(yīng)(pcr)和雜交技術(shù)來(lái)鑒定。變體多核苷酸還包括合成來(lái)源的多核苷酸，諸如那些例如通過(guò)使用定點(diǎn)誘變產(chǎn)生并且可編碼雄性能育性多肽的多核苷酸。通常，本文所公開(kāi)的特定多核苷酸的變體將與該特定多核苷酸(例如，seqidno：1、2、4、7、42、43、44或45)具有至少約40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性，這是通過(guò)本文別處所述的或本領(lǐng)域已知的序列比對(duì)程序和參數(shù)確定的。本文所公開(kāi)的特定多核苷酸(即，參考多核苷酸)的變體還可通過(guò)比較變體多核苷酸所編碼的多肽與該參考多核苷酸所編碼的多肽之間的百分比序列同一性來(lái)進(jìn)行評(píng)估。因此，例如分離的多核苷酸可編碼與seqidno：3、5、39或40的多肽具有給定百分比序列同一性的多肽。任何兩種多肽之間的百分比序列同一性可用本文別處描述的序列比對(duì)程序和參數(shù)來(lái)計(jì)算。在本文所公開(kāi)的任何給定的多核苷酸對(duì)通過(guò)比較它們編碼的兩種多肽所共享的百分比序列同一性來(lái)進(jìn)行評(píng)估，這兩種編碼的多肽之間的百分比序列同一性為至少約40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性?！白凅w”蛋白質(zhì)旨在意指通過(guò)在天然蛋白質(zhì)中的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)處缺失或添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸和/或在天然蛋白質(zhì)中的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)處置換一個(gè)或多個(gè)氨基酸而從該天然蛋白質(zhì)衍生的蛋白質(zhì)。本文所公開(kāi)的變體蛋白質(zhì)具有生物活性，即它們?nèi)匀痪哂刑烊坏鞍踪|(zhì)的生物活性，即本文所述的雄性能育性活性。這類(lèi)變體可例如由遺傳多態(tài)性或人類(lèi)操縱而得到。本文所公開(kāi)的雄性能育性蛋白質(zhì)的生物活性變體將與該天然蛋白質(zhì)的氨基酸序列(例如，seqidno：3、5、39或40)具有至少約40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性，這是通過(guò)本文別處所述的或本領(lǐng)域已知的序列比對(duì)程序和參數(shù)確定的。本文所公開(kāi)的蛋白質(zhì)的生物活性變體與該蛋白質(zhì)可相差少至1-15個(gè)氨基酸殘基，少至1-10個(gè)(諸如6-10個(gè))、少至5個(gè)、少至4個(gè)、3個(gè)、2個(gè)或甚至1個(gè)氨基酸殘基。本文所公開(kāi)的蛋白質(zhì)可通過(guò)各種方式(包括氨基酸置換、缺失、截短和插入)進(jìn)行改變。用于此類(lèi)操縱的方法是本領(lǐng)域公知的。例如，雄性能育性多肽的氨基酸序列變體和片段可通過(guò)在dna中進(jìn)行突變來(lái)制備。用于誘變和多核苷酸改變的方法是本領(lǐng)域熟知的。參見(jiàn)，例如kunkel(1985)proc.natl.acad.sci.usa82：488-492(kunkel，1985年，《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》，第82卷，第488-492頁(yè))；kunkeletal.(1987)methodsinenzymol.154：367-382(kunkel等人，1987年，《酶學(xué)方法》，第154卷，第367-382頁(yè))；美國(guó)專(zhuān)利4,873,192；walkerandgaastra，eds.(1983)techniquesinmolecularbiology(macmillanpublishingcompany，newyork)(walker和gaastra編輯，1983年，《分子生物學(xué)技術(shù)》(紐約麥克米蘭出版公司))以及其中引用的參考文獻(xiàn)。有關(guān)不影響目的蛋白質(zhì)的生物活性的適當(dāng)氨基酸置換的指導(dǎo)可在以下文獻(xiàn)所述的模型中找到：dayhoffetal.(1978)atlasofproteinsequenceandstructure(natl.biomed.res.found.，washington，d.c.)(dayhoff等人，1978年，《蛋白序列和結(jié)構(gòu)圖表集》(美國(guó)國(guó)家生物醫(yī)學(xué)研究基金會(huì)，華盛頓特區(qū)))，該文獻(xiàn)以引用方式并入本文。保守置換，諸如將一個(gè)氨基酸用另一個(gè)具有相似性質(zhì)的氨基酸進(jìn)行交換，可能是最佳的。因此，本文所公開(kāi)的基因和多核苷酸包括天然存在的序列以及dna序列變體兩者。同樣，雄性能育性多肽和蛋白質(zhì)涵蓋天然存在的多肽以及其變型形式和修飾形式兩者。這種多核苷酸和多肽變體可仍然具有所需的雄性能育性活性，在這種情況下，將在編碼變體的dna中進(jìn)行的突變不應(yīng)將序列置于閱讀框之外，并且最好不形成可產(chǎn)生二級(jí)mrna結(jié)構(gòu)的互補(bǔ)區(qū)域。參見(jiàn)ep專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)75，444。本文所涵蓋的蛋白質(zhì)序列的某些缺失、插入和置換預(yù)期不產(chǎn)生該蛋白質(zhì)特性的根本變化。然而，當(dāng)在進(jìn)行置換、缺失或插入之前難以預(yù)測(cè)其確切效應(yīng)時(shí)，本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到該效應(yīng)將通過(guò)常規(guī)的篩選測(cè)定法進(jìn)行評(píng)估。即，該活性可通過(guò)測(cè)定雄性能育性活性來(lái)評(píng)估。雄性能育性的增強(qiáng)或下降可以以多種方式來(lái)測(cè)定。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可通過(guò)以下過(guò)程容易地評(píng)估變體或片段的活性：將多核苷酸引入對(duì)于多核苷酸的穩(wěn)定雄性不育等位基因而言為純合的植物中，隨后觀(guān)察植物中的雄性組織發(fā)育。例如，為了測(cè)定由seqidno：1、2、4、7、42、43、44或45的片段或變體賦予的雄性能育性活性，本領(lǐng)域技術(shù)人員可通過(guò)鑒定表達(dá)ms1表型的植物或通過(guò)構(gòu)建對(duì)于天然ms1基因的突變而言為純合的植物來(lái)開(kāi)始，從而導(dǎo)致雄性不育。隨后，技術(shù)人員可通過(guò)以下過(guò)程對(duì)突變進(jìn)行彌補(bǔ)：提供ms1多核苷酸或者其片段或變體，隨后觀(guān)察植物的雄性組織是否正常發(fā)育以及是否能夠產(chǎn)生成熟花粉。變體功能性多核苷酸和蛋白質(zhì)還涵蓋由誘變和重組過(guò)程(諸如dna改組)獲得的序列和蛋白質(zhì)。利用這種過(guò)程，可操縱一種或多種不同的雄性能育性序列以產(chǎn)生具有所需性質(zhì)的新雄性能育性多肽。這樣，從一組相關(guān)的序列多核苷酸生成重組多核苷酸的文庫(kù)，該相關(guān)的序列多核苷酸包含具有顯著序列同一性且可在體外或體內(nèi)發(fā)生同源重組的序列區(qū)域。例如，使用該方法，可將編碼目的結(jié)構(gòu)域的序列基序在本文所公開(kāi)的雄性能育性多核苷酸與其它已知的雄性能育性多核苷酸之間進(jìn)行改組，以獲得編碼具有改善的目的性質(zhì)(諸如，在酶的情況中為提高的km)的蛋白質(zhì)的新基因。這種dna改組的策略是本領(lǐng)域已知的。參見(jiàn)例如stemmer(1994)proc.natl.acad.sci.usa91：10747-10751(stemmer，1994年，《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》，第91卷，第10747-10751頁(yè))；stemmer(1994)nature370：389-391(stemmer，1994年，《自然》，第370卷，第389-391頁(yè))；cramerietal.(1997)naturebiotech.15：436-438(crameri等人，1997年，《自然生物技術(shù)》，第15卷，第436-438頁(yè))；mooreetal.(1997)j.mol.biol.272：336-347(moore等人，1997年，《分子生物學(xué)雜志》，第272卷，第336-347頁(yè))；zhangetal.(1997)proc.natl.acad.sci.usa94：4504-4509(zhang等人，1997年，《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》，第94卷，第4504-4509頁(yè))；cramerietal.(1998)nature391：288-291(crameri等人，1998年，《自然》，第391卷，第288-291頁(yè))；以及美國(guó)專(zhuān)利5,605,793和5,837,458。ii.序列分析如本文所用，“序列同一性”或“同一性”在兩個(gè)多核苷酸或多肽序列的情形中是指當(dāng)在指定的比較窗口上進(jìn)行比對(duì)以獲得最大對(duì)應(yīng)時(shí)兩個(gè)序列中相同的殘基。當(dāng)序列同一性百分比用于蛋白質(zhì)時(shí)，應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到不相同的殘基位置往往差別在于保守氨基酸置換，其中氨基酸殘基由具有相似化學(xué)性質(zhì)(例如電荷或疏水性)的其它氨基酸殘基置換，因此不會(huì)改變分子的功能性質(zhì)。當(dāng)序列差別在于保守置換時(shí)，則可以上調(diào)百分比序列同一性以校正置換的保守性質(zhì)。差別在于這種保守置換的序列被稱(chēng)為具有“序列相似性”或“相似性”。用于作出這個(gè)調(diào)整的手段是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。通常，這涉及將保守置換評(píng)定為部分錯(cuò)配而不是完全錯(cuò)配，從而增加百分比序列同一性。因此，例如，如果相同的氨基酸給予1分，非保守置換給予0分，則保守置換給予0至1之間的分?jǐn)?shù)。保守置換的評(píng)分是例如在程序pc/gene(美國(guó)加利福尼亞州山景城(mountainview，california)的intelligenetics公司)中所執(zhí)行那樣進(jìn)行計(jì)算。本文所用的“序列同一性百分比”意指通過(guò)在比較窗口上比較兩個(gè)最佳比對(duì)的序列所確定的數(shù)值，其中多核苷酸序列在該比較窗口中的部分與參考序列(不包含添加或缺失)相比可包含添加或缺失(即，空位)，以便兩個(gè)序列的最佳比對(duì)。通過(guò)以下方式計(jì)算該百分比：確定在兩個(gè)序列中出現(xiàn)相同核酸堿基或氨基酸殘基的位置的數(shù)目以得到匹配的位置的數(shù)目，將匹配的位置的數(shù)目除以比較窗口中位置的總數(shù)目，然后將結(jié)果乘以100以得到序列同一性百分比。除非另外指明，否則本文提供的序列同一性/相似性值是指使用采用以下參數(shù)的gap版本10或其任何等同程序獲得的值：核苷酸序列的同一性百分比和相似性百分比采用gap權(quán)重50和長(zhǎng)度權(quán)重3以及nwsgapdna.cmp計(jì)分矩陣；氨基酸序列的同一性百分比和相似性百分比采用gap權(quán)重8和長(zhǎng)度權(quán)重2以及blosum62計(jì)分矩陣。所謂“等同程序”意指任何這樣的序列比較程序，其對(duì)于任何兩條所考慮的序列，相比于gap版本10所產(chǎn)生的對(duì)應(yīng)的比對(duì)，能產(chǎn)生具有相同的核苷酸或氨基酸殘基匹配和相同的百分比序列同一性的比對(duì)。術(shù)語(yǔ)“多核苷酸”的使用并不旨在將本公開(kāi)局限于包含dna的多核苷酸。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，多核苷酸可包含核糖核苷酸以及具有核糖核苷酸與脫氧核糖核苷酸的組合。這種脫氧核糖核苷酸和核糖核苷酸既包括天然存在的分子，也包括合成的類(lèi)似物。本文所公開(kāi)的多核苷酸還涵蓋所有形式的序列，包括但不限于單鏈形式、雙鏈形式、發(fā)夾結(jié)構(gòu)、莖-環(huán)結(jié)構(gòu)等。iii.表達(dá)盒本文所公開(kāi)的雄性能育性多核苷酸可在表達(dá)盒中提供，以用于在目的生物體中表達(dá)。表達(dá)盒可包含可操作地連接至本文所公開(kāi)的雄性能育性多核苷酸的5′和3′調(diào)控序列?！翱刹僮鞯剡B接”旨在意指兩個(gè)或更多個(gè)元件之間的功能性連接。例如，目的多核苷酸與調(diào)控序列(例如，啟動(dòng)子)之間的可操作地連接是可使該目的多核苷酸得以表達(dá)的功能性連接。可操作地連接的元件可以是連續(xù)的或非連續(xù)的。當(dāng)用來(lái)指兩個(gè)蛋白質(zhì)編碼區(qū)域的連接時(shí)，所謂可操作地連接，是指所述編碼區(qū)域處于同一閱讀框中。本文所公開(kāi)的表達(dá)盒在5′-3′轉(zhuǎn)錄方向上可包含在宿主細(xì)胞(例如，植物細(xì)胞)中起作用的轉(zhuǎn)錄和翻譯起始區(qū)(即，啟動(dòng)子)、目的多核苷酸以及轉(zhuǎn)錄和翻譯終止區(qū)(即，終止區(qū))。表達(dá)盒還設(shè)置有多個(gè)限制性位點(diǎn)和/或重組位點(diǎn)，以使雄性能育性多核苷酸的插入處于本文別處所述的調(diào)控區(qū)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控之下。調(diào)控區(qū)(即，啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)和翻譯終止區(qū))和/或目的多核苷酸對(duì)于宿主細(xì)胞而言或彼此之間可以是天然的/相似的。或者，調(diào)控區(qū)和/或目的多核苷酸對(duì)于宿主細(xì)胞而言或彼此之間可以是異源的。如本文所用，關(guān)于多核苷酸或多肽序列的“異源”是起源于外來(lái)物種的序列，或者，如果起源于相同物種的話(huà)，則為通過(guò)蓄意的人為干預(yù)從其天然形式在組成和/或基因座方面進(jìn)行實(shí)質(zhì)性修飾得到的序列。例如，可操作地連接至異源多核苷酸的啟動(dòng)子來(lái)自與衍生該多核苷酸的物種不同的物種，或者，如果來(lái)自相同/相似的物種，那么一方或雙方實(shí)質(zhì)上由它們的源形式和/或基因組修飾得到，或者該啟動(dòng)子不是可操作地連接的多核苷酸的天然啟動(dòng)子。如本文所用，除非另外指明，否則嵌合多核苷酸包括與轉(zhuǎn)錄起始區(qū)可操作地連接的編碼序列，該轉(zhuǎn)錄起始區(qū)對(duì)于該編碼序列是異源的。在某些實(shí)施方案中，本文所公開(kāi)的多核苷酸可與本文別處所公開(kāi)的或本領(lǐng)域已知的目的多核苷酸序列的任何組合或表達(dá)盒堆疊。例如，本文所公開(kāi)的雄性能育性多核苷酸可與本文別處所公開(kāi)的或本領(lǐng)域已知的編碼雄性配子破壞性多核苷酸或多肽、細(xì)胞毒素、標(biāo)記、或其它雄性能育性序列的任何其它多核苷酸堆疊。堆疊的多核苷酸可操作地連接至與雄性能育性多核苷酸相同的啟動(dòng)子，或者可操作地連接至單獨(dú)的啟動(dòng)子多核苷酸。如本文別處所述，表達(dá)盒可包含可操作地連接至目的多核苷酸的啟動(dòng)子，連同對(duì)應(yīng)的終止區(qū)。終止區(qū)對(duì)于轉(zhuǎn)錄起始區(qū)可以是天然的，對(duì)于可操作地連接的目的雄性能育性多核苷酸或雄性能育性啟動(dòng)子序列可以是天然的，對(duì)于植物宿主可以是天然的，或者可以源自另一來(lái)源(即，外來(lái)的或異源的)。易得的終止區(qū)可獲自根瘤農(nóng)桿菌(a.tumefaciens)的ti質(zhì)粒，諸如章魚(yú)堿合酶和胭脂堿合酶終止區(qū)。還可參見(jiàn)guerineauetal.(1991)mol.gen.genet.262：141-144(guerineau等人，1991年，《分子遺傳學(xué)與普通遺傳學(xué)》，第262卷，第141-144頁(yè))；proudfoot(1991)cell64：671-674(proudfoot，1991年，《細(xì)胞》，第64卷，第671-674頁(yè))；sanfaconetal.(1991)genesdev.5：141-149(sanfacon等人，1991年，《基因與發(fā)育》，第5卷，第141-149頁(yè))；mogenetal.(1990)plantcell2：1261-1272(mogen等人，1990年，《植物細(xì)胞》，第2卷，第1261-1272頁(yè))；munroeetal.(1990)gene91：151-158(munroe等人，1990年，《基因》，第91卷，第151-158頁(yè))；ballasetal.(1989)nucleicacidsres.17：7891-7903(ballas等人，1989年，《核酸研究》，第17卷，第7891-7903頁(yè))；以及joshietal.(1987)nucleicacidsres.15：9627-9639(joshi等人，1987年，《核酸研究》，第15卷，第9627-9639頁(yè))。如適當(dāng)?shù)脑?huà)，可對(duì)目的多核苷酸進(jìn)行優(yōu)化以使其在轉(zhuǎn)化的植物中的表達(dá)提高。也就是說(shuō)，可使用植物優(yōu)選的密碼子來(lái)合成或改變多核苷酸，以便提高其表達(dá)。有關(guān)宿主優(yōu)選的密碼子用法的討論，參見(jiàn)例如campbellandgowri(1990)plantphysiol.92：1-11(campbell和gowri，1990年，《植物生理學(xué)》，第92卷，第1-11頁(yè))。合成植物優(yōu)選基因的方法是本領(lǐng)域可得的。參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利5,380,831和5,436,391，以及murrayetal.(1989)nucleicacidsres.17：477-498(murray等人，1989年，《核酸研究》，第17卷，第477-498頁(yè))，將其以引用方式并入本文。已知增強(qiáng)細(xì)胞宿主中的基因表達(dá)的另外的序列修飾。這些序列修飾包括消除以下序列：編碼假聚腺苷酸化信號(hào)、外顯子-內(nèi)含子剪接位點(diǎn)信號(hào)、轉(zhuǎn)座子樣重復(fù)序列，以及其它此類(lèi)得到充分表征的可能對(duì)基因表達(dá)有害的序列?？蓪⑿蛄械膅-c含量調(diào)整到給定的細(xì)胞宿主的平均水平，該平均水平通過(guò)參考在宿主細(xì)胞中表達(dá)的已知基因計(jì)算得到。當(dāng)可能時(shí)，修飾序列以避免可預(yù)見(jiàn)的發(fā)夾二級(jí)mrna結(jié)構(gòu)。表達(dá)盒可以另外含有5′前導(dǎo)序列。此類(lèi)前導(dǎo)序列可以起到增強(qiáng)翻譯的作用。翻譯前導(dǎo)序列是本領(lǐng)域已知的，包括：小核糖核酸病毒前導(dǎo)序列，例如emcv前導(dǎo)序列(腦心肌炎5′非編碼區(qū))(elroy-steinetal.(1989)proc.natl.acad.sci.usa86：6126-6130(elroy-stein等人，1989年，《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》，第86卷，第6126-6130頁(yè))；馬鈴薯y病毒組前導(dǎo)序列，例如tev前導(dǎo)序列(煙草蝕紋病毒)(gallieetal.(1995)gene165(2)：233-238(gallie等人，1995年，《基因》，第165卷，第2期，第233-238頁(yè)))、mdmv前導(dǎo)序列(玉米矮花葉病毒)(johnson，etal.，(1986)virology154：9-20(johnson等人，1986年，《病毒學(xué)》，第154卷，第9-20頁(yè)))和人免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白(bip)(macejak，etal.，(1991)nature353：90-94(macejak等人，1991年，《自然》，第353卷，第90-94頁(yè)))；來(lái)自苜?；ㄈ~病毒的外殼蛋白mrna的非翻譯前導(dǎo)序列(amvrna4)(joblingetal.(1987)nature325：622-625(jobling等人，1987年，《自然》，第325卷，第622-625頁(yè)))；煙草花葉病毒前導(dǎo)序列(tmv)(gallieetal.(1989)inmolecularbiologyofrna，ed.cech(liss，newyork)，pp.237-256(gallie等人，1989年，載于《rna的分子生物學(xué)》，cech編輯(liss，紐約)，第237-256頁(yè)))；以及玉米枯黃斑點(diǎn)病毒前導(dǎo)序列(mcmv)(lommeletal.(1991)virology81：382-385(lommel等人，1991年，《病毒學(xué)》，第81卷，第382-385頁(yè)))。還可參見(jiàn)della-cioppaetal.(1987)plantphysiol.84：965-968(della-cioppa等人，1987年，《植物生理學(xué)》，第84卷，第965-968頁(yè))。也可利用其它已知的用于增強(qiáng)翻譯的方法，例如內(nèi)含子等等。在制備表達(dá)盒時(shí)，可對(duì)多個(gè)dna片段進(jìn)行操縱，以提供處于正確取向的dna序列，且適當(dāng)時(shí)提供處于正確的閱讀框的dna序列。為此目的，可應(yīng)用銜接子或接頭將dna片段連接在一起，或者可涉及其它的操縱以提供便利的限制性位點(diǎn)、去除多余的dna、去除限制性位點(diǎn)等。出于這個(gè)目的，可能涉及體外誘變、引物修復(fù)、限制性酶切、退火、再置換(例如轉(zhuǎn)換和顛換)。在特定實(shí)施方案中，本文所公開(kāi)的表達(dá)盒包含可操作地連接至雄性能育性多核苷酸的啟動(dòng)子或者其片段或變體，如本文所公開(kāi)。在某些實(shí)施方案中，雄性能育性啟動(dòng)子可操作地連接至本文所公開(kāi)的雄性能育性多核苷酸，諸如seqidno：1、2、4、7、42、43、44或45示出的多核苷酸，或其活性片段或變體。在某些實(shí)施方案中，植物啟動(dòng)子可優(yōu)先地在某些組織(諸如雄蕊、花粉囊、花絲和花粉)或發(fā)育生長(zhǎng)階段(諸如造孢組織、小孢子和小配子體)中起始轉(zhuǎn)錄。這種植物啟動(dòng)子被稱(chēng)為“組織優(yōu)選的”、“細(xì)胞類(lèi)型優(yōu)選的”或“生長(zhǎng)階段優(yōu)選的”。僅在某些組織中起始轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子被稱(chēng)為“組織特異性的”。同樣，僅在某些生長(zhǎng)階段起始轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子被稱(chēng)為“生長(zhǎng)階段特異性的”?！凹?xì)胞類(lèi)型特異性”啟動(dòng)子僅在一種或多種器官中的某些細(xì)胞類(lèi)型中驅(qū)動(dòng)表達(dá)，例如雄蕊細(xì)胞，或雄蕊內(nèi)的單獨(dú)細(xì)胞類(lèi)型諸如花粉囊、花絲或花粉細(xì)胞。“雄性能育性啟動(dòng)子”可唯一地或優(yōu)先地在涉及小孢子發(fā)生或小配子發(fā)生的過(guò)程的細(xì)胞或組織中起始轉(zhuǎn)錄。本文所公開(kāi)的雄性能育性多核苷酸及其活性片段和變體可操作地連接至雄性組織特異性的或雄性組織優(yōu)選的啟動(dòng)子，包括例如雄蕊特異性的或雄蕊優(yōu)選的啟動(dòng)子、花粉囊特異性的或花粉囊優(yōu)選的啟動(dòng)子、花粉特異性的或花粉優(yōu)選的啟動(dòng)子、絨氈層特異性的啟動(dòng)子或絨氈層優(yōu)選的啟動(dòng)子，等等?？苫谒璧慕Y(jié)果來(lái)選擇啟動(dòng)子。例如，目的多核苷酸可操作地連接至組成型啟動(dòng)子、組織優(yōu)選的啟動(dòng)子、生長(zhǎng)階段優(yōu)選的啟動(dòng)子或其它啟動(dòng)子，以在植物中表達(dá)。在一個(gè)實(shí)施方案中，啟動(dòng)子可以是唯一地或優(yōu)先地在植物的雄性組織中表達(dá)可操作地連接的目的多核苷酸的那些啟動(dòng)子。在該過(guò)程中不必使用特定雄性能育性組織優(yōu)選的或組織特異性的啟動(dòng)子；并且可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種此類(lèi)啟動(dòng)子中的任何一種。一個(gè)這種啟動(dòng)子為5126啟動(dòng)子，其優(yōu)先地將其所連接的多核苷酸的表達(dá)引導(dǎo)至植物的雄性組織，如在美國(guó)專(zhuān)利5,837,851和5,689,051中所述。其它示例包括美國(guó)專(zhuān)利6,037,523中描述的玉米ms45啟動(dòng)子；美國(guó)專(zhuān)利6,452,069中描述的sf3啟動(dòng)子；wo02/063021中描述的bs92-7啟動(dòng)子；以及美國(guó)專(zhuān)利5,470,359中描述的sgb6調(diào)控元件；ta29啟動(dòng)子(koltunow，etal.，(1990)plantcell2：1201-1224(koltunow等人，1990年，《植物細(xì)胞》，第2卷，第1201-1224頁(yè))；nature347：737(1990)(《自然》，第347卷，第737頁(yè)，1990年)；goldberg，etal.，(1993)plantcell5：1217-1229(goldberg等人，1993年，《植物細(xì)胞》，第5卷，第1217-1229頁(yè))以及美國(guó)專(zhuān)利6,399,856)；sb200基因啟動(dòng)子(wo2002/26789)、pg47基因啟動(dòng)子(美國(guó)專(zhuān)利5,412,085；美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,545,546；plantj3(2)：261-271(1993)(《植物雜志》，第3卷，第2期，第261-271頁(yè)，1993年))、g9基因啟動(dòng)子(美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,837,850；5,589,610)；2型金屬硫蛋白樣基因啟動(dòng)子(charbonnel-campaa，etal.，gene(2000)254：199-208(charbonnel-campaa等人，《基因》，2000年，第254卷，第199-208頁(yè)))；蕓苔屬bca9啟動(dòng)子(lee，etal.，(2003)plantcellrep.22：268-273(lee等人，2003年，《植物細(xì)胞報(bào)告》，第22卷，第268-273頁(yè)))；zm13啟動(dòng)子(hamilton，etal.，(1998)plantmol.biol.38：663-669(hamilton等人，1998年，《植物分子生物學(xué)》，第38卷，第663-669頁(yè)))；肌動(dòng)蛋白解聚因子啟動(dòng)子(諸如zmabp1、zmabp2；參見(jiàn)例如lopez，etal.，(1996)proc.natl.acad.sci.usa93：7415-7420(lopez等人，1996年，《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》，第93卷，第7415-7420頁(yè)))；玉米果膠甲酯酶樣基因的啟動(dòng)子zmc5(wakeley，etal.，(1998)plantmol.biol.37：187-192(wakeley等人，1998年，《植物分子生物學(xué)》，第37卷，第187-192頁(yè)))；抑制蛋白基因啟動(dòng)子zmprol(kovar，etal.，(2000)theplantcell12：583-598(kovar等人，2000年，《植物細(xì)胞》，第12卷，第583-598頁(yè)))；硫酸化五肽phytosulphokine基因zmpsk1(lorbiecke，etal.，(2005)journalofexperimentalbotany56(417)：1805-1819(lorbiecke等人，2005年，《實(shí)驗(yàn)植物學(xué)雜志》，第56卷，第417期，第1805-1819頁(yè)))；鈣調(diào)蛋白結(jié)合蛋白的啟動(dòng)子mpcbp(reddy，etal.，(2000)j.biol.chem.275(45)：35457-70(reddy等人，2000年，《生物化學(xué)雜志》，第275卷，第45期，第35457-35470頁(yè)))。如本文所公開(kāi)，組成型啟動(dòng)子包括例如rsyn7啟動(dòng)子的核心啟動(dòng)子和wo99/43838和美國(guó)專(zhuān)利6,072,050中公開(kāi)的其它組成型啟動(dòng)子；camv35s核心啟動(dòng)子(odelletal.(1985)nature313：810-812(odell等人，1985年，《自然》，第313卷，第810-812頁(yè)))；稻肌動(dòng)蛋白(mcelroyetal.(1990)plantcell2：163-171(mcelroy等人，1990年，《植物細(xì)胞》，第2卷，第163-171頁(yè)))；泛素(christensenetal.(1989)plantmol.biol.12：619-632(christensen等人，1989年，《植物分子生物學(xué)》，第12卷，第619-632頁(yè))和christensenetal.(1992)plantmol.biol.18：675-689(christensen等人，1992年，《植物分子生物學(xué)》，第18卷，第675-689頁(yè)))；pemu(lastetal.(1991)theor.appl.genet.81：581-588(last等人，1991年，《理論與應(yīng)用遺傳學(xué)》，第81卷，第581-588頁(yè)))；mas(veltenetal.(1984)emboj.3：2723-2730(velten等人，1984年，《歐洲分子生物學(xué)組織雜志》，第3卷，第2723-2730頁(yè)))；als啟動(dòng)子(美國(guó)專(zhuān)利5,659,026)，等等。其它組成型啟動(dòng)子包括例如美國(guó)專(zhuān)利5,608,149、5,608,144、5,604,121、5,569,597、5,466,785、5,399,680、5,268,463、5,608,142、和6,177,611?！胺N子優(yōu)選的”啟動(dòng)子包括在種子發(fā)育期間活躍的那些啟動(dòng)子(諸如種子貯藏蛋白的啟動(dòng)子)以及在種子發(fā)芽期間活躍的那些啟動(dòng)子。參見(jiàn)thompsonetal.(1989)bioessays10：108(thompson等人，1989年，《生物學(xué)論文集》，第10卷，第108頁(yè))，該文獻(xiàn)以引用方式并入本文。這類(lèi)種子優(yōu)選的啟動(dòng)子包括但不限于ciml(細(xì)胞分裂素誘導(dǎo)信息)；cz19b1(玉米19kda玉米醇溶蛋白)；milps(肌醇-1-磷酸合酶)(參見(jiàn)wo00/11177和美國(guó)專(zhuān)利6,225,529；所述專(zhuān)利以引用方式并入本文)。γ-玉米醇溶蛋白基因啟動(dòng)子是胚乳特異性啟動(dòng)子。球蛋白-1(glob-1)基因啟動(dòng)子是代表性的胚特異性啟動(dòng)子。對(duì)于雙子葉植物而言，種子特異性啟動(dòng)子包括但不限于菜豆β-菜豆蛋白基因啟動(dòng)子、油菜籽蛋白(napin)基因啟動(dòng)子、β-伴大豆球蛋白基因啟動(dòng)子、大豆凝集素基因啟動(dòng)子、十字花科蛋白基因啟動(dòng)子等。對(duì)于單子葉植物而言，種子特異性啟動(dòng)子包括但不限于玉米15kda玉米醇溶蛋白、22kda玉米醇溶蛋白、27kda玉米醇溶蛋白、γ-玉米醇溶蛋白、糯性蛋白基因(waxy)、超甜蛋白1(shrunken1)、超甜蛋白2(shrunken2)、球蛋白1等。還可參見(jiàn)wo00/12733，其中公開(kāi)了來(lái)自endl和end2基因的種子優(yōu)選的啟動(dòng)子。另外的胚特異性啟動(dòng)子在如下文獻(xiàn)中公開(kāi)：satoetal.(1996)proc.natl.acad.sci.93：8117-8122(sato等人，1996年，《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》，第93卷，第8117-8122頁(yè))；nakaseetal.(1997)plantj12：235-46(nakase等人，1997年，《植物雜志》，第12卷，第235-246頁(yè))；以及postma-haarsmaetal.(1999)plantmol.biol.39：257-71(postma-haarsma等人，1999年，《植物分子生物學(xué)》，第39卷，第257-271頁(yè))。另外的胚乳特異性啟動(dòng)子在如下文獻(xiàn)中公開(kāi)：albanietal.(1984)embo3：1405-15(albani等人，1984年，《歐洲分子生物學(xué)組織雜志》，第3卷，第1405-1415頁(yè))；albanietal.(1999)theor.appl.gen.98：1253-62(albani等人，1999年，《理論與應(yīng)用遺傳學(xué)》，第98卷，第1253-1262頁(yè))；albanietal.(1993)plantj.4：343-55(albani等人，1993年，《植物雜志》，第4卷，第343-355頁(yè))；menaetal.(1998)theplantjournal116：53-62(mena等人，1998年，《植物雜志》，第116卷，第53-62頁(yè))和wuetal.(1998)plantcellphysiology39：885-889(wu等人，1998年，《植物細(xì)胞生理學(xué)》，第39卷，第885-889頁(yè))。分裂細(xì)胞或分生組織優(yōu)選的啟動(dòng)子已在如下文獻(xiàn)中公開(kāi)：itoetal.(1994)plantmol.biol.24：863-878(ito等人，1994年，《植物分子生物學(xué)》，第24卷，第863-878頁(yè))；reyadetal.(1995)mo.gen.genet.248：703-711(reyad等人，1995年，《分子遺傳學(xué)與普通遺傳學(xué)》，第248卷，第703-711頁(yè))；shauletal.(1996)proc.natl.acad.sci.93：4868-4872(shaul等人，1996年，《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》，第93卷，第4868-4872頁(yè))；itoetal.(1997)plantj.11：983-992(ito等人，1997年，《植物雜志》，第11卷，第983-992頁(yè))；以及trehinetal.(1997)plantmol.biol.35：667-672(trehin等人，1997年，《植物分子生物學(xué)》，第35卷，第667-672頁(yè))。脅迫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子包括鹽/水脅迫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，諸如p5cs(zangetal.(1997)plantsciences129：81-89(zang等人，1997年，《植物科學(xué)》，第129卷，第81-89頁(yè)))；冷誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，諸如cor15a(hajelaetal.(1990)plantphysiol.93：1246-1252(hajela等人，1990年，《植物生理學(xué)》，第93卷，第1246-1252頁(yè)))、cor15b(wlihelmetal.(1993)plantmolbiol23：1073-1077(wlihelm等人，1993年，《植物分子生物學(xué)》，第23卷，第1073-1077頁(yè)))、wsc120(ouelletetal.(1998)febslett.423-324-328(ouellet等人，1998年，《歐洲生化學(xué)會(huì)聯(lián)合會(huì)快報(bào)》，第423卷，第324-328頁(yè)))、ci7(kirchetal.(1997)plantmolbiol.33：897-909(kirch等人，1997年，《植物分子生物學(xué)》，第33卷，第897-909頁(yè)))、ci21a(schneideretal.(1997)plantphysiol.113：335-45(schneider等人，1997年，《植物生理學(xué)》，第113卷，第335-345頁(yè)))；干旱誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，諸如trg-31(chaudharyetal(1996)plantmol.biol.30：1247-57(chaudhary等人，1996年，《植物分子生物學(xué)》，第30卷，第1247-1257頁(yè)))、rd29(kasugaetal.(1999)naturebiotechnology18：287-291(kasuga等人，1999年，《自然生物技術(shù)》，第18卷，第287-291頁(yè)))；滲透誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，諸如rab17(vilardelletal.(1991)plantmol.biol.17：985-93(vilardell等人，1991年，《植物分子生物學(xué)》，第17卷，第985-993頁(yè)))和滲透蛋白(raghothamaetal.(1993)plantmolbiol23：1117-28(raghothama等人，1993年，《植物分子生物學(xué)》，第23卷，第1117-1128頁(yè)))；以及熱誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，諸如熱休克蛋白(barrosetal.(1992)plantmol.19：665-75(barros等人，1992年，《植物分子生物學(xué)》，第19卷，第665-675頁(yè))；marrsetal.(1993)dev.genet.14：27-41(marrs等人，1993年，《發(fā)育遺傳學(xué)》，第14卷，第27-41頁(yè)))和smhsp(watersetal.(1996)j.experimentalbotany47：325-338(waters等人，1996年，《實(shí)驗(yàn)植物學(xué)雜志》，第47卷，第325-338頁(yè)))。其它脅迫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子包括rip2(美國(guó)專(zhuān)利5,332,808和美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)2003/0217393)和rd29a(yamaguchi-shinozakietal.(1993)mol.gen.genetics236：331-340(yamaguchi-shinozaki等人，1993年，《分子遺傳學(xué)與普通遺傳學(xué)》，第236卷，第331-340頁(yè)))。如本文別處所述，包含雄性能育性多核苷酸的表達(dá)盒可與其它目的多核苷酸堆疊。任何目的多核苷酸均可與雄性能育性多核苷酸堆疊，包括例如雄性配子破壞性多核苷酸和標(biāo)記多核苷酸。本文所公開(kāi)的雄性能育性多核苷酸可堆疊在包含可操作地連接至具有雄性配子破壞性的多核苷酸(即，干擾雄性配子的功能、形成或傳播的多核苷酸)的啟動(dòng)子的表達(dá)盒中，或與該表達(dá)盒堆疊?？赏ㄟ^(guò)多種方法中的任一種來(lái)操作雄性配子破壞性多核苷酸以阻止雄性配子的功能、形成或傳播。以舉例而非限制的方式，這可包括使用這樣的多核苷酸，其編碼基因產(chǎn)物諸如dam-甲基化酶或芽孢桿菌rna酶(參見(jiàn)例如，美國(guó)專(zhuān)利5,792,853或5,689,049，pct/ep89/00495)；編碼干擾淀粉累積、降解淀粉或影響花粉中的滲透平衡的基因產(chǎn)物，諸如α-淀粉酶(參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利7,875,764、8,013,218、7,696,405、8,614,367)；抑制對(duì)于雄性配子的功能、形成或傳播而言重要的基因產(chǎn)物的形成(參見(jiàn)例如，美國(guó)專(zhuān)利5,859，341、6,297，426)；編碼與另一種基因產(chǎn)物結(jié)合以阻止雄性配子的形成或功能的基因產(chǎn)物(參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利6,162,964、6,013,859、6,281,348、6,399,856、6,248,935、6,750,868、5,792,853)；與對(duì)雄性配子的功能、形成或傳播至關(guān)重要的基因反義，或?qū)е聦?duì)所述基因的共抑制(參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利6，184,439、5,728,926、6，191,343、5,728,558、5,741,684)；通過(guò)使用發(fā)夾式形成物干擾雄性能育性多核苷酸的表達(dá)(參見(jiàn)例如smithetal.(2000)nature407：319-320(smith等人，2000年，《自然》，第407卷，第319-320頁(yè))、wo99/53050和wo98/53083)，等等。雄性配子破壞性多核苷酸包括顯性負(fù)基因，諸如甲基化酶基因和生長(zhǎng)抑制基因。參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利6,399,856。顯性負(fù)基因包括白喉毒素a鏈基因(czakoandan(1991)plantphysiol.95687-692(czako和an，1991年，《植物生理學(xué)》，第95卷，第687-692頁(yè))；greenfieldetal.(1983)pnas80：6853(greenfield等人，1983年，《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》，第80卷，第6853頁(yè)))；細(xì)胞周期分裂突變體，諸如玉米中的cdc(colasantietal.(1991)pnas88：3377-3381(colasanti等人，1991年，《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》，第88卷，第3377-3381頁(yè)))；wt基因(farmeretal.(1994)mol.genet.3：723-728(farmer等人，1994年，《分子遺傳學(xué)》，第3卷，第723-728頁(yè)))；以及p68(chenetal.(1991)pnas88：315-319(chen等人，1991年，《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》，第88卷，第315-319頁(yè)))。雄性配子破壞性多核苷酸的另外的示例包括但不限于來(lái)自菊歐氏菌(erwiniachrysanthermi)的果膠裂解酶基因pele(kennetal(1986)j.bacteriol.168：595(kenn等人，1986年，《細(xì)菌學(xué)雜志》，第168卷，第595頁(yè)))；來(lái)自蘇云金芽孢桿菌(bacillusthuringiensis)以色列亞種的cyta毒素基因(mcleanetal(1987)j.bacteriol.169:1017(1987)(mclean等人，1987年，《細(xì)菌學(xué)雜志》，第169卷，第1017頁(yè))、美國(guó)專(zhuān)利4,918,006)；dna酶、rna酶、蛋白酶或表達(dá)反義rna的多核苷酸。雄性配子破壞性多核苷酸可編碼涉及抑制花粉和柱頭的相互作用、花粉管生長(zhǎng)、受精或它們的組合的蛋白質(zhì)。本文所公開(kāi)的雄性能育性多核苷酸可與本文所公開(kāi)的表達(dá)盒堆疊，所述表達(dá)盒包含可操作地連接至編碼報(bào)道基因或標(biāo)記產(chǎn)物的目的多核苷酸的啟動(dòng)子。本領(lǐng)域已知的合適報(bào)道基因多核苷酸的示例可見(jiàn)于例如以下文獻(xiàn)：jeffersonetal.(1991)inplantmolecularbiologymanual，ed.gelvinetal.(kluweracademicpublishers)，pp.1-33(jefferson等人，1991年，載于《植物分子生物學(xué)手冊(cè)》，gelvin等人編輯，克呂維爾學(xué)術(shù)出版社，第1-33頁(yè))；dewetetal.mol.cell.biol.7：725-737(1987)(dewet等人，1987年，《分子細(xì)胞生物學(xué)》，第7卷，第725-737頁(yè))；goffetal.emboj.9：2517-2522(1990)(goff等人，1990年，《歐洲分子生物學(xué)組織雜志》，第9卷，第2517-2522頁(yè))；kainetal.biotechniques19：650-655(1995)(kain等人，1995年，《生物技術(shù)》，第19卷，第650-655頁(yè))；以及chiuetal.currentbiology6:325-330(1996)(chiu等人，1996年，《當(dāng)代生物學(xué)》，第6卷，第325-330頁(yè))。在某些實(shí)施方案中，目的多核苷酸編碼選擇性報(bào)道基因。這些多核苷酸可包括賦予抗生素抗性或除草劑抗性的多核苷酸。合適的選擇性標(biāo)記多核苷酸的示例包括但不限于編碼對(duì)氯霉素、甲氨蝶呤、潮霉素、鏈霉素、壯觀(guān)霉素、博來(lái)霉素、磺酰胺、溴苯腈、草甘膦和草胺膦的抗性的基因。在一些實(shí)施方案中，本文所公開(kāi)的表達(dá)盒包含編碼可記錄或可篩選標(biāo)記的目的多核苷酸，其中多核苷酸的存在產(chǎn)生可測(cè)量的產(chǎn)物。示例包括β-葡糖苷酸酶或uida基因(gus)，其編碼針對(duì)其的各種顯色底物是已知的酶(例如，美國(guó)專(zhuān)利5,268,463和5,599,670)；氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶和堿性磷酸酶。其它可篩選的標(biāo)記包括花青苷/類(lèi)黃酮多核苷酸，包括例如編碼調(diào)控植物組織中花青苷色素(紅色)的產(chǎn)生的產(chǎn)物的r-基因座多核苷酸，控制類(lèi)黃酮色素的生物合成的基因，諸如玉米c1和c2、b基因、p1基因和bronze基因座基因等。由目的多核苷酸編碼的合適的標(biāo)記的另外的示例包括青色熒光蛋白(cyp)基因、黃色熒光蛋白基因、編碼熒光素酶的發(fā)光基因(其存在可使用例如，x光片、閃爍計(jì)數(shù)、熒光光度法、微光攝像機(jī)、光子計(jì)數(shù)照相機(jī)或多孔發(fā)光測(cè)定法來(lái)檢測(cè))、綠色熒光蛋白(gfp)和dsred2(美國(guó)加利福尼亞州山景城的克隆實(shí)驗(yàn)室公司(clontechlaboratories，inc.，mountainview，california))，其中用標(biāo)記基因轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞發(fā)出紅色熒光，因而可從視覺(jué)上選擇。另外的示例包括編碼其各種顯色底物(例如，padac、顯色頭孢菌素)已知的酶的p-內(nèi)酰胺酶基因、編碼可轉(zhuǎn)化顯色兒茶酚的兒茶酚雙加氧酶的xyle基因和編碼能夠?qū)⒗野彼嵫趸癁槎喟秃投喟王?其繼而縮合以形成易于檢測(cè)的化合物黑素)的酶的酪氨酸酶基因。表達(dá)盒還可包含用于選擇轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的選擇性標(biāo)記基因。選擇性標(biāo)記基因用于選擇經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞或組織。標(biāo)記基因包括編碼抗生素抗性的基因，諸如那些編碼新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶ii(neo)和潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(hpt)的基因，以及賦予對(duì)除草化合物的抗性的基因，所述除草化合物諸如草銨膦、溴苯腈、咪唑啉酮和2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-d)。另外的選擇性標(biāo)記包括表型標(biāo)記諸如β-半乳醣苷酶和熒光蛋白諸如綠色熒光蛋白(gfp)(suetal.(2004)biotechnolbioeng85：610-9(su等人，2004年，《生物技術(shù)和生物工程》，第85卷，第610-619頁(yè))和fetteretal.(2004)plantcell16：215-28(fetter等人，2004年，《植物細(xì)胞》，第16卷，第215-228頁(yè)))、青色熒光蛋白(cyp)(bolteetal.(2004)j.cellscience117：943-54(bolte等人，2004年，《細(xì)胞科學(xué)雜志》，第117卷，第943-954頁(yè))和katoetal.(2002)plantphysiol129：913-42(kato等人，2002年，《植物生理學(xué)》，第129卷，第913-942頁(yè)))和黃色熒光蛋白(來(lái)自evrogen公司的phiyfptm，參見(jiàn)bolteetal.(2004)j.cellscience117：943-54(bolte等人，2004年，《細(xì)胞科學(xué)雜志》，第117卷，第943-954頁(yè)))。對(duì)于另外的選擇性標(biāo)記，通常參見(jiàn)yarranton(1992)curr.opin.biotech.3：506-511(yarranton，1992年，《生物技術(shù)新見(jiàn)》，第3卷，第506-511頁(yè))；christophersonetal.(1992)proc.natl.acad.sci.usa89：6314-6318(christopherson等人，1992年，《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》，第89卷，第6314-6318頁(yè))；yaoetal.(1992)cell71：63-72(yao等人，1992年，《細(xì)胞》，第71卷，第63-72頁(yè))；reznikoff(1992)mol.microbiol.6：2419-2422(reznikoff，1992年，《分子微生物學(xué)》，第6卷，第2419-2422頁(yè))；barkleyetal.(1980)intheoperon，pp.177-220(barkley等人，1980年，載于《操縱子》，第177-220頁(yè))；huetal.(1987)cell48：555-566(hu等人，1987年，《細(xì)胞》，第48卷，第555-566頁(yè))；brownetal.(1987)cell49：603-612(brown等人，1987年，《細(xì)胞》，第49卷，第603-612頁(yè))；figgeetal.(1988)cell52：713-722(figge等人，1988年，《細(xì)胞》，第52卷，第713-722頁(yè))；deuschleetal.(1989)proc.natl.acad.aci.usa86：5400-5404(deuschle等人，1989年，《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》，第86卷，第5400-5404頁(yè))；fuerstetal.(1989)proc.natl.acad.sci.usa86：2549-2553(fuerst等人，1989年，《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》，第86卷，第2549-2553頁(yè))；deuschleetal.(1990)science248：480-483(deuschle等人，1990年，《科學(xué)》，第248卷，第480-483頁(yè))；gossen(1993)ph.d.thesis，universityofheidelberg(gossen，1993年，德國(guó)海德?tīng)柋ご髮W(xué)博士論文)；reinesetal.(1993)proc.natl.acad.sci.usa90：1917-1921(reines等人，1993年，《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》，第90卷，第1917-1921頁(yè))；labowetal.(1990)mol.cell.biol.10：3343-3356(labow等人，1990年，《分子細(xì)胞生物學(xué)》，第10卷，第3343-3356頁(yè))；zambrettietal.(1992)proc.natl.acad.sci.usa89：3952-3956(zambretti等人，1992年，《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》，第89卷，第3952-3956頁(yè))；baimetal.(1991)proc.natl.acad.sci.usa88：5072-5076(baim等人，1991年，《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》，第88卷，第5072-5076頁(yè))；wyborskietal.(1991)nucleicacidsres.19：4647-4653(wyborski等人，1991年，《核酸研究》，第19卷，第4647-4653頁(yè))；hillenand-wissman(1989)topicsmol.struc.biol.10：143-162(hillenand-wissman，1989年，《分子結(jié)構(gòu)生物學(xué)主題》，第10卷，第143-162頁(yè))；degenkolbetal.(1991)antimicrob.agentschemother.35：1591-1595(degenkolb等人，1991年，《抗微生物劑和化學(xué)治療》，第35卷，第1591-1595頁(yè))；kleinschnidtetal.(1988)biochemistry27：1094-1104(kleinschnidt等人，1988年，《生物化學(xué)》，第27卷，第1094-1104頁(yè))；bonin(1993)ph.d.thesis，universityofheidelberg(bonin，1993年，德國(guó)海德?tīng)柋ご髮W(xué)博士論文)；gossenetal.(1992)proc.natl.acad.sci.usa89：5547-5551(gossen等人，1992年，《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》，第89卷，第5547-5551頁(yè))；olivaetal.(1992)antimicrob.agentschemother.36：913-919(oliva等人，1992年，《抗微生物劑和化學(xué)治療》，第36卷，第913-919頁(yè))；hlavkaetal.(1985)handbookofexperimentalpharmacology，vol.78(springer-verlag，berlin)(hlavka等人，1985年，《實(shí)驗(yàn)藥理學(xué)手冊(cè)》，第78卷，柏林斯普林格出版社)；gilletal.(1988)nature334：721-724(gill等人，1988年，《自然》，第334卷，第721-724頁(yè))。這些公開(kāi)內(nèi)容以引用的方式并入本文。以上選擇性標(biāo)記基因的列表并不意指是限制性的。任何選擇性標(biāo)記基因均可用于本文所公開(kāi)的組合物和方法中。在一些實(shí)施方案中，本文所公開(kāi)的表達(dá)盒包含編碼可操作地連接至第一啟動(dòng)子多核苷酸的雄性能育性多核苷酸的第一目的多核苷酸，該第一目的多核苷酸與編碼可操作地連接至雄性組織優(yōu)選的啟動(dòng)子多核苷酸的雄性配子破壞性基因產(chǎn)物的第二目的多核苷酸堆疊。在某些實(shí)施方案中，本文所述的表達(dá)盒還可與編碼可操作地連接至啟動(dòng)子多核苷酸的標(biāo)記多核苷酸的第三目的多核苷酸堆疊。在特定實(shí)施方案中，本文所公開(kāi)的表達(dá)盒包含編碼本文所公開(kāi)的可操作地連接至組成型啟動(dòng)子(諸如花椰菜花葉病毒(camv)35s啟動(dòng)子)的雄性能育性基因(諸如小麥或大麥ms1)的第一目的多核苷酸。表達(dá)盒還可包含編碼可操作地連接至雄性組織優(yōu)選的啟動(dòng)子的雄性配子破壞性基因產(chǎn)物的第二目的多核苷酸。在某些實(shí)施方案中，本文所公開(kāi)的表達(dá)盒還可以包含編碼可操作地連接至組成型啟動(dòng)子(諸如花椰菜花葉病毒(camv)35s啟動(dòng)子)的標(biāo)記基因(諸如來(lái)自產(chǎn)綠色鏈霉菌(streptomycesviridochomagenes)的草胺膦乙酰轉(zhuǎn)移酶(pat)基因)的第三目的多核苷酸。iv.植物a.具有改變的雄性能育性多肽水平/活性的植物還提供了具有改變的雄性能育性多肽水平和/或活性和/或改變的雄性能育性水平的植物。在一些實(shí)施方案中，本文所公開(kāi)的植物已在它們的基因組中穩(wěn)定地?fù)饺肓巳绫疚乃_(kāi)的異源雄性能育性多核苷酸或其活性片段或變體。因此，提供了這樣的植物、植物細(xì)胞、植物部分和種子，它們包含seqidno：1、2、4、7、42、43、44或45中任一者示出的至少一種異源雄性能育性多核苷酸，或者它們的任何活性片段或變體。還提供了包含本文所公開(kāi)的表達(dá)盒的植物，該表達(dá)盒包含可操作地連接至在植物中有活性的啟動(dòng)子的雄性能育性多核苷酸。在一些實(shí)施方案中，雄性能育性多核苷酸的表達(dá)調(diào)節(jié)植物的雄性能育性。在某些實(shí)施方案中，雄性能育性多核苷酸的表達(dá)增強(qiáng)植物的雄性能育性。例如，提供了包含這樣的表達(dá)盒的植物，該表達(dá)盒包含可操作地連接至組成型啟動(dòng)子(諸如camv35s啟動(dòng)子)的seqidno：1、2、4、7、42、43、44或45示出的ms1多核苷酸，或者它們的活性片段或變體。在ms1多核苷酸表達(dá)時(shí)，植物的雄性能育性增強(qiáng)。在某些實(shí)施方案中，向雄性不育植物提供表達(dá)盒，該表達(dá)盒包含本文所公開(kāi)的可操作地連接至在植物中有活性的啟動(dòng)子的異源雄性能育性多核苷酸或者其活性片段或變體。在異源雄性能育性多核苷酸表達(dá)時(shí)，賦予雄性能育性；這可被稱(chēng)為恢復(fù)植物的雄性能育性。在特定實(shí)施方案中，本文所公開(kāi)的植物包含具有如本文所公開(kāi)的可操作地連接至啟動(dòng)子的異源雄性能育性多核苷酸、或其活性片段或變體的表達(dá)盒，該表達(dá)盒與包含可操作地連接至在植物中有活性的啟動(dòng)子的目的多核苷酸的一個(gè)或多個(gè)表達(dá)盒堆疊。例如，堆疊的目的多核苷酸可包括雄性配子破壞性多核苷酸和/或標(biāo)記多核苷酸。本文所公開(kāi)的植物還可以包含本文所述的具有至少兩種多核苷酸的堆疊表達(dá)盒，使得所述至少兩種多核苷酸在超過(guò)50％的減數(shù)分裂中(即，不是隨機(jī)地)被一起遺傳。因此，當(dāng)包含具有兩種多核苷酸的堆疊表達(dá)盒的植物或植物細(xì)胞發(fā)生減數(shù)分裂時(shí)，所述兩種多核苷酸分離到同一個(gè)子代(子系)細(xì)胞中。這樣，堆疊的多核苷酸將很可能在它們被呈遞至的任何細(xì)胞中一起表達(dá)。例如，植物可包含具有雄性能育性多核苷酸的表達(dá)盒，該表達(dá)盒與包含雄性配子破壞性多核苷酸的表達(dá)盒堆疊，使得雄性能育性多核苷酸和雄性配子破壞性多核苷酸被一起遺傳。具體地講，雄性不育植物可包含具有本文所公開(kāi)的可操作地連接至組成型啟動(dòng)子的雄性能育性多核苷酸的表達(dá)盒，該表達(dá)盒與包含可操作地連接至雄性組織優(yōu)選啟動(dòng)子的雄性配子破壞性多核苷酸的表達(dá)盒堆疊，使得所述植物產(chǎn)生成熟的花粉粒。然而，在這種植物中，包含雄性能育性多核苷酸的花粉的發(fā)育將被雄性配子破壞性多核苷酸的表達(dá)抑制。b.植物和引入方法如本文所用，術(shù)語(yǔ)“植物”包括植物細(xì)胞、植物原生質(zhì)體、從中可再生出植物的植物細(xì)胞組織培養(yǎng)物、植物愈傷組織、在植物或植物部分中完好的植物塊和植物細(xì)胞如胚、花粉、胚珠、種子、葉、花、枝、果實(shí)、仁、穗、穗軸、殼、莖、根、根尖、花粉囊、谷粒等。如本文所用，所謂“谷?！币庵干虡I(yè)種植者出于栽培或繁殖物種以外的目的生產(chǎn)的成熟種子。再生植物的子代、變體和突變體也包括在本公開(kāi)的范圍內(nèi)，前提條件是這些部分包含所引入的核酸序列。本文所公開(kāi)的方法包括將多肽或多核苷酸引入植物細(xì)胞中?！耙搿敝荚谝庵敢允沟枚嗪塑账峄蚨嚯牡男蛄械靡赃M(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部的方式將多核苷酸或多肽呈遞到植物。本文所公開(kāi)的方法不依賴(lài)于將序列引入宿主細(xì)胞中的具體方法，只要多核苷酸或多肽進(jìn)入宿主的至少一個(gè)細(xì)胞的內(nèi)部即可。用于將多核苷酸或多肽引入宿主細(xì)胞(即，植物細(xì)胞)中的方法是本領(lǐng)域已知的，包括但不限于穩(wěn)定轉(zhuǎn)化方法、瞬時(shí)轉(zhuǎn)化方法和病毒介導(dǎo)的方法。“穩(wěn)定轉(zhuǎn)化”旨在意指被引入宿主(即，植物)中的核苷酸構(gòu)建體整合進(jìn)植物的基因組中，并能夠由其子代遺傳?！八矔r(shí)轉(zhuǎn)化”旨在意指將多核苷酸或多肽引入宿主(即，植物)中并進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)。轉(zhuǎn)化規(guī)程以及用于將多肽或多核苷酸序列引入植物中的規(guī)程，可根據(jù)要進(jìn)行轉(zhuǎn)化的植物或植物細(xì)胞的類(lèi)型(例如，單子葉植物或雙子葉植物)而異。將多肽和多核苷酸引入植物細(xì)胞中的合適方法包括微注射(crosswayetal.(1986)biotechniques4：320-334(crossway等人，1986年，《生物技術(shù)》，第4卷，第320-334頁(yè)))、電穿孔(riggsetal.(1986)proc.natl.acad.sci.usa83：5602-5606(riggs等人，1986年，《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》，第83卷，第5602-5606頁(yè)))、農(nóng)桿菌(agrobacterium)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化(townsend等人，美國(guó)專(zhuān)利5,563,055；zhao等人，美國(guó)專(zhuān)利5,981,840)、直接基因轉(zhuǎn)移(paszkowskietal.(1984)emboj.3：2717-2722(paszkowski等人，1984年，《歐洲分子生物學(xué)組織雜志》，第3卷，第2717-2722頁(yè)))和彈道粒子加速(參見(jiàn)例如sanford等人，美國(guó)專(zhuān)利4,945,050；tomes等人，美國(guó)專(zhuān)利5,879,918；tomes等人，美國(guó)專(zhuān)利5,886,244；bidney等人，美國(guó)專(zhuān)利5,932,782；tomesetal.(1995)″directdnatransferintointactplantcellsviamicroprojectilebombardment，″inplantcell，tissue，andorganculture：fundamentalmethods，ed.gamborgandphillips(springer-verlag，berlin)(tomes等人，1995年，“通過(guò)微粒轟擊直接將dna轉(zhuǎn)移進(jìn)完整植物細(xì)胞中”，載于《植物細(xì)胞、組織和器官培養(yǎng)：基本方法》，gamborg和phillips編輯，柏林施普林格出版社)；mccabeetal.(1988)biotechnology6：923-926(mccabe等人，1988年，《生物技術(shù)》，第6卷，第923-926頁(yè)))；以及l(fā)ec1轉(zhuǎn)化(wo00/28058)。還可參見(jiàn)weissingeretal.(1988)ann.rev.genet.22：421-477(weissinger等人，1988年，《遺傳學(xué)年評(píng)》，第22卷，第421-477頁(yè))；sanfordetal.(1987)particulatescienceandtechnology5：27-37(sanford等人，1987年，《顆?？茖W(xué)與技術(shù)》，第5卷，第27-37頁(yè))(洋蔥)；christouetal.(1988)plantphysiol.87：671-674(christou等人，1988年，《植物生理學(xué)》，第87卷，第671-674頁(yè))(大豆)；mccabeetal.(1988)bio/technology6:923-926(mccabe等人，1988年，《生物技術(shù)》，第6卷，第923-926頁(yè))(大豆)；finerandmcmullen(1991)invitrocelldev.biol.27p：175-182(finer和mcmullen，1991年，《體外細(xì)胞發(fā)育生物學(xué)》，第27p卷，第175-182頁(yè))(大豆)；singhetal.(1998)theor.appl.genet.96：319-324(singh等人，1998年，《理論與應(yīng)用遺傳學(xué)》，第96卷，第319-324頁(yè))(大豆)；dattaetal.(1990)biotechnology8：736-740(datta等人，1990年，《生物技術(shù)》，第8卷，第736-740頁(yè))(稻)；kleinetal.(1988)proc.natl.acad.sci.usa85：4305-4309(klein等人，1988年，《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》，第85卷，第4305-4309頁(yè))(玉米)；kleinetal.(1988)biotechnology6：559-563(klein等人，1988年，《生物技術(shù)》，第6卷，第559-563頁(yè))(玉米)；tomes，美國(guó)專(zhuān)利5,240,855；buising等人，美國(guó)專(zhuān)利5,322,783和5,324,646；tomesetal.(1995)″directdnatransferintointactplantcellsviamicroprojectilebombardment，″inplantcell，tissue，andorganculture：fundamentalmethods，ed.gamborg(springer-verlag，berlin)(tomes等人，1995年，“通過(guò)微粒轟擊直接將dna轉(zhuǎn)移到完整植物細(xì)胞中”，載于《植物細(xì)胞、組織和器官培養(yǎng)：基本方法》，gamborg編輯，柏林施普林格出版社)(玉米)；kleinetal.(1988)plantphysiol.91：440-444(klein等人，1988年，《植物生理學(xué)》，第91卷，第440-444頁(yè))(玉米)；frommetal.(1990)biotechnology8：833-839(fromm等人，1990年，《生物技術(shù)》，第8卷，第833-839頁(yè))(玉米)；hooykaas-vanslogterenetal.(1984)nature(london)311：763-764(hooykaas-vanslogteren等人，1984年，《自然》(倫敦)，第311卷，第763-764頁(yè))；bowen等人，美國(guó)專(zhuān)利5,736,369(谷類(lèi))；bytebieretal.(1987)proc.natl.acad.sci.usa84：5345-5349(bytebier等人，1987年，《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》，第84卷，第5345-5349頁(yè))(百合科)；dewetetal.(1985)intheexperimentalmanipulationofovuletissues，ed.chapmanetal.(longman，newyork)，pp.197-209(dewet等人，1985年，載于《胚珠組織的實(shí)驗(yàn)操縱》，chapman等人編輯，紐約朗文出版社，第197-209頁(yè))(花粉)；kaeppleretal.(1990)plantcellreports9：415-418(kaeppler等人，1990年，《植物細(xì)胞報(bào)告》，第9卷，第415-418頁(yè))和kaeppleretal.(1992)theor.appl.genet.84：560-566(kaeppler等人，1992年，《理論與應(yīng)用遺傳學(xué)》，第84卷，第560-566頁(yè))(頸須介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化)；d′halluinetal.(1992)plantcell4：1495-1505(d′halluin等人，1992年，《植物細(xì)胞》，第4卷，第1495-1505頁(yè))(電穿孔)；lietal.(1993)plantcellreports12：250-255(li等人，1993年，《植物細(xì)胞報(bào)告》，第12卷，第250-255頁(yè))和christouandford(1995)annalsofbotany75：407-413(christou和ford，1995年，《植物學(xué)年鑒》，第75卷，第407-413頁(yè))(稻)；osjodaetal.(1996)naturebiotechnology14：745-750(osjoda等人，1996年，《自然生物技術(shù)》，第14卷，第745-750頁(yè))(玉米，通過(guò)根瘤農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化)；以上所有文獻(xiàn)以引用方式并入本文。在具體的實(shí)施方案中，可使用多種瞬時(shí)轉(zhuǎn)化方法為植物提供本文所公開(kāi)的雄性能育性多核苷酸或表達(dá)盒。這種瞬時(shí)轉(zhuǎn)化方法包括但不限于直接向植物中引入雄性能育性多肽或其變體和片段，或者向植物中引入雄性能育性轉(zhuǎn)錄物。這類(lèi)方法包括例如顯微注射法或粒子轟擊法。參見(jiàn)例如crosswayetal.(1986)molgen.genet.202：179-185(crossway等人，1986年，《分子遺傳學(xué)與普通遺傳學(xué)》，第202卷，第179-185頁(yè))；nomuraetal.(1986)plantsci.44：53-58(nomura等人，1986年，《植物科學(xué)》，第44卷，第53-58頁(yè))；hepleretal.(1994)proc.natl.acad.sci.91：2176-2180(hepler等人，1994年，《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》，第91卷，第2176-2180頁(yè))以及hushetal.(1994)thejournalofcellscience107：775-784(hush等人，1994年，《細(xì)胞科學(xué)雜志》，第107卷，第775-784頁(yè))，以上所有文獻(xiàn)以引用方式并入本文?；蛘?，可使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)將本文所公開(kāi)的雄性能育性多核苷酸或表達(dá)盒瞬時(shí)轉(zhuǎn)化到植物中。此類(lèi)技術(shù)包括利用病毒載體系統(tǒng)，和將多核苷酸以避免dna隨后釋放的方式沉淀。因此，雖然仍可能從粒子結(jié)合的dna開(kāi)始轉(zhuǎn)錄，但這種dna釋放繼而整合到基因組中的頻率會(huì)大大降低。此類(lèi)方法包括使用包被有聚乙基亞胺(pei，sigma#p3143)的粒子。在其它實(shí)施方案中，通過(guò)使植物與病毒或病毒核酸接觸，可將本文所公開(kāi)的雄性能育性多核苷酸或表達(dá)盒引入植物中。一般來(lái)講，此類(lèi)方法涉及將本文所公開(kāi)的核苷酸構(gòu)建體摻入在病毒dna或rna分子內(nèi)。應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，本文所公開(kāi)的雄性能育性序列可最初作為病毒聚蛋白的一部分來(lái)合成，其隨后可通過(guò)體內(nèi)或體外蛋白水解進(jìn)行加工，由此產(chǎn)生所需的重組蛋白。涉及病毒dna或rna分子的用于將多核苷酸引入植物中并表達(dá)其中所編碼的蛋白質(zhì)的方法是本領(lǐng)域已知的。參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利5,889,191、5,889,190、5,866,785、5,589,367、5,316,931，以及portaetal.(1996)molecularbiotechnology5：209-221(porta等人，1996年，《分子生物技術(shù)》，第5卷，第209-221頁(yè))；以上文獻(xiàn)以引用方式并入本文。用于在植物基因組中特定位置處靶向插入多核苷酸的方法是本領(lǐng)域已知的。在一個(gè)實(shí)施方案中，在期望的基因組位置插入多核苷酸是使用位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)的。參見(jiàn)例如wo99/25821、wo99/25854、wo99/25840、wo99/25855和wo99/25853，這些專(zhuān)利全部以引用方式并入本文。簡(jiǎn)而言之，本文所公開(kāi)的多核苷酸可包含在旁側(cè)分布有兩個(gè)不相同的重組位點(diǎn)的轉(zhuǎn)移盒中。將轉(zhuǎn)移盒引入在其基因組中穩(wěn)定摻入這樣的靶標(biāo)位點(diǎn)的植物中，該靶標(biāo)位點(diǎn)在旁側(cè)分布有與該轉(zhuǎn)移盒的所述位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的兩個(gè)不相同的重組位點(diǎn)。提供適當(dāng)?shù)闹亟M酶，并且將轉(zhuǎn)移盒整合在該靶標(biāo)位點(diǎn)處。目的多核苷酸因此被整合在植物基因組中的特定染色體位置處?？梢罁?jù)常規(guī)方式將已轉(zhuǎn)化的細(xì)胞培育成植株。參見(jiàn)例如mccormicketal.(1986)plantcellreports5：81-84(mccormick等人，1986年，《植物細(xì)胞報(bào)告》，第5卷，第81-84頁(yè))。然后可用相同的轉(zhuǎn)化植株或不同的植株對(duì)這些植物進(jìn)行授粉，并且所得的子代具有所鑒定的所需表型特征的所需表達(dá)。可以培育兩代或更多世代，以確保所需表型特征的表達(dá)得到穩(wěn)定保持和遺傳，然后收獲種子，以確保已實(shí)現(xiàn)所需表型特征的表達(dá)。以此方式，本公開(kāi)提供在其基因組中穩(wěn)定摻入了本文所公開(kāi)的雄性能育性多核苷酸(例如本文所公開(kāi)的表達(dá)盒)的轉(zhuǎn)化種子(也稱(chēng)為“轉(zhuǎn)基因種子”)。術(shù)語(yǔ)“靶位點(diǎn)”、“靶序列”、“靶dna”、“靶基因座”、“基因組靶位點(diǎn)”、“基因組靶序列”、和“基因組靶基因座”在本文中可互換使用，并且是指在細(xì)胞基因組(包括葉綠體和線(xiàn)粒體dna)中誘導(dǎo)雙鏈斷裂的位置處的細(xì)胞的基因組中的多核苷酸序列。靶位點(diǎn)可以是細(xì)胞或生物體的基因組中的內(nèi)源位點(diǎn)，或者靶位點(diǎn)對(duì)于細(xì)胞或生物體可以是異源的，因而并非天然存在于基因組中，或者與在自然界中存在的位置相比，靶位點(diǎn)可在異源基因組位置中存在。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“內(nèi)源靶序列”和“天然靶序列”在本文中可互換使用，是指對(duì)于細(xì)胞或生物體的基因組是內(nèi)源的或天然的并且在細(xì)胞或生物體的基因組中位于該靶序列的內(nèi)源或天然位置的靶序列。細(xì)胞包括植物細(xì)胞以及通過(guò)本文所述的方法產(chǎn)生的植物和種子。在一個(gè)實(shí)施方案中，與正在使用的特定基因編輯系統(tǒng)相關(guān)的靶位點(diǎn)可與通過(guò)雙鏈斷裂誘導(dǎo)劑特異性識(shí)別和/或結(jié)合的dna識(shí)別位點(diǎn)或靶位點(diǎn)相似，所述雙鏈斷裂誘導(dǎo)劑為諸如但不限于鋅指內(nèi)切核酸酶、大范圍核酸酶、talen內(nèi)切核酸酶、crispr-cas向?qū)na或其它多核苷酸指導(dǎo)的雙鏈斷裂試劑。術(shù)語(yǔ)“人工靶位點(diǎn)”和“人工靶序列”在本文中可互換使用，是指已經(jīng)引入細(xì)胞或生物體的基因組中的靶序列。這種人工靶序列可在序列上與細(xì)胞基因組中的內(nèi)源或天然靶序列相同，但可位于細(xì)胞或生物體的基因組中的不同位置(即，非內(nèi)源或非天然位置)。術(shù)語(yǔ)“改變的靶位點(diǎn)”、“改變的靶序列”、“修飾的靶位點(diǎn)”和“修飾的靶序列”在本文中可互換使用，是指與未改變的靶序列相比包括至少一個(gè)改變的如本文所公開(kāi)的靶序列。這種“改變”包括，例如：(i)替換至少一個(gè)核苷酸，(ii)缺失至少一個(gè)核苷酸，(iii)插入至少一個(gè)核苷酸，或者(iv)(i)-(iii)的任何組合。例如，已經(jīng)證實(shí)msld、msle、mslf或mslh的點(diǎn)突變導(dǎo)致雄性不育；類(lèi)似的突變可定向發(fā)生在ms1的外顯子內(nèi)，以提供導(dǎo)致雄性不育的替代等位基因。此外，可組合使用多個(gè)突變。某些實(shí)施方案包括使用內(nèi)切核酸酶修飾的本文所公開(kāi)的多核苷酸。內(nèi)切核酸酶是裂解多核苷酸鏈內(nèi)的磷酸二酯鍵的酶，并且包括在特定位點(diǎn)裂解dna而不損傷堿基的限制性?xún)?nèi)切核酸酶。限制性?xún)?nèi)切核酸酶包括i型、ii型、iii型和iv型內(nèi)切核酸酶，它們進(jìn)一步包括亞型。在i型和iii型系統(tǒng)中，甲基化酶活性和限制酶活性?xún)烧叨及趩我粡?fù)合物中。內(nèi)切核酸酶還包括大范圍核酸酶，也稱(chēng)為歸巢內(nèi)切核酸酶(hease)。與限制性?xún)?nèi)切核酸酶類(lèi)似，hease在特異性識(shí)別位點(diǎn)結(jié)合和切割。但大范圍核酸酶的識(shí)別位點(diǎn)通常更長(zhǎng)，約為18bp或更長(zhǎng)。(參見(jiàn)2012年3月22日提交的專(zhuān)利公開(kāi)wo2012/129373)?；诒Ｊ匦蛄谢?，已經(jīng)將大范圍核酸酶分類(lèi)為四個(gè)家族(belfortm，andperlmanpsj.biol.chem.1995；270：30237-30240(belfortm和perlmanps，《生物化學(xué)雜志》，1995年，第270卷，第30237-30240頁(yè)))。這些基序參與金屬離子的配位和磷酸二酯鍵的水解。hease的顯著之處在于它們的識(shí)別位點(diǎn)長(zhǎng)，并且能容忍它們的dna底物中有一定的序列多態(tài)性。大范圍核酸酶的命名規(guī)范與其它限制性?xún)?nèi)切核酸酶的規(guī)范相似。對(duì)于分別由自立式(free-standing)orf、內(nèi)含子和內(nèi)含肽編碼的大范圍核酸酶，它們還通過(guò)前綴f-、i-或者pi-進(jìn)行表征。重組過(guò)程中的一個(gè)步驟涉及在識(shí)別位點(diǎn)之處或者附近進(jìn)行多核苷酸裂解。該裂解活性可用于產(chǎn)生雙鏈斷裂。有關(guān)位點(diǎn)特異性重組酶及其識(shí)別位點(diǎn)的綜述，參見(jiàn)sauer(1994)curr.op.biotechnol.5：521-7(sauer等人，1994年，《生物技術(shù)當(dāng)前述評(píng)》，第5卷，第521-527頁(yè))；以及sadowski(1993)faseb7：760-7(sadowski，1993年，《美國(guó)實(shí)驗(yàn)生物學(xué)學(xué)會(huì)聯(lián)合會(huì)》，第7卷，第760-767頁(yè))。在一些示例中，重組酶來(lái)自整合酶或者解離酶家族。tal效應(yīng)子核酸酶是一類(lèi)序列特異性核酸酶，可用于在植物或者其它生物體的基因組中的特定靶序列處產(chǎn)生雙鏈斷裂(milleretal.(2011)naturebiotechnology29：143-148(miller等人，2011年，《自然生物技術(shù)》，第29卷，第143-148頁(yè)))。鋅指核酸酶(zfn)是工程改造的雙鏈斷裂誘導(dǎo)劑，由鋅指dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域和雙鏈斷裂誘導(dǎo)劑結(jié)構(gòu)域構(gòu)成。識(shí)別位點(diǎn)特異性由鋅指結(jié)構(gòu)域賦予，鋅指結(jié)構(gòu)域通常包含兩個(gè)、三個(gè)或者四個(gè)例如具有c2h2結(jié)構(gòu)的鋅指；但是其它鋅指結(jié)構(gòu)也是已知的并已被工程化。鋅指結(jié)構(gòu)域易于設(shè)計(jì)特異性結(jié)合選定的多核苷酸識(shí)別序列的多肽。zfn包括連接到非特異性?xún)?nèi)切核酸酶結(jié)構(gòu)域的工程改造的dna結(jié)合鋅指結(jié)構(gòu)域，所述非特異性?xún)?nèi)切核酸酶結(jié)構(gòu)域例如來(lái)自ii型內(nèi)切核酸酶(諸如foki)的核酸酶結(jié)構(gòu)域?？蓪⒘硗獾墓δ苄匀诤系戒\指結(jié)合結(jié)構(gòu)域，包括轉(zhuǎn)錄激活因子結(jié)構(gòu)域、轉(zhuǎn)錄阻遏蛋白結(jié)構(gòu)域和甲基化酶。在一些示例中，核酸酶結(jié)構(gòu)域的二聚化為裂解活性所需。每個(gè)鋅指識(shí)別靶dna中的三個(gè)連續(xù)堿基對(duì)。例如，一個(gè)3鋅指結(jié)構(gòu)域識(shí)別9個(gè)連續(xù)核苷酸的序列；由于該核酸酶要求二聚化，使用兩組鋅指三聯(lián)體來(lái)結(jié)合一條18個(gè)核苷酸的識(shí)別序列。crispr基因座(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats，規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù)序列)(也稱(chēng)spidr——spacerintersperseddirectrepeats，間隔區(qū)散在同向重復(fù)序列)構(gòu)成最近描述的dna基因座的家族。crispr基因座由短且高度保守的dna重復(fù)序列(通常24bp至40bp，重復(fù)1至140次，也稱(chēng)crispr重復(fù)序列)組成，所述dna重復(fù)序列是部分回文的。重復(fù)的序列(通常是物種特異性的)被恒定長(zhǎng)度的可變序列(通常20至58，取決于crispr基因座(2007年3月1日公布的wo2007/025097))間隔。crispr基因座首先在大腸桿菌中識(shí)別(ishinoetal.(1987)j.bacterial.169：5429-5433(ishino等人，1987年，《細(xì)菌學(xué)雜志》，第169卷，第5429-5433頁(yè))；nakataetal.(1989)j.bacterial.171：3553-3556(nakata等人，1989年，《細(xì)菌學(xué)雜志》，第171卷，第3553-3556頁(yè)))。在地中海富鹽菌(haloferaxmediterranei)、釀膿鏈球菌(streptococcuspyogenes)、魚(yú)腥藻屬(anabaena)和肺結(jié)核分枝桿菌(mycobacteriumtuberculosis)中已鑒定出類(lèi)似的散在短序列重復(fù)序列(groenenetal.(1993)mol.microbiol.10：1057-1065(groenen等人，1993年，《分子微生物學(xué)》，第10卷，第1057-1065頁(yè))；hoeetal.(1999)emerg.infect.dis.5：254-263(hoe等人，1999年，《新興傳染病》，第5卷，第254-263頁(yè))；masepohletal.(1996)biochim.biophys.acta1307：26-30(masepohl等人，1996年，《生物化學(xué)與生物物理學(xué)學(xué)報(bào)》，第1307卷，第26-30頁(yè))；mojicaetal.(1995)mol.microbiol.17：85-93(mojica等人，1995年，《分子微生物學(xué)》，第17卷，第85-93頁(yè)))。crispr基因座與其它ssr不同之處在于重復(fù)序列的結(jié)構(gòu)，該重復(fù)序列也被命名為短規(guī)則間隔重復(fù)序列(srsr)(janssenetal.(2002)omicsj.integ.biol.6：23-33(janssen等人，2002年，《0mics：整合生物學(xué)雜志》，第6卷，第23-33頁(yè))；mojicaetal.(2000)mol.microbiol.36：244-246(mojica等人，2000年，《分子微生物學(xué)》，第36卷，第244-246頁(yè)))。重復(fù)序列是成簇出現(xiàn)的短元件，其通常被恒定長(zhǎng)度的可變序列規(guī)則地間隔(mojicaetal.(2000)mol.microbiol.36：244-246(mojica等人，2000年，《分子微生物學(xué)》，第36卷，第244-246頁(yè)))。cas基因是指通常與側(cè)翼crispr基因座偶聯(lián)、相關(guān)或接近或在側(cè)翼crispr基因座附近的基因。術(shù)語(yǔ)“cas基因”、“crispr相關(guān)(cas)基因”在本文中可互換使用。cas蛋白家族的綜述在haftetal.(2005)computationalbiology，ploscomputbiol1(6)：e60.doi：10.1371/journal.pcbi.0010060(haft等人，2005年，“計(jì)算生物學(xué)”，《數(shù)學(xué)與計(jì)算生物學(xué)》，第1卷，第6期，第e60頁(yè)，doi：10.1371/journal.pcbi.0010060)中呈現(xiàn)。如該文獻(xiàn)中所描述，除了四個(gè)之前已知的基因家族外，還描述了41個(gè)crispr相關(guān)(cas)基因家族。該文獻(xiàn)表明，crispr系統(tǒng)屬于不同的類(lèi)別，具有不同的重復(fù)序列模式、不同組的基因以及不同物種范圍。給定的crispr基因座中的cas基因的數(shù)目可隨物種而不同。cas內(nèi)切核酸酶涉及由cas基因編碼的cas蛋白，其中所述cas蛋白能夠?qū)㈦p鏈斷裂引入dna靶序列中。cas內(nèi)切核酸酶由向?qū)Ф嗪塑账釋?dǎo)向以在特定靶位點(diǎn)處識(shí)別并任選地將雙鏈斷裂引入細(xì)胞基因組中(提交于2014年7月11日的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)62/023239)。向?qū)Ф嗪塑账?cas內(nèi)切核酸酶系統(tǒng)包括cas內(nèi)切核酸酶和能夠?qū)㈦p鏈斷裂引入dna靶序列中的向?qū)Ф嗪塑账岬膹?fù)合物。cas內(nèi)切核酸酶解開(kāi)基因組靶位點(diǎn)附近的dna雙鏈體，如果正確的前間區(qū)序列鄰近基序(pam)大致定向在靶序列的3′端，那么在向?qū)na識(shí)別靶序列后，該cas內(nèi)切核酸酶裂解兩條dna鏈。cas內(nèi)切核酸酶基因可以是cas9內(nèi)切核酸酶或其功能片段，諸如但不限于2007年3月1日公布的wo2007/025097中的seqidno：462、474、489、494、499、505和518所列的cas9基因。cas內(nèi)切核酸酶基因可以是植物、玉米或大豆優(yōu)化的cas9內(nèi)切核酸酶，諸如但不限于植物密碼子優(yōu)化的釀膿鏈球菌(streptococcuspyogenes)cas9基因，其可識(shí)別n(12-30)ngg形式的任何基因組序列。cas內(nèi)切核酸酶可通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何方法直接引入細(xì)胞中，所述方法例如但不限于瞬時(shí)引入法、轉(zhuǎn)染和/或局部施用。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“向?qū)na”是指crrna(crisprrna)(其包含可變靶向結(jié)構(gòu)域)和tracrrna這兩種rna分子的合成融合體。在一個(gè)實(shí)施方案中，向?qū)na包含12至30個(gè)核苷酸序列的可變靶向結(jié)構(gòu)域和可與cas內(nèi)切核酸酶相互作用的rna片段。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“向?qū)Ф嗪塑账帷笔侵缚膳ccas內(nèi)切核酸酶形成復(fù)合物并且使cas內(nèi)切核酸酶能夠識(shí)別并任選地裂解dna靶位點(diǎn)的多核苷酸序列(2014年7月11日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)62/023239)。向?qū)Ф嗪塑账峥梢允菃畏肿踊螂p分子。向?qū)Ф嗪塑账嵝蛄锌梢允莚na序列、dna序列或它們的組合(rna-dna組合序列)。任選地，向?qū)Ф嗪塑账峥砂辽僖粋€(gè)核苷酸、磷酸二酯鍵或連接修飾，諸如但不限于鎖核酸(lna)、5-甲基脫氧胞嘧啶、2，6-二氨基嘌呤、2′-氟腺嘌呤、2′-氟尿嘧啶、2′-o-甲基rna、硫代磷酸酯鍵、與膽固醇分子的連接、與聚乙二醇分子的連接、與間隔區(qū)18(六乙二醇鏈)分子的連接或者導(dǎo)致環(huán)化的5′至3′共價(jià)連接。僅包含核糖核酸的向?qū)Ф嗪塑账嵋脖环Q(chēng)為“向?qū)na”。向?qū)Ф嗪塑账峥梢允请p分子(也稱(chēng)為雙鏈體向?qū)Ф嗪塑账?，其包含與靶dna中的核苷酸序列互補(bǔ)的第一核苷酸序列結(jié)構(gòu)域(稱(chēng)為可變靶向結(jié)構(gòu)域或vt結(jié)構(gòu)域)和與cas內(nèi)切核酸酶多肽相互作用的第二核苷酸序列結(jié)構(gòu)域(稱(chēng)為cas內(nèi)切核酸酶識(shí)別結(jié)構(gòu)域或cer結(jié)構(gòu)域)。雙分子向?qū)Ф嗪塑账岬腸er結(jié)構(gòu)域包含沿著互補(bǔ)區(qū)域雜交的兩個(gè)單獨(dú)分子。兩個(gè)單獨(dú)分子可以是rna、dna和/或rna-dna組合序列。在一些實(shí)施方案中，包含連接到cer結(jié)構(gòu)域的vt結(jié)構(gòu)域的雙鏈體向?qū)Ф嗪塑账岬牡谝环肿颖环Q(chēng)為“crdna”(當(dāng)由連續(xù)dna核苷酸區(qū)段組成時(shí))或“crrna”(當(dāng)由連續(xù)rna核苷酸區(qū)段組成時(shí))或“crdna-rna”(當(dāng)由dna和rna核苷酸的組合組成時(shí))。cr核苷酸可包含天然存在于細(xì)菌和古細(xì)菌中的crna的片段。在一個(gè)實(shí)施方案中，存在于本文所公開(kāi)的cr核苷酸中的天然存在于細(xì)菌和古細(xì)菌中的crna的片段的大小的范圍可為但不限于2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多個(gè)核苷酸。在一些實(shí)施方案中，包含cer結(jié)構(gòu)域的雙鏈體向?qū)Ф嗪塑账岬牡诙肿颖环Q(chēng)為“tracrrna”(當(dāng)由連續(xù)rna核苷酸區(qū)段組成時(shí))或“tracrdna”(當(dāng)由連續(xù)dna核苷酸區(qū)段組成時(shí))或“tracrdna-rna“(當(dāng)由dna和rna核苷酸的組合組成時(shí))。在一個(gè)實(shí)施方案中，導(dǎo)向rna/cas9內(nèi)切核酸酶復(fù)合物的rna是包含雙鏈體crrna-tracrrna的雙鏈體rna。向?qū)Ф嗪塑账徇€可以是單分子，其包含與靶dna中的核苷酸序列互補(bǔ)的第一核苷酸序列結(jié)構(gòu)域(稱(chēng)為可變靶向結(jié)構(gòu)域或vt結(jié)構(gòu)域)和與cas內(nèi)切核酸酶多肽相互作用的第二核苷酸結(jié)構(gòu)域(稱(chēng)為cas內(nèi)切核酸酶識(shí)別結(jié)構(gòu)域或cer結(jié)構(gòu)域)。所謂“結(jié)構(gòu)域”，是指可以是rna、dna和/或rna-dna組合序列的連續(xù)核苷酸區(qū)段。單向?qū)Ф嗪塑账岬膙t結(jié)構(gòu)域和/或cer結(jié)構(gòu)域可包含rna序列、dna序列或rna-dna組合序列。在一些實(shí)施方案中，單向?qū)Ф嗪塑账岚B接到tracr核苷酸(包含cer結(jié)構(gòu)域)的cr核苷酸(包含連接到cer結(jié)構(gòu)域的vt結(jié)構(gòu)域)，其中該連接是包含rna序列、dna序列或rna-dna組合序列的核苷酸序列。由來(lái)自cr核苷酸和tracr核苷酸的序列組成的單向?qū)Ф嗪塑账峥杀环Q(chēng)為“單向?qū)na”(當(dāng)由連續(xù)rna核苷酸區(qū)段組成時(shí))或“單向?qū)na”(當(dāng)由連續(xù)dna核苷酸區(qū)段組成時(shí))或“單指導(dǎo)rna-dna”(當(dāng)由rna和dna核苷酸的組合組成時(shí))。在本公開(kāi)的一個(gè)實(shí)施方案中，單向?qū)na包含可與ii型cas內(nèi)切核酸酶形成復(fù)合物的ii型/cas系統(tǒng)的crna或crna片段以及tracrrna或tracrrna片段，其中所述向?qū)na/cas內(nèi)切核酸酶復(fù)合物可將cas內(nèi)切核酸酶引導(dǎo)至植物基因組靶位點(diǎn)，使cas內(nèi)切核酸酶能夠?qū)㈦p鏈斷裂引入基因組靶位點(diǎn)中。與雙鏈體向?qū)Ф嗪塑账嵯啾?，使用單向?qū)Ф嗪塑账岬囊粋€(gè)方面在于，僅需制備一個(gè)表達(dá)盒就能表達(dá)單向?qū)Ф嗪塑账?。術(shù)語(yǔ)“可變靶向結(jié)構(gòu)域”或“vt結(jié)構(gòu)域”在本文中可互換使用，并且包括與雙鏈dna靶位點(diǎn)的一條鏈(核苷酸序列)互補(bǔ)的核苷酸序列。第一核苷酸序列結(jié)構(gòu)域(vt結(jié)構(gòu)域)與靶序列之間的互補(bǔ)百分比可為至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、63％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％?？勺儼邢蚪Y(jié)構(gòu)域的長(zhǎng)度可為至少12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個(gè)核苷酸。在一些實(shí)施方案中，可變靶向結(jié)構(gòu)域包含12至30個(gè)核苷酸的連續(xù)區(qū)段?？勺儼邢蚪Y(jié)構(gòu)域可由dna序列、rna序列、修飾的dna序列、修飾的rna序列或它們的任何組合組成。向?qū)Ф嗪塑账岬男g(shù)語(yǔ)“cas內(nèi)切核酸酶識(shí)別結(jié)構(gòu)域”或“cer結(jié)構(gòu)域”在本文中可互換使用，并且包括與cas內(nèi)切核酸酶多肽相互作用的核苷酸序列(諸如，向?qū)Ф嗪塑账岬牡诙塑账嵝蛄薪Y(jié)構(gòu)域)。cer結(jié)構(gòu)域可由dna序列、rna序列、修飾的dna序列、修飾的rna序列(參見(jiàn)例如本文所述的修飾)或它們的任何組合組成。連接單向?qū)Ф嗪塑账岬腸r核苷酸和tracr核苷酸的核苷酸序列可包含rna序列、dna序列或rna-dna組合序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，連接單向?qū)Ф嗪塑账岬腸r核苷酸和tracr核苷酸的核苷酸序列的長(zhǎng)度可為至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100個(gè)核苷酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，連接單向?qū)Ф嗪塑账岬腸r核苷酸和tracr核苷酸的核苷酸序列可包含四環(huán)序列，諸如但不限于gaaa四環(huán)序列。向?qū)Ф嗪塑账?、vt結(jié)構(gòu)域和/或cer結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列修飾可選自但不限于由5′帽、3′多聚腺苷酸尾、核糖開(kāi)關(guān)序列、穩(wěn)定性控制序列、形成dsrna雙鏈體的序列、將向?qū)Ф嗪塑账岚邢騺喖?xì)胞位置的修飾或序列、提供追蹤的修飾或序列、提供蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)的修飾或序列、鎖核酸(lna)、5-甲基脫氧胞嘧啶核苷酸、2，6-二氨基嘌呤核苷酸、2′-氟腺嘌呤核苷酸、2′-氟尿嘧啶核苷酸；2′-o-甲基rna核苷酸、硫代磷酸酯鍵、與膽固醇分子的連接、與聚乙二醇分子的連接、與間隔區(qū)18分子的連接、5′至3′共價(jià)連接或它們的任何組合。這些修飾可導(dǎo)致至少一個(gè)另外的有益特征，其中所述另外的有益特征選自經(jīng)修飾的或調(diào)控的穩(wěn)定性、亞細(xì)胞靶向、追蹤、熒光標(biāo)記、蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)復(fù)合物的結(jié)合位點(diǎn)、修飾的對(duì)互補(bǔ)靶序列的結(jié)合親和力、修飾的對(duì)細(xì)胞降解的抗性以及增加的細(xì)胞通透性。在某些實(shí)施方案中，待修飾的核苷酸序列可以是調(diào)控序列，諸如啟動(dòng)子，其中啟動(dòng)子的編輯包括用不同啟動(dòng)子(也稱(chēng)為替換啟動(dòng)子)或啟動(dòng)子片段(也稱(chēng)為替換啟動(dòng)子片段)替換啟動(dòng)子(也稱(chēng)為“啟動(dòng)子更換”或“啟動(dòng)子替換”)，其中啟動(dòng)子替換導(dǎo)致以下中的任一項(xiàng)，或以下項(xiàng)的任意組合：?jiǎn)?dòng)子活性增加、啟動(dòng)子組織特異性增加、啟動(dòng)子活性降低、啟動(dòng)子組織特異性降低、新的啟動(dòng)子活性、誘導(dǎo)型啟動(dòng)子活性、擴(kuò)展基因表達(dá)的窗口、相同細(xì)胞層或其它細(xì)胞層中基因表達(dá)的時(shí)間選擇或發(fā)育進(jìn)展的改變(諸如但不限于延長(zhǎng)玉米花粉囊的絨氈層中基因表達(dá)的時(shí)間選擇；參見(jiàn)例如1998年11月17日公布的us5,837,850)、dna結(jié)合元件突變和/或dna結(jié)合元件缺失或添加。待修飾的啟動(dòng)子(或啟動(dòng)子片段)可以是對(duì)于正被編輯的細(xì)胞而言是內(nèi)源的、人工的、預(yù)先存在的或轉(zhuǎn)基因的啟動(dòng)子(或啟動(dòng)子片段)。替換啟動(dòng)子(或替換啟動(dòng)子片段)可以是對(duì)于正被編輯的細(xì)胞而言是內(nèi)源的、人工的、預(yù)先存在的或轉(zhuǎn)基因的啟動(dòng)子(或啟動(dòng)子片段)。待插入的啟動(dòng)子元件可為但不限于啟動(dòng)子核心元件(諸如但不限于caat盒、ccaat盒、pribnow盒和/或tata盒)、翻譯調(diào)控序列和/或可誘導(dǎo)表達(dá)的阻遏物系統(tǒng)(諸如tet操縱子阻遏物/操縱子/誘導(dǎo)物元件或磺酰脲(su)阻遏物/操縱子/誘導(dǎo)物元件)。脫水應(yīng)答元件(dre)首先被鑒定為干旱應(yīng)答基因rd29a的啟動(dòng)子中的順式作用啟動(dòng)子元件，其含有9bp保守核心序列taccgacat(yamaguchi-shinozaki，k.，andshinozaki，k.(1994)plantcell6，251-264(yamaguchi-shinozaki，k.和shinozaki，k，1994年，《植物細(xì)胞》，第6卷，第251-264頁(yè)))。將dre插入內(nèi)源性啟動(dòng)子可賦予下游基因的干旱誘導(dǎo)表達(dá)。另一個(gè)示例是aba應(yīng)答元件(abre)，其含有發(fā)現(xiàn)存在于許多aba和/或脅迫調(diào)控基因中的(c/t)acgtggc共有序列(buskp.k.，pagesm.(1998)plantmol.biol.37：425-435(buskp.k.、pagesm.，1998年，《植物分子生物學(xué)》，第37卷，第425-435頁(yè)))。將35s增強(qiáng)子或mmv增強(qiáng)子插入內(nèi)源性啟動(dòng)子區(qū)域?qū)⒃黾踊虮磉_(dá)(美國(guó)專(zhuān)利5196525)。待插入的啟動(dòng)子(或啟動(dòng)子元件)可以是對(duì)于正被編輯的細(xì)胞而言是內(nèi)源的、人工的、預(yù)先存在的或轉(zhuǎn)基因的啟動(dòng)子(或啟動(dòng)子元件)。本文所公開(kāi)的雄性能育性多核苷酸和表達(dá)盒可用于任何植物物種的轉(zhuǎn)化，包括但不限于單子葉植物和雙子葉植物。目的植物物種的示例包括但不限于玉米(corn/maize，zeamays)、蕓苔屬物種(brassicasp.)(例如甘藍(lán)型油菜(b.napus)、蕪菁(b.rapa)、芥菜(b.juncea))，苜蓿(medicagosativa)、稻(oryzasativa)、裸麥(secalecereale)、高粱(sorghumbicolor、sorghumvulgare)、粟(例如珍珠粟(pennisetumglaucum)、黃米(panicummiliaceum)、谷子(setariaitalica)、龍爪稷(eleusinecoracana))、向日葵(helianthusannuus)、紅花(carthamustinctorius)、小麥(參見(jiàn)下文了解物種)、大豆(glycinemax)、煙草(nicotianatabacum)、馬鈴薯(solanumtuberosum)、花生(arachishypogaea)、棉花(海島棉(gossypiumbarbadense)、陸地棉(gossypiumhirsutum))、甘薯(ipomoeabatatus)、木薯(manihotesculenta)、咖啡(coffeaspp.)、椰子(cocosnucifera)、菠蘿(ananascomosus)、柑橘(citrusspp.)、可可(theobromacacao)、茶(camelliasinensis)、香蕉(musaspp.)、鱷梨(perseaamericana)、無(wú)花果(ficuscaslca)、番石榴(psidiumguajava)、芒果(mangiferaindica)、橄欖(oleaeuropaea)、木瓜(caricapapaya)、腰果(anacardiumoccidentale)、澳洲堅(jiān)果(macadamiaintegrifolia)、杏仁(prunusamygdalus)、糖用甜菜(betavulgaris)、甘蔗(saccharumspp.)、燕麥(avenasativa)、大麥(hordeumvulgare)、蔬菜類(lèi)、觀(guān)賞植物類(lèi)、草類(lèi)和針葉樹(shù)類(lèi)。在特定實(shí)施方案中，將小麥植物用于本文所公開(kāi)的方法和組合物中。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“小麥”是指小麥屬(triticum)的任何物種，包括其親代以及通過(guò)與其它物種進(jìn)行雜交而得到的其子代。小麥包括“六倍體小麥”和“四倍體小麥”，前者具有aabbdd的基因組結(jié)構(gòu)、由42條染色體構(gòu)成，后者具有aabb的基因組結(jié)構(gòu)、由28條染色體構(gòu)成。六倍體小麥包括普通小麥(t.aestivum)、斯佩耳特小麥(t.spelta)、摩卡小麥(t.mocha)、密穗小麥(t.compactum)、印度圓粒小麥(t.sphaerococcum)、瓦維洛夫小麥(t.vavilovii)，以及它們的種間雜交品種。四倍體小麥包括硬粒小麥(t.durum)(也稱(chēng)為硬質(zhì)小麥或triticumturgidumssp.durum)、野生二粒小麥(t.dicoccoides)、栽培二粒小麥(t.dicoccum)、波蘭小麥(t.polonicum)，以及它們的種間雜交品種。此外，術(shù)語(yǔ)“小麥”包括六倍體或四倍體小麥屬物種的可能親代，諸如提供a基因組的烏拉爾圖小麥(t.uartu)、栽培一粒小麥(t.monococcum)或野生一粒小麥(t.boeoticum)，提供b基因組的擬斯卑爾托山羊草(aegilopsspeltoides)，以及提供d基因組的粗山羊草(t.tauschii)(也稱(chēng)為節(jié)節(jié)麥(aegilopssquarrosa)或aegilopstauschii)。用于本公開(kāi)中的小麥栽培種可屬于但不限于上文列出物種中的任一種。還涵蓋了通過(guò)常規(guī)技術(shù)使用小麥屬物種作為親本與非小麥屬物種進(jìn)行有性雜交產(chǎn)生的植物，所述非小麥屬物種諸如裸麥(secalecereale)，包括但不限于黑小麥。在一些實(shí)施方案中，小麥植物適用于具有本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的合適農(nóng)學(xué)特性的谷物(諸如六倍體小麥或硬質(zhì)小麥的商業(yè)品種)的商業(yè)生產(chǎn)。蔬菜包括番茄(lycopersiconesculentum)、萵苣(例如lactucasativa)、青豆(phaseolusvulgaris)、利馬豆(phaseoluslimensis)、豌豆(香豌豆屬物種(lathyrusspp.))和黃瓜屬(cucumis)的成員諸如黃瓜(c.sativus)、香瓜(c.cantalupensis)和甜瓜(c.melo)。觀(guān)賞植物包括杜鵑(杜鵑花屬物種(rhododendronspp.))、八仙花(macrophyllahydrangea)、木槿(hibiscusrosasanensis)、玫瑰(薔薇屬物種(rosaspp.))、郁金香(郁金香屬物種(tulipaspp.))、水仙(水仙屬物種(narcissusspp.))、矮牽牛(petuniahybrida)、尿乃馨(dianthuscaryophyllus)、一品紅(euphorbiapulcherrima)和菊花?？捎糜趯?shí)踐本發(fā)明的方法和組合物的針葉樹(shù)包括例如松樹(shù)諸如火炬松(pinustaeda)、濕地松(pinuselliotii)、西黃松(pinusponderosa)、美國(guó)黑松(pinuscontorta)和輻射松(pinusradiata)；花旗松(pseudotsugamenziesii)；異葉鐵杉(tsugacanadensis)；北美云杉(piceaglauca)；紅杉(sequoiasempervirens)；冷杉，諸如銀樅(abiesamabilis)和膠樅(abiesbalsamea)；以及雪松，諸如西岸紅雪松(thujaplicata)和阿拉斯加黃雪松(chamaecyparisnootkatensis)。在特定實(shí)施方案中，本文所公開(kāi)的植物是作物植物(例如玉米、苜蓿、向日葵、蕓苔屬、大豆、棉花、紅花、花生、高粱、小麥、粟、煙草等等)。其它目的植物包括提供目的種子的谷物植物、油料種子植物和豆科植物。目的種子包括谷物種子，諸如玉米、小麥、大麥、稻、高粱、裸麥等。油料種子植物包括棉花、大豆、紅花、向日葵、蕓苔屬、玉米、苜蓿、棕櫚、椰子等。豆科植物包括菜豆和豌豆。菜豆包括瓜爾豆、槐豆、胡蘆巴、大豆、四季豆、豇豆、綠豆、利馬豆、蠶豆、兵豆、鷹嘴豆等。通常，中間宿主細(xì)胞將被用于實(shí)施本文所公開(kāi)的方法和組合物，以增加克隆載體的拷貝數(shù)。隨著拷貝數(shù)增加，可分離極大數(shù)量的含有目的核酸的載體以引入所需的植物細(xì)胞中。在一個(gè)實(shí)施方案中，采用不會(huì)引起所述多肽在細(xì)菌中表達(dá)的植物啟動(dòng)子。原核生物最常用各種大腸桿菌菌株代表；然而，也可使用其它微生物菌株。在本文中定義為包括用于轉(zhuǎn)錄起始的啟動(dòng)子(任選地具有操縱子)以及核糖體結(jié)合序列的常用原核控制序列，包括諸如β-內(nèi)酰胺酶(青霉素酶)啟動(dòng)子系統(tǒng)和乳糖(lac)啟動(dòng)子系統(tǒng)(changetal.(1977)nature198：1056(chang等人，1977年，《自然》，198卷，第1056頁(yè)))、色氨酸(trp)啟動(dòng)子系統(tǒng)(goeddeletal.(1980)nucleicacidsres.8：4057(goeddel等人，1980年，《核酸研究》，第8卷，第4057頁(yè)))和λ衍生pl啟動(dòng)子之類(lèi)的常用啟動(dòng)子，以及n-基因核糖體結(jié)合位點(diǎn)(shimatakeetal.(1981)nature292：128(shimatake等人，1981年，《自然》，第292卷，第128頁(yè)))。在轉(zhuǎn)染進(jìn)大腸桿菌中的dna載體中包含選擇標(biāo)記也是有用的。這種標(biāo)記的示例包括特異于對(duì)氨芐青霉素、四環(huán)素或氯霉素的抗性的基因。選擇載體以使得能引入適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中。細(xì)菌載體通常是質(zhì)粒或噬菌體起源的。將適當(dāng)?shù)募?xì)菌細(xì)胞用噬菌體載體顆粒感染或用裸噬菌體載體dna轉(zhuǎn)染。如果使用質(zhì)粒載體，則將細(xì)菌細(xì)胞用質(zhì)粒載體dna轉(zhuǎn)染。使用芽孢桿菌屬(bacillussp.)和沙門(mén)氏菌屬(salmonella)來(lái)表達(dá)本文所公開(kāi)的蛋白質(zhì)的表達(dá)系統(tǒng)(palvaetal.(1983)gene22：229-235(palva等人，1983年，《基因》，第22卷，第229-235頁(yè))；mosbachetal.(1983)nature302：543-545(mosbach等人，1983年，《自然》，第302卷，第543-545頁(yè)))。在一些實(shí)施方案中，本文所公開(kāi)的表達(dá)盒或雄性能育性多核苷酸在植物中維持半合子狀態(tài)。半合子狀態(tài)為當(dāng)僅存在基因(或基因組)的一個(gè)拷貝，而沒(méi)有對(duì)應(yīng)等位基因時(shí)存在的遺傳狀態(tài)。在某些實(shí)施方案中，本文所公開(kāi)的表達(dá)盒包含可操作地連接至雄性能育性多核苷酸的第一啟動(dòng)子，該雄性能育性多核苷酸與可操作地連接至雄性組織優(yōu)選啟動(dòng)子的雄性配子破壞性多核苷酸堆疊，并且將此類(lèi)表達(dá)盒引入處于半合子狀態(tài)的雄性不育植物中。當(dāng)雄性能育性多核苷酸表達(dá)時(shí)，由于雄性能育性多核苷酸使該植物恢復(fù)到能育狀態(tài)，故該植物能夠成功地產(chǎn)生成熟的花粉粒。鑒于表達(dá)盒處于半合子狀態(tài)，故在花粉粒形成過(guò)程中，只有某些子細(xì)胞將遺傳該表達(dá)盒。由于堆疊的被編碼的雄性配子破壞性基因產(chǎn)物的雄性組織優(yōu)選的表達(dá)，遺傳了包含雄性能育性多核苷酸的表達(dá)盒的子細(xì)胞將不會(huì)發(fā)育為成熟的花粉粒。未遺傳該表達(dá)盒的那些花粉粒將繼續(xù)發(fā)育為成熟的花粉粒并具有功能性，但它們將不包含該表達(dá)盒的雄性能育性多核苷酸，因此將不會(huì)通過(guò)花粉將雄性能育性多核苷酸傳遞到子代。v.調(diào)節(jié)雄性能育性多肽的濃度和/或活性提供了用于調(diào)節(jié)植物中的本文所公開(kāi)的雄性能育性多肽的濃度和/或活性的方法。本文針對(duì)雄性能育性多肽的濃度和/或活性所用的術(shù)語(yǔ)“影響”或“調(diào)節(jié)”，是指當(dāng)與適當(dāng)?shù)膶?duì)照比較時(shí)，雄性能育性多肽的濃度和/或活性的任何增大或減小。一般來(lái)講，本文所公開(kāi)的雄性能育性多肽的濃度和/或活性相對(duì)于對(duì)照植物、植物部分或細(xì)胞增大或減小至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。本文所公開(kāi)的調(diào)節(jié)可在植物生長(zhǎng)至具體的發(fā)育階段之前、過(guò)程中和/或之后進(jìn)行。在特定實(shí)施方案中，在單子葉植物(特別是小麥)中對(duì)本文所公開(kāi)的雄性能育性多肽進(jìn)行調(diào)節(jié)?？刹捎枚喾N方法來(lái)測(cè)定雄性能育性多肽的濃度和/或活性受到的調(diào)節(jié)。例如，雄性能育性多肽的表達(dá)水平可例如通過(guò)測(cè)定植物中雄性能育性多肽或rna的水平來(lái)直接測(cè)量(即，蛋白質(zhì)印跡法或rna印跡法)，或者例如通過(guò)測(cè)定植物中雄性能育性多肽的雄性能育性活性來(lái)間接測(cè)量。用于測(cè)量雄性能育性活性的方法在本文別處描述或是本領(lǐng)域已知的。在特定實(shí)施方案中，對(duì)雄性能育性多肽濃度和/或活性的調(diào)節(jié)包括對(duì)植物中的雄性能育性多肽的水平的調(diào)節(jié)(即，增大或減小)。測(cè)量雄性能育性多肽的水平和/或活性的方法在本領(lǐng)域中是已知的并且在本文別處進(jìn)行討論。在其它實(shí)施方案中，對(duì)營(yíng)養(yǎng)組織中、繁殖組織中、或營(yíng)養(yǎng)組織和繁殖組織兩者中的雄性能育性多肽的水平和/或活性進(jìn)行調(diào)節(jié)。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)將多肽或相應(yīng)的雄性能育性多核苷酸引入植物中來(lái)增大雄性能育性多肽的活性和/或濃度。隨后，使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法選擇具有引入的雄性能育性序列的植物，所述方法諸如但不限于southern印跡分析、dna測(cè)序、pcr分析或表型分析。在某些實(shí)施方案中，將標(biāo)記多核苷酸與雄性能育性多核苷酸一起引入，以便幫助選擇具有或缺乏本文所公開(kāi)的雄性能育性多核苷酸的植物。將經(jīng)前述實(shí)施方案改變或修飾的植物或植物部分在形成植物的條件下培育足以調(diào)節(jié)雄性能育性多肽在該植物中的濃度和/或活性的時(shí)間。形成植物的條件在本領(lǐng)域中是熟知的。如本文別處所討論，許多用來(lái)將多肽提供給植物的方法是本領(lǐng)域已知的，包括但不限于將多肽直接引入植物中，或者將編碼雄性能育性多肽的多核苷酸構(gòu)建體引入植物中(瞬時(shí)引入或穩(wěn)定引入)。還應(yīng)認(rèn)識(shí)到，本文所公開(kāi)的方法可采用不能夠在轉(zhuǎn)化的植物中指導(dǎo)蛋白質(zhì)或rna的表達(dá)的多核苷酸。雄性能育性多肽的水平和/或活性可例如通過(guò)改變編碼雄性能育性多肽的基因或其啟動(dòng)子來(lái)增大。參見(jiàn)例如，kmiec的美國(guó)專(zhuān)利5,565,350；zarling等人，pct/us93/03868。因此提供了在雄性能育性基因中攜帶突變的經(jīng)誘變處理的植物，其中所述突變調(diào)節(jié)雄性能育性基因的表達(dá)或調(diào)節(jié)被編碼的雄性能育性多肽的活性。在某些實(shí)施方案中，通過(guò)向植物引入如本文別處所公開(kāi)的包含雄性能育性多核苷酸(例如，seqidno：1、2、4、7、42、43、44或45，或者其活性片段或變體)的表達(dá)盒來(lái)增大雄性能育性多肽的濃度和/或活性。雄性能育性多核苷酸可操作地連接至對(duì)于植物是異源的或者對(duì)于植物是天然的啟動(dòng)子。通過(guò)增大植物中的雄性能育性多肽的濃度和/或活性，植物的雄性能育性也增大。因此，可通過(guò)增大雄性能育性多肽的濃度和/或活性來(lái)增大植物的雄性能育性。例如，通過(guò)增大雄性能育性多肽的濃度和/或活性，可使雄性不育植物恢復(fù)雄性能育性。還應(yīng)認(rèn)識(shí)到，可通過(guò)采用不能夠在轉(zhuǎn)化的植物中指導(dǎo)蛋白質(zhì)或rna的表達(dá)的多核苷酸，來(lái)調(diào)節(jié)該多肽的水平和/或活性。例如，本文所公開(kāi)的多核苷酸可用來(lái)設(shè)計(jì)可在用于改變或誘變生物體中的基因組核苷酸序列的方法中采用的多核苷酸構(gòu)建體。此類(lèi)多核苷酸構(gòu)建體包括但不限于：rna：dna載體、rna：dna突變載體、rna：dna修復(fù)載體、混合雙鏈體寡核苷酸、自身互補(bǔ)rna：dna寡核苷酸和引起重組的寡核苷酸。此類(lèi)核苷酸構(gòu)建體和使用方法是本領(lǐng)域已知的。參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利5,565,350、5,731,181、5,756,325、5,760,012、5,795,972、和5,871,984，以上所有專(zhuān)利以引用方式并入本文。還可參見(jiàn)wo98/49350、wo99/07865、wo99/25821和beethametal.(1999)proc.natl.acad.sci.usa96：8774-8778(beetham等人，1999年，《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》，第96卷，第8774-8778頁(yè))，以上文獻(xiàn)以引用方式并入本文。在一些實(shí)施方案中，可采用病毒誘導(dǎo)的基因沉默；參見(jiàn)例如，ratcliffetal.(2001)plantj.25：237-245(ratcliff等人，2001年，《植物雜志》，第25卷，第237-245頁(yè))；dinesh-kumaretal.(2003)methodsmol.biol.236：287-294(dinesh-kumar等人，2003年，《分子生物學(xué)方法》，第236卷，第287-294頁(yè))；luetal.(2003)methods30：296-303(lu等人，2003年，《方法》，第30卷，第296-303頁(yè))；burch-smithetal.(2006)plantphysiol.142：21-27(burch-smith等人，2006年，《植物生理學(xué)》，第142卷，第21-27頁(yè)))。因此應(yīng)認(rèn)識(shí)到，本文所公開(kāi)的方法并不依賴(lài)于將完整多核苷酸摻入基因組中，只要將該多核苷酸引入細(xì)胞中而使植物或其細(xì)胞被改變即可。在其它實(shí)施方案中，通過(guò)不需要將多核苷酸引入植物中的方法(諸如，通過(guò)將dsrna外源應(yīng)用于植物表面)來(lái)調(diào)節(jié)多肽的水平和/或活性；參見(jiàn)例如wo2013/025670。在一個(gè)實(shí)施方案中，基因組可在將該多核苷酸引入細(xì)胞中之后被改變。例如，可將多核苷酸或其任何部分摻入植物的基因組中。本文所公開(kāi)的基因組的改變包括但不限于基因組中核苷酸的添加、缺失和置換。雖然本文所公開(kāi)的方法并不依賴(lài)于任何具體數(shù)目的核苷酸的添加、缺失和置換，但應(yīng)認(rèn)識(shí)到此類(lèi)添加、缺失或置換包含至少一個(gè)核苷酸。vi.定義術(shù)語(yǔ)“等位基因”指在特定基因座處出現(xiàn)的兩個(gè)或更多個(gè)不同核苷酸序列中的一個(gè)。在核酸擴(kuò)增的情況下術(shù)語(yǔ)“擴(kuò)增”是其中產(chǎn)生附加拷貝的所選核酸(或其轉(zhuǎn)錄形式)的任何過(guò)程。典型的擴(kuò)增方法包括基于多種聚合酶的復(fù)制方法，包括聚合酶鏈反應(yīng)(pcr)、連接酶介導(dǎo)的方法諸如連接酶鏈反應(yīng)(lcr)以及基于rna聚合酶的擴(kuò)增(例如通過(guò)轉(zhuǎn)錄)方法?！癰ac”或細(xì)菌人工染色體是源自大腸桿菌天然存在的f因子的克隆載體，其本身是可作為環(huán)狀質(zhì)粒存在或可整合到細(xì)菌染色體中的dna元件。bac可接受較大的dna序列插入。厘摩(“cm”)是重組頻率的量度單位。1cm等于由于在一個(gè)世代中的雜交導(dǎo)致的在一個(gè)基因座處的標(biāo)記將與在第二基因座處的標(biāo)記分離的概率為1％?！叭旧w”是包含許多基因的一段盤(pán)繞dna，這些基因在細(xì)胞分裂過(guò)程中作為一個(gè)單元起作用和移動(dòng)并因此可被稱(chēng)為是連接的?！叭旧w”也可被稱(chēng)為“連鎖群”?！盎驁D譜”是對(duì)給定物種中一個(gè)或多個(gè)染色體(或連鎖群)上的基因座間的基因連鎖關(guān)系的描述，一般以圖表或表格形式描述。對(duì)于各個(gè)基因圖譜，基因座之間的距離通過(guò)在種群中它們的等位基因在一起出現(xiàn)的頻繁程度(即，它們的重組頻率)而測(cè)量。利用dna或蛋白質(zhì)標(biāo)記或可觀(guān)察的表型，能夠檢測(cè)等位基因?；驁D譜是作圖的種群、使用的標(biāo)記的類(lèi)型以及不同種群間各個(gè)標(biāo)記的多態(tài)性潛力的產(chǎn)物。一個(gè)基因圖譜與另一個(gè)基因圖譜在基因座之間的遺傳距離可以不同。然而，使用共同標(biāo)記能夠?qū)⒁粋€(gè)圖譜與另一個(gè)圖譜的信息關(guān)聯(lián)。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能夠使用共同的標(biāo)記位置來(lái)鑒定每個(gè)單獨(dú)基因圖譜上的目的標(biāo)記和其它基因座的位置?；蜃捻樞蛟趫D譜之間應(yīng)當(dāng)是不變的，然而由于例如標(biāo)記在不同的群體中檢測(cè)替代性的重復(fù)基因座、用于對(duì)標(biāo)記排序的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法的差異、新的突變或?qū)嶒?yàn)誤差，經(jīng)常存在標(biāo)記順序的小的變化?！盎驁D譜位置”是在相同連鎖群上，相對(duì)于圍繞的遺傳標(biāo)記在基因圖譜上的位置，其中能夠在給定物種中發(fā)現(xiàn)指定標(biāo)記。“基因作圖”是限定基因座的連鎖關(guān)系的方法，該方法通過(guò)使用遺傳標(biāo)記、標(biāo)記的種群分離以及重組頻率的標(biāo)準(zhǔn)遺傳原則進(jìn)行?！斑z傳標(biāo)記”是種群中的多態(tài)核酸，并且其中可通過(guò)一種或多種分析方法檢測(cè)并區(qū)分出它們的等位基因，例如rflp、aflp、同功酶、snp、ssr、hrm等。該術(shù)語(yǔ)也指與基因組序列互補(bǔ)的核酸序列，諸如用作探針的核酸。對(duì)應(yīng)于種群成員之間的遺傳多態(tài)性的標(biāo)記能夠通過(guò)本領(lǐng)域已建立的方法進(jìn)行檢測(cè)。這些方法包括例如基于pcr的序列特異性擴(kuò)增方法、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性檢測(cè)(rflp)、同功酶標(biāo)記檢測(cè)、通過(guò)等位基因特異性雜交(ash)進(jìn)行的多核苷酸多態(tài)性檢測(cè)、植物基因組的擴(kuò)增可變序列檢測(cè)、自主序列復(fù)制檢測(cè)、簡(jiǎn)單重復(fù)序列檢測(cè)(ssr)、單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)(snp)或擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性檢測(cè)(aflp)。已經(jīng)建立的方法也已知用于檢測(cè)表達(dá)序列標(biāo)簽(est)和來(lái)源于est序列的ssr標(biāo)記以及隨機(jī)擴(kuò)增的多態(tài)性dna(rapd)?！盎蚪M”指染色體或染色體組攜帶的總dna或整組基因。術(shù)語(yǔ)“基因型”是個(gè)體(或個(gè)體組)的基因組成，其由個(gè)體從其親本遺傳的一個(gè)或多個(gè)已知基因座的等位基因限定。更一般地說(shuō)，術(shù)語(yǔ)“基因型”可用于指?jìng)€(gè)體在其基因組中的所有基因的基因構(gòu)成?！盎蜃笔侨旧w上的位置，例如核苷酸、基因、序列或標(biāo)記所位于的地方?！皹?biāo)記”是發(fā)現(xiàn)基因或物理圖譜上的位置或發(fā)現(xiàn)標(biāo)記與性狀基因座(影響性狀的基因座)之間的連鎖的手段。標(biāo)記所檢測(cè)的位置可通過(guò)檢測(cè)多態(tài)性等位基因及其基因作圖而獲知，或通過(guò)對(duì)已經(jīng)進(jìn)行物理標(biāo)測(cè)的序列進(jìn)行雜交、序列匹配或擴(kuò)增而獲知。標(biāo)記可以是dna標(biāo)記(檢測(cè)dna多態(tài)性)、蛋白質(zhì)(檢測(cè)所編碼多肽的變異)或簡(jiǎn)單遺傳表型(諸如“蠟質(zhì)”表型)?？赏ㄟ^(guò)基因組核苷酸序列或表達(dá)的核苷酸序列(例如，通過(guò)剪接的rna或cdna)開(kāi)發(fā)dna標(biāo)記。根據(jù)dna標(biāo)記技術(shù)，所述標(biāo)記將由側(cè)接所述基因座的互補(bǔ)引物或與該基因座處的多態(tài)性等位基因雜交的互補(bǔ)探針組成。dna標(biāo)記，或遺傳標(biāo)記，還能夠被用于描述其自身染色體上的基因、dna序列或核苷酸(而不是用于檢測(cè)基因或dna序列的組分)，并且當(dāng)該dna標(biāo)記與人類(lèi)遺傳學(xué)中的特定性狀相關(guān)聯(lián)時(shí)經(jīng)常被使用(例如，針對(duì)乳腺癌的標(biāo)記)。術(shù)語(yǔ)標(biāo)記基因座是指該標(biāo)記所檢測(cè)的基因座(基因、序列或核苷酸)。檢測(cè)種群成員之間的遺傳多態(tài)性的標(biāo)記在本領(lǐng)域中是已建立的。標(biāo)記可由其所檢測(cè)的多態(tài)性的類(lèi)型以及用于檢測(cè)所述多態(tài)性的標(biāo)記技術(shù)所限定。標(biāo)記類(lèi)型包括但不限于，例如，限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性檢測(cè)(rflp)、同功酶標(biāo)記檢測(cè)、隨機(jī)擴(kuò)增的多態(tài)性dna(rapd)、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性檢測(cè)(aflp)、簡(jiǎn)單重復(fù)序列檢測(cè)(ssr)、植物基因組的擴(kuò)增可變序列檢測(cè)、自主序列復(fù)制檢測(cè)或單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)(snp)。snp可通過(guò)以下方法檢測(cè)：例如dna測(cè)序、基于pcr的序列特異性擴(kuò)增方法、通過(guò)等位基因特異性雜交(ash)對(duì)多核苷酸多態(tài)性的檢測(cè)、動(dòng)態(tài)等位基因特異性雜交(dash)、競(jìng)爭(zhēng)性等位基因特異性聚合酶鏈反應(yīng)(kaspar)、分子信標(biāo)、微陣列雜交、寡核苷酸連接酶測(cè)定、flap內(nèi)切核酸酶、5’內(nèi)切核酸酶、引物延伸、單鏈構(gòu)象多態(tài)性(sscp)或溫度梯度凝膠電泳(tgge)。dna測(cè)序(諸如焦磷酸測(cè)序技術(shù))具有能夠檢測(cè)組成單倍型的一系列連接的snp等位基因的優(yōu)點(diǎn)。單倍型傾向于比snp更具信息性(檢測(cè)更高水平的多態(tài)性)?！皹?biāo)記等位基因”或者“由標(biāo)記檢測(cè)的等位基因”或“在標(biāo)記基因座處的等位基因”可指在群體中的標(biāo)記基因座處發(fā)現(xiàn)的一個(gè)或多個(gè)多態(tài)性核苷酸序列?！皹?biāo)記基因座”是由特定標(biāo)記檢測(cè)的物種的基因組中的特定染色體位置。標(biāo)記基因座可用于追蹤第二連接基因座的存在情況，例如影響表型性狀表達(dá)的基因座。例如，標(biāo)記基因座可用于監(jiān)控在遺傳上或物理上連接的基因座處的等位基因的分離，諸如qtl?！皹?biāo)記探針”是可用于通過(guò)核酸雜交鑒定標(biāo)記基因座處的等位基因的存在與否的核酸序列或分子，例如與標(biāo)記基因座序列互補(bǔ)的核酸探針。包含標(biāo)記基因座的30個(gè)或更多個(gè)連續(xù)核苷酸(“所有或部分”的標(biāo)記基因座序列)的標(biāo)記探針可用于核酸雜交。或者，在某些方面，標(biāo)記探針指能夠區(qū)別(即基因分型)存在于標(biāo)記基因座處的特定等位基因的任何類(lèi)型的探針。當(dāng)核酸在溶液中特異性雜交或配對(duì)時(shí)，例如根據(jù)watson-crick堿基配對(duì)原則雜交或配對(duì)，核酸是“互補(bǔ)的”。如上所述，當(dāng)鑒定連接基因座時(shí)，術(shù)語(yǔ)“分子標(biāo)記”可用于指如上所定義的遺傳標(biāo)記，或其用作參照點(diǎn)的編碼產(chǎn)物(例如，蛋白質(zhì))。標(biāo)記能夠來(lái)源于基因組核苷酸序列或來(lái)源于表達(dá)的核苷酸序列(例如來(lái)源于剪接的rna、cdna等)，或來(lái)源于編碼的多肽。該術(shù)語(yǔ)也指與標(biāo)記序列互補(bǔ)或側(cè)接標(biāo)記序列的核酸序列，諸如用作探針或能夠擴(kuò)增標(biāo)記序列的引物對(duì)的核酸。“分子標(biāo)記探針”是能夠被用于鑒定標(biāo)記基因座的存在的核酸序列或分子，例如與標(biāo)記基因座序列互補(bǔ)的核酸探針?；蛘?，在某些方面，分子探針指能夠區(qū)別(即基因分型)存在于標(biāo)記基因座處的特定等位基因的任何類(lèi)型的探針。當(dāng)核酸在溶液中特異性雜交時(shí)，例如根據(jù)watson-crick堿基配對(duì)原則雜交，核酸是“互補(bǔ)的”。當(dāng)本文所述的一些標(biāo)記位于插入缺失區(qū)域時(shí)，這些標(biāo)記也被稱(chēng)為雜交標(biāo)記。這是因?yàn)?，根?jù)定義，插入?yún)^(qū)域是關(guān)于無(wú)插入的植物的多態(tài)性。因此，標(biāo)記僅需要指明插入缺失區(qū)域是否存在。任何合適的標(biāo)記檢測(cè)技術(shù)都可用于鑒定此類(lèi)雜交標(biāo)記，例如snp技術(shù)被用于本文提供的示例?；蚪M的“物理圖譜”是顯示染色體dna上可鑒定的界標(biāo)(包括基因、標(biāo)記等)的線(xiàn)性順序的圖譜。然而與基因圖譜相比，界標(biāo)間的距離是絕對(duì)的(例如以堿基對(duì)測(cè)量的或分離的和重疊的鄰接基因片段)并且不基于基因重組(所述基因重組可在不同的種群中有所變化)?！爸参铩笨蔀檎麄€(gè)植物、其任何部分，或者來(lái)源于植物的細(xì)胞或組織培養(yǎng)物。因此，術(shù)語(yǔ)“植物”可指如下中的任何一種：整個(gè)植物、植物組分或器官(例如葉、莖、根等)、植物組織、種子、植物細(xì)胞和/或它們的子代。植物細(xì)胞是從植物中獲得的植物細(xì)胞或來(lái)源于從植物中所獲得的細(xì)胞的培養(yǎng)物?！岸鄳B(tài)性”是群體內(nèi)的兩個(gè)或更多個(gè)個(gè)體之間dna的變化。多態(tài)性在種群中優(yōu)選地具有至少1％的頻率?？捎玫亩鄳B(tài)性可包括單核苷酸多態(tài)性(snp)、簡(jiǎn)單重復(fù)序列(ssr)、或插入/缺失多態(tài)性，本文也稱(chēng)為“插入缺失”?！皡⒖夹蛄小被颉肮灿行蛄小笔怯米餍蛄斜葘?duì)基準(zhǔn)的定義序列。表1.seqidno匯總本文所用的冠詞“一個(gè)”和“一種”指一個(gè)(種)或多于一個(gè)(種)(即，指至少一個(gè)(種))所述冠詞的語(yǔ)法對(duì)象。舉例而言，“一個(gè)要素”意指一個(gè)或多個(gè)要素。在本說(shuō)明書(shū)中提及的所有出版物和專(zhuān)利申請(qǐng)指示本公開(kāi)所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員的水平，并且所有此類(lèi)出版物和專(zhuān)利申請(qǐng)以引用方式并入本文，如同每個(gè)單獨(dú)的出版物或?qū)＠暾?qǐng)被具體地和單獨(dú)地指出以引用方式并入。雖然為了理解清晰目的已經(jīng)通過(guò)舉例說(shuō)明和實(shí)施例方式較詳細(xì)地描述了本發(fā)明，但顯然可以在所附權(quán)利要求書(shū)范圍內(nèi)實(shí)施一些改變和修改。實(shí)施例提供以下實(shí)施例來(lái)進(jìn)行說(shuō)明，但不限制所附權(quán)利要求。應(yīng)當(dāng)理解，本文所述的實(shí)施例和實(shí)施方案僅出于舉例說(shuō)明的目的，本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到在不脫離本發(fā)明的實(shí)質(zhì)或所附權(quán)利要求書(shū)的范圍的情況下可改變多種試劑或參數(shù)。實(shí)施例1：ms1的基因作圖本實(shí)施例證明通過(guò)使用野生型和雄性不育小麥的重組作圖群體，小麥ms1的雄性不育表型的致病基因座可映射到b基因組的染色體4的短臂上的1cm區(qū)域。將攜帶fs2突變基因(也稱(chēng)為msld)的雄性不育(msms)異質(zhì)小麥(品種chris)與品種gladius的植物雜交，以產(chǎn)生f2作圖群體。根據(jù)與小麥染色體4al(hernandezetal.2011.plantjournal69(3)：377-386(hernandez等人，2011年，《植物雜志》，第69卷，第3期，第377-386頁(yè)))、大麥染色體4hs(mayeretal.2011.plantcell23(4)：1249-1263(mayer等人，2011年，《植物細(xì)胞》，第23卷，第4期，第1249-1263頁(yè)))、短柄草染色體1和水稻染色體3或bin映射小麥est(sorrellsetal.，2003genomeresearch13：1818-1827(sorrells等人，2003年，《基因組研究》，第13卷，第1818-1827頁(yè))；larota&sorrells，2004functintegrgenomics4：34-46)(larota和sorrells，2004年，《功能基因組學(xué)和整合基因組學(xué)》，第4卷，第34-46頁(yè)))的同線(xiàn)性，來(lái)鑒定染色體4bs上的ms1區(qū)域中的序列。通過(guò)blast將來(lái)自參考合成序列(例如，大麥snp標(biāo)記11_21056，seqidno：10代表其參考序列)或bin映射est(例如，bf292015，seqidno：14代表其參考序列)的對(duì)應(yīng)小麥序列重疊群鑒定為染色體4bs衍生的iwgsc(國(guó)際小麥基因組測(cè)序協(xié)會(huì))研究組裝序列(mayer，2014science345(6194)：1251788(mayer，2014年，《科學(xué)》，第345卷，第6194期，第1251788頁(yè)))。iwgsc重疊群是針對(duì)高分辨率熔解(hrm)標(biāo)記發(fā)展或基于插入位點(diǎn)的多態(tài)性(isbp-hrm)標(biāo)記發(fā)展的。使用isbpfinder工具(pauxetal.，2010plantbiotechnologyjournal8：196-210(paux等人，2010年，《植物生物技術(shù)雜志》，第8卷，第196-210頁(yè)))設(shè)計(jì)isbp-hrm引物。使用來(lái)自以下各項(xiàng)的dna進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(pcr)擴(kuò)增：作圖群體的親本、4b缺對(duì)染色體品系以及輻射誘導(dǎo)的缺失probus和cornerstone。因?yàn)檫z傳和物理作圖研究表明cornerstone和probus在末端缺失大小和端粒修復(fù)程度方面可能不同，所以對(duì)其進(jìn)行比較分析來(lái)鑒定ms1側(cè)翼標(biāo)記(barlow&driscoll(1981)genetics.98(4)：791-799(barlow和driscoll，1981年，《遺傳學(xué)》，第98卷，第4期，第791-799頁(yè))；zhong-an&darvey(1999)actaagriculturaeboreali-occidentalissinica.cnki：issn：1004-1389.0.1999-04-006(zhong-an和darvey，1999年，《西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)》，cnki：issn：1004-1389.0.1999-04-006))。側(cè)接ms1的引物通過(guò)缺乏具有以下特征的pcr產(chǎn)物以實(shí)驗(yàn)方式確定：該pcr產(chǎn)物來(lái)自染色體4b的dna缺對(duì)染色體，并且對(duì)于輻射誘導(dǎo)的缺失突變體cornerstone是純合的，但呈現(xiàn)為純合輻射誘導(dǎo)的缺失突變體probus。將符合上述標(biāo)準(zhǔn)的hrm標(biāo)記用于作圖。通過(guò)在開(kāi)花前用密封的白色紙袋牢固地覆蓋每株植物的至少三個(gè)穗來(lái)進(jìn)行遺傳性雄性不育的表型分析，然后通過(guò)對(duì)每個(gè)穗的小花數(shù)量和每個(gè)穗的種子數(shù)量計(jì)數(shù)并且將得分表示為每朵小花形成的種子數(shù)來(lái)確定定量能育性得分。首先用被鑒定為側(cè)接染色體4bs上的ms1區(qū)域且在chris與gladius之間呈現(xiàn)多態(tài)性的標(biāo)記來(lái)篩選509個(gè)f2個(gè)體。使用前述過(guò)程在表型方面對(duì)f2個(gè)體進(jìn)行遺傳性雄性不育評(píng)估。鑒定了21個(gè)重組體，并且發(fā)現(xiàn)ms1基因座位于hrm標(biāo)記21056(seqidno：11是參考序列)與bf292015(seqidno：15是參考序列)之間。將hrm標(biāo)記21056和bf292015分別指定為4bs衍生的iwgsc序列重疊群lcl|4bs_4947956和lcl|4bs_4925422(mayer，2014science345(6194)：1251788(mayer，2014年，《科學(xué)》，第345卷，第6194期，第1251788頁(yè)))。確定該區(qū)域在90k的共有圖譜上覆蓋14cm的遺傳距離。然后在標(biāo)記21056和bf292015之間的區(qū)域中形成標(biāo)記，并測(cè)試該標(biāo)記與遺傳性雄性不育表型的關(guān)聯(lián)。使用9k的共有小麥單核苷酸多態(tài)性(snp)圖譜(cavanaghetal.2013pnas110：8057-8062(cavanagh等人，2013年，《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》，第110卷，第8057-8062頁(yè)))來(lái)鑒定含有snp的序列以及在遺傳上位于小麥中染色體4bs的短臂上的ms1區(qū)域中的相應(yīng)iwgsc重疊群(mayer2014.science345(6194)：1251788(mayer，2014年，《科學(xué)》，第345卷，第6194期，第1251788頁(yè)))。含有snp的序列或染色體4bs衍生的iwgsc重疊群是針對(duì)hrm標(biāo)記發(fā)展或基于插入位點(diǎn)的多態(tài)性(isbp-hrm)標(biāo)記物發(fā)展的?？偣埠Y選了3000個(gè)f2個(gè)體，鑒定了54個(gè)重組體，同時(shí)將含有ms1的區(qū)域縮窄到由標(biāo)記wsnp_ex_c18318_27140346(seqidno：18是參考序列)和wsnp_ku_c7153_12360198(seqidno：21是參考序列)界定的區(qū)域。標(biāo)記wsnp_ex_c18318_27140346和wsnp_ku_c7153_12360198分別對(duì)應(yīng)于4bs衍生的iwgsc序列重疊群lcl|4bs_4920499和lcl|4bs_4954867(mayer，2014science345(6194)：1251788(mayer，2014年，《科學(xué)》，第345卷，第6194期，第1251788頁(yè)))。根據(jù)9k的共有小麥snp圖譜，該區(qū)域跨越0.5cm的遺傳區(qū)間。實(shí)施例2：鑒定用于ms1測(cè)序的4bsbac使用與短柄草和水稻的同線(xiàn)性，在由標(biāo)記wsnp_ex_c18318_27140346(seqidno：18)和wsnp_ku_c7153_12360198(seqidno：21)所界定的0.5cm區(qū)域內(nèi)設(shè)計(jì)了18個(gè)探針。根據(jù)靶序列的blast分析，將探針設(shè)計(jì)為非重復(fù)的。然后對(duì)探針進(jìn)行pcr擴(kuò)增并通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，使用qiaquickgelextraction試劑盒(美國(guó)馬里蘭州德國(guó)鎮(zhèn)的快而精公司(qiagen，germantown，md.，usa))從凝膠中洗脫所需大小的片段。將pcr片段合并至等摩爾濃度，然后使用制造商的方案，通過(guò)neblot試劑盒(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室(newenglandbiolabs))進(jìn)行32p-datp放射標(biāo)記。將標(biāo)記的探針在sephadexg50柱(通用電氣醫(yī)療集團(tuán)(gehealthcare))中純化，并在100℃下變性10分鐘。將用于雜交到hybondn+尼龍膜(美國(guó)新澤西州皮斯卡特維的通用電氣醫(yī)療集團(tuán)(gehealthcare))上的28個(gè)高密度bac克隆菌落過(guò)濾器用于雜交。這表示來(lái)自硬質(zhì)小麥品種langdon的5.1-基因組等同物的覆蓋情況(cencietal.2003.theorapplgenet107(5)：931-9)(cenci等人，2003年，《理論與應(yīng)用遺傳學(xué)》，第107卷，第5期，第931-939頁(yè)))。就預(yù)雜交而言，在65℃下，在旋轉(zhuǎn)的玻璃管中完成以下過(guò)程：將菌落過(guò)濾器在雜交溶液(2×sspe，0.5％sds，5×denhardt試劑(sambrook&russel(2001)molecularcloning：alaboratorymanual，coldspringharborlaboratorypress，newyork，ny，usa(sambrook和russel，2001年，《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》，美國(guó)紐約的冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社))、40μg/ml鮭魚(yú)精子dna)中過(guò)夜溫育。將標(biāo)記的探針與5ml雜交溶液混合，并將菌落過(guò)濾器在65℃下過(guò)夜溫育。為了除去未結(jié)合的探針，將過(guò)濾器在含有2×sspe和0.5％sds的洗滌溶液中洗滌兩次，并用1×ssc沖洗。根據(jù)信號(hào)強(qiáng)度將洗滌后的過(guò)濾器暴露于x射線(xiàn)膠片一至三天，以鑒定陽(yáng)性克隆。(2011)journalofbiomedicineandbiotechnology.http：//dx.doi.org/10.1155/2011/302543(2011年，《生物醫(yī)學(xué)和生物技術(shù)雜志》，http://dx.doi.org/10.1155/2011/302543)。這些探針鑒定了跨越ms1區(qū)域的公共bac。從板中分離出顯示陽(yáng)性信號(hào)的bac。使用限制性作圖、利用與上文所用標(biāo)記對(duì)應(yīng)的引物進(jìn)行的pcr實(shí)驗(yàn)以及從每個(gè)bac的端部獲得的序列，來(lái)確定覆蓋目的區(qū)域的bac的順序。從langdon文庫(kù)中選擇跨越ms1區(qū)域的三個(gè)bac(占251kb)用于測(cè)序。此外，對(duì)專(zhuān)有bac進(jìn)行測(cè)序，以覆蓋關(guān)鍵區(qū)域。使用標(biāo)準(zhǔn)鳥(niǎo)槍測(cè)序技術(shù)對(duì)這些bac進(jìn)行測(cè)序，并且使用phred/phrap/consed軟件包(ewingetal.(1998)genomeresearch，8：175-185(ewing等人，1998年，《基因組研究》，第8卷，第175-185頁(yè)))組裝序列。組裝之后，根據(jù)作圖數(shù)據(jù)，對(duì)被認(rèn)為在區(qū)域中位于最接近基因座的序列進(jìn)行注釋?zhuān)馕吨茢嗫赡艿幕蚓幋a區(qū)和表示重復(fù)元件的區(qū)域。使用fgenesh軟件包(美國(guó)紐約芒特基斯科的softberry公司(softberry，mountkisco，newyork，usa))尋找編碼(基因)區(qū)的基因。實(shí)施例3：候選ms1基因的鑒定通過(guò)對(duì)來(lái)源于小麥根、葉和花粉囊組織的cdna進(jìn)行作圖，在251kb序列內(nèi)檢測(cè)到10個(gè)潛在編碼區(qū)。表2提供了這10個(gè)可能的編碼序列及其推定肽功能的物理位置。表2.在這10個(gè)開(kāi)放閱讀框中，鑒定了與非特異轉(zhuǎn)脂蛋白(nsltp)(edstametal.，2014physiologiaplantarumdoi：10.1111/pp1.12156(edstam等人，2014年，《植物生理學(xué)》，doi：10.1111/ppl.12156))具有相似性的三個(gè)編碼的多肽。在檢查來(lái)自雄性不育純合mslcornerstone植物的花粉囊轉(zhuǎn)錄物時(shí)，未觀(guān)察到對(duì)應(yīng)于seqidno：4的cdna。缺乏來(lái)自seqidno：4的轉(zhuǎn)錄物表明ms1不育表型與該cdna之間具有緊密的相關(guān)性。預(yù)測(cè)該特定序列編碼糖基磷脂酰肌醇(gpi)錨定的nsltp(ltpg)多肽(seqidno：5是編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列)，并且該特定序列已被命名為taltpg1，也被稱(chēng)為ms1。ms1多肽(seqidno：5)的分析結(jié)果表明信號(hào)肽位于位置1-23處；ltp結(jié)構(gòu)域位于位置24-108處；并且gpi錨定結(jié)構(gòu)域位于位置195-220處。使用初級(jí)多肽序列的結(jié)構(gòu)模擬表明，通過(guò)二硫鍵(cys-cys)在ltp結(jié)構(gòu)域內(nèi)形成的疏水口袋可能結(jié)合脂肪酸，而預(yù)測(cè)gpi錨定結(jié)構(gòu)域會(huì)將taltpg1固定到細(xì)胞表面。在合適晶體結(jié)構(gòu)模板的proteinhomology/analogyrecognitionenginev2.0(phyre2；kelleyetal.(2015)natureprotocols10：845-858(kelley等人，2015年，《自然研究步驟》，第10卷，第845-858頁(yè)))搜索中，使用c-末端通過(guò)穿過(guò)ltp結(jié)構(gòu)域(即，位置24至位置120)的12個(gè)氨基酸直接連接到信號(hào)肽的編碼的初級(jí)多肽序列。該搜索鑒定了在96％置信度下具有29％同一性的dir1蛋白(pdb：c2rkna)。對(duì)使用的ms1多肽序列的48個(gè)殘基部分進(jìn)行建模，其中對(duì)模板c2rkna具有96.2％置信度。通過(guò)fpocket2程序(schmidtkeetal.，(2011)bioinformatics27(23)：3276-3285(schmidtke等人，2011年，《生物信息學(xué)》，第27卷，第23期，第3276-3285頁(yè)))和3dligandsite(3dligandsite：使用類(lèi)似的結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)配體結(jié)合位點(diǎn)(wassetal.(2010)nucleicacidsres.38：w469-73(wass等人，2010年，《核酸研究》，第38卷，第w469-w473頁(yè))))的組合來(lái)檢測(cè)通過(guò)二硫鍵在ltp結(jié)構(gòu)域內(nèi)形成的疏水口袋。使用具有表面疏水性的標(biāo)準(zhǔn)pdb查看器使ms1、mslf和mslh的結(jié)構(gòu)模型可視化并對(duì)其進(jìn)行注釋?zhuān)⑹褂胏olony方法進(jìn)行計(jì)算。使用與測(cè)定疏水口袋相同的技術(shù)以及二硫鍵在三級(jí)構(gòu)象中的重要性的相關(guān)知識(shí)對(duì)msld、msle、mslf和mslh突變體的ltp結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。(參見(jiàn)例如josé-estanyoletal.(2004)plantphysiologyandbiochemistry42：355-365(josé-estanyol等人，2004年，《植物生理學(xué)和生物化學(xué)》，第42卷，第355-365頁(yè)))。根據(jù)big-pi植物預(yù)測(cè)器推斷gpi錨定結(jié)構(gòu)域和細(xì)胞表面聚集的預(yù)測(cè)。(eisenhaberetal.(2003)plantphysiology133(4)：1691-701(eisenhaber等人，2003年，《植物生理學(xué)》，第133卷，第4期，第1691-1701頁(yè)))實(shí)施例4：小麥突變體ms1等位基因的分離和序列使用來(lái)自從雄性不育純合的甲磺酸乙酯(ems)誘導(dǎo)的突變體msld、msle和mslf分離的基因組dna的高保真校對(duì)酶(klindworthetal.2002.cropsci.42：1447-1450(klindworth等人，2002年，《作物科學(xué)》，第42卷，第1447-1450頁(yè)))以及野生型(ms1)雄性能育基因型(栽培品種chris)，對(duì)來(lái)自染色體4bs的taltpg1的全長(zhǎng)編碼序列進(jìn)行pcr擴(kuò)增。使用用于富含gc的產(chǎn)物的標(biāo)準(zhǔn)sanger測(cè)序技術(shù)對(duì)兩條pcr擴(kuò)增子的鏈進(jìn)行測(cè)序。對(duì)獲得的ms1與ms1sanger測(cè)序色譜圖進(jìn)行比較，結(jié)果表明每個(gè)ms1突變體等位基因(包括來(lái)源于tilling的mslh)和野生型序列之間存在snp(圖2、圖3)。序列分析預(yù)測(cè)，每個(gè)這些突變體的蛋白質(zhì)功能受到破壞。當(dāng)與野生型ms1基因組dna序列(seqidno：7)比較時(shí)，msld在位置1856(g1856a)處表現(xiàn)snp。預(yù)測(cè)該snp會(huì)消除第一外顯子/內(nèi)含子剪接連接，從而導(dǎo)致第一內(nèi)含子內(nèi)的提前終止密碼子的通讀，因此會(huì)消除所編碼的多肽內(nèi)的保守c末端gpi錨定結(jié)構(gòu)域。當(dāng)與野生型ms1基因組dna序列(seqidno：7)比較時(shí)，msle在位置2962處表現(xiàn)snp并且在位置2963處表現(xiàn)1bp缺失(g2962a、c2963del)。預(yù)測(cè)msle中的1bp缺失會(huì)引起所編碼的多肽內(nèi)的移碼以及保守c末端gpi錨定結(jié)構(gòu)域的消除。當(dāng)與野生型ms1基因組dna序列(seqidno：7)比較時(shí)，mslf在位置1682(g1682a)處表現(xiàn)snp。預(yù)測(cè)該snp會(huì)在所編碼的野生型ms1多肽(seqidno：5)內(nèi)將保守的半胱氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)槔野彼?c52y)。預(yù)測(cè)該氨基酸變化會(huì)破壞由二硫鍵介導(dǎo)的成熟蛋白的三級(jí)構(gòu)象。當(dāng)與野生型ms1基因組dna序列(seqidno：7)比較時(shí)，mslh在位置1705(g1705a)處表現(xiàn)snp。預(yù)測(cè)該snp會(huì)在所編碼的野生型ms1多肽(seqidno：5)內(nèi)將天冬氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)樘於０?。預(yù)測(cè)該氨基酸變化會(huì)破壞所編碼的ms1多肽的功能或活性。實(shí)施例5：ms1和ms1花粉的細(xì)胞學(xué)和代謝物分析對(duì)ms1花粉囊的細(xì)胞學(xué)檢查顯示出破碎的絨氈層細(xì)胞表面局部球狀體和具有缺陷外壁結(jié)構(gòu)和紋飾的塌縮花粉。能育與不育花粉囊的代謝分析顯示出c16-c22脂肪酸的累積，與ms1在孢粉素生物合成和/或向發(fā)育中小孢子的運(yùn)輸中的作用一致。細(xì)胞學(xué)檢查對(duì)于透射電子顯微鏡(tem)或掃描電子顯微鏡(sem)，將來(lái)自減數(shù)分裂后期的不育(msld)和能育(ms1)成熟花粉囊固定于二胞花粉。將tem樣品用3％戊二醛在ph7.4的磷酸鹽緩沖鹽水(pbs)中的溶液在4℃下滲透16小時(shí)，而sem樣品則用4％多聚甲醛、1.25％戊二醛和4％蔗糖在ph7.4的磷酸鹽緩沖鹽水(pbs)中的溶液在4℃下滲透16小時(shí)。將tem樣品用lrwhiteresin緩慢滲透并包埋在明膠膠囊中。用pbsph7.4沖洗sem樣品兩次，每次5分鐘，然后使用一系列分級(jí)乙醇溶液(30％、50％、70％、85％、90％和95％)分別脫水60分鐘。然后將sem樣品在100％乙醇中滲透3次，每次60分鐘。在超薄切片機(jī)(emuc6，德國(guó)徠卡公司(leica，germany))上制備70nm的超薄切片，將其安放在銅網(wǎng)格上，并且根據(jù)bozzola和russell1999用4％乙酸雙氧鈾水溶液染色，再用檸檬酸鉛染色(specimenstainingandcontrastmethodsfortransmissionelectronmicroscopy.electronmicroscopy：principlesandtechniquesforbiologists.thejonesandbartlettseriesinbiology，pp.120-147.jonesandbartlettpublishers，boston，ma(用于透射電子顯微鏡法的樣本染色和造影方法。電子顯微鏡：適用于生物學(xué)的原理和技術(shù)。jonesandbartlett生物學(xué)系列，第120-147頁(yè)。jonesandbartlett出版公司，美國(guó)馬薩諸塞州波士頓))。觀(guān)察超薄切片，并在80kv的加速電壓下用tem(philipscm100，阿德萊德大學(xué)顯微鏡研究中心(theuniversityofadelaidemicroscopy))采集圖像。切割sem樣品，然后進(jìn)行臨界點(diǎn)干燥并用鉑濺射涂布(balteccpd030臨界點(diǎn)干燥儀(balteccpd030criticalpointdryer))。在10kv的加速電壓(philipsxl20sem，edaxeds，阿德萊德大學(xué)顯微鏡研究中心(theuniversityofadelaidemicroscopy))下進(jìn)行sem觀(guān)察和圖像采集。糖磷脂酰肌醇(gpi)錨定的脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白通常是角質(zhì)層蠟累積或輸出到莖和長(zhǎng)角果表面上所必需。(borneretal.(2003)plantphysiology132：568-577(borner等人，2003年，《植物生理學(xué)》，第132卷第568-577頁(yè))；kimetal.(2012)plantandcellphysiology53：1391-1403(kim等人，2012年，《植物與細(xì)胞生理學(xué)》，第53卷，第1391-1403頁(yè))外角質(zhì)層蠟具有與花粉外膜的主要成分孢粉素相同的脂質(zhì)前體，花粉外壁在花粉囊的孢子體組織中產(chǎn)生并在稱(chēng)為球狀體的結(jié)構(gòu)中運(yùn)輸至發(fā)育中的小孢子。通過(guò)tem和sem分析不育msld花粉囊，與能育ms1花粉囊相比，結(jié)果顯示出破碎的絨氈層細(xì)胞表面局部球狀體和具有缺陷外壁結(jié)構(gòu)和紋飾的塌縮花粉。代謝物分析在3個(gè)發(fā)育階段(減數(shù)分裂早期至單核期后期)從2個(gè)不育(msld/msld)和1個(gè)能育(ms1/ms1)植株中分離花粉囊，包括3個(gè)生物學(xué)重復(fù)樣，并在干冰上快速冷凍。使用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(gc-ms)，分析氯仿可萃取蠟的組成和數(shù)量。(jungetal.(2006)plantcell18：3015-3032(jung等人，2006年，《植物細(xì)胞》，第18卷，第3015-3032頁(yè))通過(guò)用酯交換試劑meth-prepii進(jìn)行提取物處理以衍生脂肪酸，并與樣品加標(biāo)脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行比較。在三個(gè)發(fā)育階段分析不育msld花粉囊與能育ms1花粉囊，結(jié)果表明，棕櫚酸(c16：0)、棕櫚油酸(c16：1)、油酸(c18：1n9c)、反油酸(c18：1n9t)、亞油酸(c18：2n6c)、γ-亞油酸(c18：3n6)、α-亞油酸(c18：3n6)、花生酸(c20：0)、二十烯酸(c20：1)、二十碳二烯酸(c20：2)和二十二烷酸(c22：0)增加超過(guò)2倍。突變花粉囊中的長(zhǎng)鏈(c16-c22)脂肪酸的增加是孢粉素生物合成中的破壞和/或其向發(fā)育中小孢子的運(yùn)輸?shù)牡湫捅憩F(xiàn)。實(shí)施例6：ms1區(qū)域的標(biāo)記及其在鑒定和選擇含有ms1突變的小麥植株中的用途據(jù)發(fā)現(xiàn)，ms1基因緊密連接至位于ms1區(qū)域中的標(biāo)記et0487、et0488、et0489、et0490、et0491、et0495、007-0033.1和007-0046.1。參見(jiàn)seqidno：24-29、32和33。由于雄性不育性狀由單個(gè)核隱性基因控制，因此雄性不育突變體與野生型授粉媒介之間的所有雜交將導(dǎo)致100％雄性能育f1子代(ms1ms1)，而f2和bc1子代將分離這種性狀。希望確定子代的基因型，這樣可以評(píng)估植株本身是否存在突變，或者是否存在連接至ms1基因中的突變并與其相關(guān)聯(lián)的一個(gè)或多個(gè)等位基因(即，與突變連鎖不平衡)。例如，可以檢測(cè)在標(biāo)記物et0487、et0488、et0489、et0490、et0491、et0495、007-0033.1或007-0046.1處的一個(gè)或多個(gè)等位基因以確定植株是否具有純合或雜合狀態(tài)的ms1突變。對(duì)于msld、msle或mslf，突變?cè)赾hris品種中出現(xiàn)；這樣，位于ms1基因附近的chris等位基因與因果突變處于連鎖不平衡，因此可以評(píng)估存在情況以確定是否存在msld、msle或mslf。通過(guò)標(biāo)記輔助選擇，植物育種人員將能夠通過(guò)受控的雜交跟進(jìn)雄性不育性狀的存在情況，以便在需要時(shí)獲得含有純合或雜合狀態(tài)的ms1突變的新植株，從而保持ms1突變。植物育種人員還可以利用ms1區(qū)域中的標(biāo)記來(lái)產(chǎn)生將用作雌性的突變雄性不育種子親本，即需要花粉供體植株授粉的植株，以產(chǎn)生具有商業(yè)利益的種子或產(chǎn)生含有雜合狀態(tài)的ms1突變的f1雜交體。實(shí)施例7：小麥轉(zhuǎn)化本領(lǐng)域技術(shù)人員可獲知小麥轉(zhuǎn)化方案。參見(jiàn)例如he，etal.，(2010)j.exp.botany61(6)：1567-1581(he等人，2010年，《實(shí)驗(yàn)植物學(xué)雜志》，第61卷，第6期，第1567-1581頁(yè))；wu，etal.，(2008)transgenicres.17：425-436(wu等人，2008年，《轉(zhuǎn)基因研究》，第17卷，第425-436頁(yè))；nehra，etal.，(1994)plantj.5(2)：285-297(nehra等人，1994年，《植物雜志》，第5卷，第2期，第285-297頁(yè))；rasco-gaunt，etal.，(2001)j.exp.botany52(357)：865-874(rasco-gaunt等人，2001年，《實(shí)驗(yàn)植物學(xué)雜志》，第52卷，第357期，第865-874頁(yè))；razzaq，etal.，(2011)africanj.biotech.10(5)：740-750(razzaq等人，2011年，《非洲生物技術(shù)雜志》，第10卷，第5期，第740-750頁(yè))；tamás-nyitrai，etal.，(2012)plantcellcultureprotocols，methodsinmolecularbiology877：357-384(tamás-nyitrai等人，2012年，《植物細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)指南-分子生物學(xué)方法》，第877卷，第357-384頁(yè))；和美國(guó)專(zhuān)利公布2014/0173781。實(shí)施例8：通過(guò)表達(dá)ms1基因或直系同源物的轉(zhuǎn)化拷貝為小麥ms1純合隱性植株恢復(fù)雄性能育性。在前一實(shí)施例中，在對(duì)應(yīng)于來(lái)自msld、msle和mslf植株的ms1候選基因的dna區(qū)域內(nèi)檢測(cè)到核苷酸序列差異。在本實(shí)施例中，描述了用于為純合隱性msld植株恢復(fù)雄性能育性的各種策略。當(dāng)用包含ms1基因的功能性拷貝的dna載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化時(shí)，含有ms1突變的雄性不育小麥植株恢復(fù)為雄性能育性。這表明候選ms1基因在為導(dǎo)致雄性不育表型的ms1突變提供補(bǔ)充方面是有效的。雖然小麥?zhǔn)呛腥齻€(gè)具有相似基因含量的相關(guān)基因組(abd)的異源六倍體，但它在減數(shù)分裂過(guò)程中表現(xiàn)為二倍體。通常相關(guān)的小麥基因組包含具有相似基因結(jié)構(gòu)和功能的同源基因，需要三重突變體才能得到功能喪失表型。然而，在msld突變體中觀(guān)察到的小麥雄性不育表型以3∶1的能育與不育植株比率分離。這表明在該突變體中，在純合條件下的單個(gè)隱性基因座誘導(dǎo)雄性不育表型，并且該基因座根據(jù)孟德?tīng)栠z傳定律分離。與ms1的其它同源物缺乏功能冗余性，表明該基因的a和d基因組拷貝的功能已經(jīng)存在差異。標(biāo)記開(kāi)發(fā)和評(píng)估顯示，雜合的ms1基因座以1∶2∶1的純合野生型與雜合突變體與純合突變體的比例分離。表型數(shù)據(jù)和基因型數(shù)據(jù)的相關(guān)性支持ms1突變遵循孟德?tīng)栠z傳定律。ms1突變的孟德?tīng)栃再|(zhì)將促使雄性不育性狀滲入不同的遺傳背景中。恢復(fù)ms1植株的雄性能育性的一種策略是表達(dá)可以克服由ms1突變或缺失導(dǎo)致的功能或活性喪失的一個(gè)或多個(gè)基因。來(lái)自小麥或來(lái)自具有與ms1相同或相似功能的另一植物物種的基因用于恢復(fù)轉(zhuǎn)化的小麥植株中的基因活性。例如，如圖1所示，來(lái)自大麥的基因編碼與小麥ms1基因產(chǎn)物具有高氨基酸序列相似性并具有約79％序列同一性的蛋白質(zhì)。將存在于seqidno：1中的大麥基因引入小麥ms1突變植物中以恢復(fù)雄性能育性。該大麥基因可以使用其天然啟動(dòng)子(參見(jiàn)seqidno：1、核苷酸1-902、seqidno：41)或非天然啟動(dòng)子(例如組織優(yōu)選的啟動(dòng)子、組成型啟動(dòng)子或條件啟動(dòng)子)來(lái)表達(dá)，以恢復(fù)雄性能育性。其它單子葉植物或雙子葉植物也可以作為補(bǔ)充基因和啟動(dòng)子的來(lái)源，為ms1突變雄性不育小麥植株恢復(fù)雄性能育性?；蚝蛦?dòng)子可以來(lái)自一種來(lái)源或來(lái)自多種源物種的組合，例如來(lái)自小麥、大麥、水稻和短柄草中的一種或多種。在另一策略中，野生型小麥ms1基因或其變體(參見(jiàn)例如seqidno：1、2、4、7、9、42、43、44或45)用于恢復(fù)純合隱性ms1植株的雄性能育性。變體ms1基因包含一個(gè)或多個(gè)dna限制性位點(diǎn)的改變以允許與用于植物轉(zhuǎn)化的dna載體相容。參見(jiàn)例如seqidno：9，其包含在第2、3、1209和1301位處引入的核苷酸變化，以促進(jìn)載體構(gòu)建。通過(guò)已知的植物轉(zhuǎn)化方法將ms1基因引入ms1植株中，產(chǎn)生含有穩(wěn)定整合形式的ms1基因的植株以用于能育性補(bǔ)充。作為使用天然ms1啟動(dòng)子(seqidno：6)的替代，使用啟動(dòng)子變體(例如參見(jiàn)seqidno：8，其包含引入以促進(jìn)載體構(gòu)建的核苷酸變化)或其它植物(例如seqidno：41)或非植物組成型啟動(dòng)子、條件啟動(dòng)子或組織優(yōu)選的啟動(dòng)子表達(dá)野生型或變體形式的ms1基因或cdna，以恢復(fù)純合隱性ms1小麥植株的雄性能育性?；蚝蛦?dòng)子可以來(lái)自一種源物種或來(lái)自多種源物種的組合。在一些實(shí)施例中，啟動(dòng)子是來(lái)自小麥、水稻、大麥或短柄草的ms1啟動(dòng)子。翻譯終止密碼子3′的基因組ms1序列包含功能性終止子區(qū)域；參見(jiàn)seqidno：7第3384-4335位的utr(seqidno：46)。還參見(jiàn)seqidno：1第2838-3838位的utr(seqidno：47)。構(gòu)建體和轉(zhuǎn)化為了恢復(fù)msld/msld純合突變體的能育性，將在天然小麥ms1啟動(dòng)子和終止子控制下的小麥ms1基因連接到在大麥ltp2啟動(dòng)子控制下并且還攜帶pinii終止子序列(tams1-dsred)的dsred2基因(參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利5,525，716)。通過(guò)本文別處所引用的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法將該構(gòu)建體直接轉(zhuǎn)化到從ms1/msld雜合子植株收獲的小麥胚中。獲得了包含tams1-dsred的若干獨(dú)立的t-dna插入事件，用于在msld植株中進(jìn)行構(gòu)建體評(píng)估。t0植株生成和分析鑒定含有單拷貝tams1-dsred盒的t0小麥植株，并將其基因分型為對(duì)于msld突變?yōu)榧兒匣螂s合的。將來(lái)自這些單個(gè)植株的自交種子計(jì)數(shù)為雄性能育性的定性量度。如表4所示，在缺乏tams1-dsred盒的msld/msld純合植株中沒(méi)有觀(guān)察到結(jié)籽。相比之下，當(dāng)msld/msld純合植株含有tams1-dsred盒的轉(zhuǎn)化拷貝時(shí)，觀(guān)察到結(jié)籽。這些結(jié)果表明，tams1的轉(zhuǎn)化拷貝是功能性的，能夠恢復(fù)msld/msld純合雄性不育植株的能育性。表3：含有tams1互補(bǔ)t-dna插入的t0小麥植株中的結(jié)籽。t-dna插入事件msld基因型t-dna拷貝數(shù)雄性能育性表型事件1msld/msld1能育事件2msld/msld1能育事件3msld/msld2能育事件4msld/msld2能育事件5msld/msld3能育事件6msld/msld4能育事件7ms1/msld1能育事件8ms1/msld1能育事件9ms1/msld1能育事件10ms1/msld1能育事件11ms1/msld1能育無(wú)t-dnamsld/msld0不育無(wú)t-dnamsld/msld0不育t1植株分析；分子和表型tams1t-dna插入的互補(bǔ)的遺傳通過(guò)分析來(lái)自具有獨(dú)立t-dna插入(事件1和事件7)的兩個(gè)單獨(dú)t0植株的t1植物來(lái)證實(shí)。一組t1子代衍生自對(duì)于具有tams1-dsred盒(事件1)的msld突變(msld/msld)為純合的t0植株。第二組t1子代衍生自具有tams1-dsred盒(事件7)的對(duì)msld突變(ms1/msld)為雜合的t0植株。來(lái)自這兩組的植株被基因分型用于msld和t-dna插入。在兩組t1子代中，具有基因型msld/ms1和t-dna插入(事件1或事件7)的所有植株都是通過(guò)產(chǎn)生種子來(lái)確定能育的(表5)。具有基因型msld/msld而沒(méi)有t-dna插入的所有子代是雄性不育的并且不產(chǎn)生種子。這清楚地表明，tams1互補(bǔ)t-dna插入能夠恢復(fù)msld/msld突變植株的能育性，并且這種能力會(huì)傳遞給子代。表4：具有或不具有tams1互補(bǔ)t-dna插入的t1植株的能育性。t0事件t1植株msld基因型t-dna拷貝數(shù)雄性能育性表型事件1植株1純合1能育事件1植株2純合1能育事件1植株3純合1能育事件1植株4純合1能育事件1植株5純合2能育事件1植株6純合2能育事件1植株7純合2能育事件1植株8純合0不育事件1植株9純合0不育事件7植株1純合1能育事件7植株2純合1能育事件7植株3純合1能育事件7植株4純合2能育事件7植株5純合2能育事件7植株6純合2能育事件7植株7純合0不育事件7植株8純合0不育總之，用含有天然小麥ms1基因的t-dna插入分析t0和t1植株顯示該基因能夠恢復(fù)msld/msld純合隱性突變的育性。該實(shí)施例進(jìn)一步證明了msld突變位于小麥ms1基因中。實(shí)施例9：使用半合保持系進(jìn)行小麥ms1雄性不育植株的近交系保持和增加。該實(shí)施例證實(shí)，使用連接至種子標(biāo)記基因和花粉抑制基因的ms1的功能性拷貝，可以將ms1的純合隱性小麥植株保持為雄性不育植株。產(chǎn)生雄性不育植株的純系以便用不同的近交系小麥品種進(jìn)行異花授粉來(lái)產(chǎn)生雜種種子，這將是有利的。通常，整合隱性雄性不育的策略導(dǎo)致不能自花授粉的植株。為了完成自花授粉和產(chǎn)生用于異花授粉的純系雄性不育植株，構(gòu)建了表達(dá)盒(ms1-aa-red)，其包含的ms1功能性拷貝連接至表達(dá)功能性α淀粉酶基因的玉米pg47啟動(dòng)子(參見(jiàn)例如seqidno：30)，并且進(jìn)一步連接至在大麥ltp2啟動(dòng)子(參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利5,525,716)的控制下并且還攜帶pinii終止子序列的顏色標(biāo)記基因(例如，編碼紅色熒光蛋白)。使用生物彈道或農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，將該構(gòu)建體直接轉(zhuǎn)化到來(lái)自自花授粉的ms1/ms1小麥植株的胚中。將轉(zhuǎn)化的胚再生成植株?？梢允褂萌缟纤龅膍s1基因座側(cè)翼的標(biāo)記鑒定的含有單拷貝ms1-aa-red盒的小麥植物(ms1/ms1)是雄性能育的并且允許自花授粉。由于pg47：aa抑制花粉功能并因此阻止ms1-aa-red表達(dá)盒通過(guò)花粉傳輸?shù)淖饔?，?lái)自這一代子代的種子將以1∶1紅色熒光和非熒光的頻率分離。從紅色熒光種子生長(zhǎng)的子代對(duì)于ms1-aa-red是半合子的，對(duì)于ms1是純合的，并且是雄性能育的；這些用于繁殖(即，“保持”)雄性不育近交系。非熒光種子的子代不含有ms1互補(bǔ)基因的轉(zhuǎn)化拷貝，對(duì)于ms1是純合的并且是雄性不育的。這些雄性不育近交系作為雌性近交系用于在與ms1基因的野生型雄性近交小麥植株相鄰種植時(shí)用于產(chǎn)生雜種種子。實(shí)施例10：基因的靶向調(diào)控或誘變。對(duì)于雄性能育性應(yīng)用，突變內(nèi)源性ms1基因或改變其表達(dá)可能是有利的，例如通過(guò)本實(shí)施例中所述的方法。已經(jīng)證明將rna引入活細(xì)胞中抑制該細(xì)胞中靶基因的表達(dá)。(baeetal.(2010)plantbreeding129(6)：647-651(bae等人，2010年，《植物育種》，第129卷，第6期，第647-651頁(yè))；beethametal.(1999)proceedingsofthenationalacademyofsciences96(15)：8774-8778，doi：10.1073/pnas.96.15.8774(beetham等人，1999年，《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》，第96卷，第15期，第8774-8778頁(yè)，doi：10.1073/pnas.96.15.8774)；cigan等人，2010年，美國(guó)專(zhuān)利7696405；ciganetal.(2005)theplantjournal43(6)：929-940(cigan等人，2005年，《植物雜志》，第43卷，第6期，第929-940頁(yè))；dalakourasetal.(2009)theplantjournal60(5)：840-851，doi：10.1111/j.1365-313x.2009.04003.x(dalakouras等人，2009年，《植物雜志》，第60卷，第5期，第840-851頁(yè)，doi：10.1111/j.1365-313x.2009.04003.x)；fireetal.(1998)nature391(6669)：806-811(fire等人，1998年，《自然》，第391卷，第6669期，第806-811頁(yè))；fire等人，1999年，wo1999032619a1；metteetal.(2000)emboj19(19)：5194-5201(mette等人，2000年，《歐洲分子生物學(xué)組織雜志》，第19卷，第19期，第5194-5201頁(yè))；okuzakiandtoriyama(2004)plantcellreports22(7)：509-512.doi：10.1007/s00299-003-0698-2(okuzaki和toriyama，2004年，《植物細(xì)胞報(bào)告》，第22卷，第7期，第509-512頁(yè)，doi:10.1007/s00299-003-0698-2)；tang，2013年，wo2013025670a1；timmonsandfire(1998)nature395：854(timmons和fire，1998年，《自然》，第395卷，第854頁(yè))；yuetal.(2002)pnas99(9)：6047-6052(yu等人，2002年，《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》，第99卷，第9期，第6047-6052頁(yè))。技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，rna可以在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)或外源應(yīng)用(tangwo2013025670a1)。干擾rna可以靶向轉(zhuǎn)錄、翻譯或mrna穩(wěn)定性，從而改變靶基因的表達(dá)。在該實(shí)施例中，ms1基因的表達(dá)通過(guò)在植物中單獨(dú)地或組合地表達(dá)靶向啟動(dòng)子區(qū)域的rna(如先前在包括小麥(美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)14/203,698)在內(nèi)的單子葉植物中證實(shí)的那樣(cigan等人，2010年))或靶向所表達(dá)的mrna的rna來(lái)減少或沉默。對(duì)于啟動(dòng)子反向重復(fù)方法，ms1啟動(dòng)子區(qū)域的一部分可以在相反方向上串聯(lián)復(fù)制、并置和定向，并且置于植物轉(zhuǎn)化載體中的組成型組織優(yōu)選的啟動(dòng)子或條件啟動(dòng)子的控制下，以在植物細(xì)胞中表達(dá)啟動(dòng)子反向重復(fù)rna以使可操作地連接至靶啟動(dòng)子的基因沉默。技術(shù)人員還將理解，可通過(guò)核酸序列的突變引入變化，從而導(dǎo)致編碼的mrna的表達(dá)或編碼的ms1多肽的氨基酸序列發(fā)生變化，導(dǎo)致mrna和/或蛋白的生物活性的改變。參見(jiàn)例如在2014年8月20日提交的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)14/463,687中描述的方法，該專(zhuān)利申請(qǐng)全文以引用方式并入本文。因此，可以通過(guò)將一個(gè)或多個(gè)核苷酸的置換、添加和/或缺失引入本文公開(kāi)的相應(yīng)核酸序列或周?chē)蛄兄衼?lái)產(chǎn)生變體核酸分子。此類(lèi)變體核酸序列也被本發(fā)明涵蓋。變體核酸序列可以通過(guò)沿著ms1基因區(qū)域的全部或部分隨機(jī)引入序列改變來(lái)制備，包括但不限于化學(xué)或輻照誘變和寡核苷酸介導(dǎo)的誘變(omm)(beetham等人，1999年；okuzaki和toriyama，2004年)。另選地或作為補(bǔ)充，可以使用雙鏈斷裂技術(shù)，例如但不限于znf、定制設(shè)計(jì)的歸巢內(nèi)切核酸酶、talen、crispr/cas(也稱(chēng)為向?qū)na/cas內(nèi)切核酸酶系統(tǒng)(2014年8月20日提交的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)14/463,687))，或其它基于蛋白質(zhì)、或多核苷酸、或偶聯(lián)的多核苷酸-蛋白質(zhì)的誘變技術(shù)，在具體選定位點(diǎn)引入序列變化。可以篩選所得變體的改變后的ms1活性。應(yīng)當(dāng)理解，這些技術(shù)通常不是相互排它性的。實(shí)際上，各種方法可以單獨(dú)或組合使用、并行或串聯(lián)使用，以產(chǎn)生或獲得多樣的序列變體。實(shí)施例11：通過(guò)taltpg1的轉(zhuǎn)錄后基因沉默誘導(dǎo)雄性不育多核苷酸片段(seqidno：38)從taltpgl的3′utr中分離，并且在rnai盒(zmubi：：taltpg1-ir：sbactin項(xiàng))內(nèi)亞克隆至組成型表達(dá)載體php1中。將用于轉(zhuǎn)化供體材料的植株以每6l(8英寸直徑)裝有土壤混合物的盆5-6株植株進(jìn)行播種。土壤混合物由75％(v/v)椰子泥、25％(v/v)苗圃切割砂(鋒利)、750mg/lcaso4.2h2o(石膏)、750mg/lca(h2po4)2.h20(過(guò)磷酸鹽)、1.9g/lfeso4、125mg/lfeedta、1.9g/lca(no3)2、750mg/lscottsmicromax微量營(yíng)養(yǎng)素和2.5g/losmocoteplus緩釋肥料(16∶3∶9)(scottsaustraliapty.ltd.)組成。使用2份農(nóng)用石灰與1份熟石灰將ph調(diào)節(jié)至6.0至6.5。盆栽植物在23℃(白天)和16℃(夜)的受控環(huán)境生長(zhǎng)室中生長(zhǎng)，使用400w高壓鈉燈與金屬鹵化物燈組合延長(zhǎng)的光周期在冬季月份達(dá)12小時(shí)。根據(jù)公布的方法進(jìn)行具有組成型表達(dá)的hpt選擇性標(biāo)記基因序列的rnai盒的共轟擊。ismaguletal.incropbreedingvol.1145methodsinmolecularbiology(edsd.fleury&r.whitford)ch14，239-252(springer，2014)(ismagul等人，《作物育種》，第1145卷，分子生物學(xué)方法，d.fleury和r.whitford編輯，第14章，第239-252頁(yè)，施普林格出版社，2014年)。通過(guò)在含有100mg/l潮霉素b的ms培養(yǎng)基上選擇來(lái)回收t0再生植株。對(duì)從開(kāi)裂前的各個(gè)植株的不同小穗收集的成熟花粉囊進(jìn)行花粉?；盍υ囼?yàn)。將花粉囊放置在培養(yǎng)皿中的潤(rùn)濕濾紙上以運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室，在那里將它們?cè)诟蓛舻妮d玻片上在一滴2％的碘化鉀溶液中粉碎。通過(guò)用澄清的指甲油包圍蓋玻片邊緣來(lái)保護(hù)位于載玻片與蓋玻片之間的花粉顆粒免于干燥。使用連接至axiocammrm3s/n5669相機(jī)的axioimagerm2顯微鏡檢查和記錄樣品。通過(guò)在開(kāi)花前在每個(gè)植株頭上放置玻璃紙袋來(lái)評(píng)估單個(gè)植株的自體能育性。收集每株植株3至10植株頭用于種子計(jì)數(shù)。每植株頭的兩個(gè)基部和兩個(gè)頂尖小穗由于其不完全的發(fā)育從分析中移除。以每植株頭為基礎(chǔ)對(duì)總種子集和小花數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)。每個(gè)穗或植株的能育性百分比計(jì)算如下：使用苯酚氯仿或冷凍干燥提取方案進(jìn)行來(lái)自所有轉(zhuǎn)基因再生植株的dna提取。(kovalchuk，n.incropbreedingvol.1145methodsinmolecularbiology(edsd.fleury&r.whitford)239-252(springer，2014)(kovalchuk，n.，《作物育種》，第1145卷，分子生物學(xué)方法，d.fleury和r.whitford編輯，第239-252頁(yè)，施普林格出版社，2014年))。將來(lái)自2周齡植株的15cm葉片在液氮中冷凍，并使用1個(gè)大滾珠(9mm)和3個(gè)小滾珠(3mm)以及渦旋機(jī)將組織研磨成細(xì)粉末。向每個(gè)樣品中加入700μl提取緩沖液(1％sarkosyl，100mmtris-hclph8.5，100mmnacl，10mmedta，2％pvpp)，將樣品在旋轉(zhuǎn)振蕩器上混合20min。加入700μl苯酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)，將提取物轉(zhuǎn)移到二氧化硅基質(zhì)管中并以4000rpm旋轉(zhuǎn)10min。通過(guò)加入60μl3m醋酸鈉ph4.8和600μl異丙醇沉淀dna，并以13000rpm離心10分鐘。用1ml70％乙醇洗滌dna沉淀，在13000rpm下離心2分鐘，空氣干燥20分鐘。將純化的dna重懸于50μlr40(1×te，40μg/mlrna酶a)中。通過(guò)使用轉(zhuǎn)基因特異性引物的pcr評(píng)估t0再生小植株中rnai盒的存在。鑒定出九十九種t0再生小植株對(duì)潮霉素具有抗性，其中73個(gè)被認(rèn)為含有rnai盒。在73個(gè)pcr陽(yáng)性t0轉(zhuǎn)基因植株中，當(dāng)評(píng)估自體能育性時(shí)，觀(guān)察到26個(gè)(約36％)是完全不育的或表達(dá)部分不育。這些結(jié)果表明taltpgl特異性轉(zhuǎn)錄后基因沉默可以誘導(dǎo)不育。實(shí)施例12：使用基因組taltpg1恢復(fù)msld純合子的能育性。通過(guò)生物彈道轉(zhuǎn)化將載體php2中taltpg1的基因組片段引入基因型msld×gladius(f2/f3代)中。按照實(shí)施例11進(jìn)行轉(zhuǎn)化。通過(guò)kaspar分析使用ms1連接的標(biāo)記et0292(seqidno：34)、et0294(seqidno：35)、007-0042.1(seqidno：36)、007-0046.1(seqidno：33)以及007-0182.1(seqidno：37)對(duì)再生t0小植株進(jìn)行基因分析，所述標(biāo)記靶向來(lái)自seqidno：8的ms14bs變體啟動(dòng)子(人工)。根據(jù)實(shí)施例11的方法評(píng)估被鑒定為msld純合子并含有ms14bs變體啟動(dòng)子的植株的自體能育性。鑒定出八十個(gè)t0再生小植株對(duì)潮霉素具有抗性，通過(guò)kasp分析用007-0182.1鑒定出其中69個(gè)被認(rèn)為含有轉(zhuǎn)基因衍生的ms14bs變體啟動(dòng)子。在這69個(gè)t0轉(zhuǎn)基因植株中，使用007-0009.1、007-0011.1、007-0042.1和007-0046.1標(biāo)記通過(guò)kasp分析鑒定出4個(gè)植株對(duì)于chris單倍型(msld/msld)是純合的。開(kāi)花前裝袋的穗的分析顯示三個(gè)品系是自體能育的。這些研究結(jié)果表明taltpgl的基因組片段可以恢復(fù)msld純合子的能育性。實(shí)施例13：ms1啟動(dòng)子反向重復(fù)表達(dá)影響小麥的能育性該實(shí)施例證明可以通過(guò)ms1啟動(dòng)子特異性反向重復(fù)序列(啟動(dòng)子反向重復(fù)序列，pir)分子的表達(dá)來(lái)改變植物的能育性。這提供了ms1基因的表達(dá)是小麥中雄性能育所需的進(jìn)一步證據(jù)。通過(guò)將泛素啟動(dòng)子與靶向小麥ms1啟動(dòng)子的一部分的反向重復(fù)序列連接，來(lái)產(chǎn)生pir構(gòu)建體(seqidno：6)，包括反向重復(fù)序列之間的nos間隔區(qū)段。用于制備載體的核酸分子和方法之前已有描述(ciganetalplantjournal(2005)43，929-940(cigan等人，《植物雜志》，2005年，第43卷，第929-940頁(yè)))。使用本領(lǐng)域已知的和本文別處提到的方法，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化將該構(gòu)建體引入小麥fielder品種中。使植株在溫室中生長(zhǎng)。通過(guò)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qpcr)測(cè)定轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)。將植株栽培至成熟，記錄雄性能育性表型。抑制足以造成在100％的事件中呈雄性不育。單拷貝和多拷貝t-dna插入事件都是雄性不育的，這表明單拷貝和多拷貝插入事件都是有效的。該實(shí)施例進(jìn)一步證實(shí)，ms1基因是小麥中的雄性能育基因，并且其抑制導(dǎo)致雄性不育。序列表<110>pioneerhi-bredinternational,inc.<120>小麥ms1多核苷酸、多肽和使用方法<130>rts20250d-wo-pct<150>us62/056365<151>2014-09-26<160>47<170>patentin版本3.5<210>1<211>3838<212>dna<213>多棱大麥(hordeumvulgare)<220><221>啟動(dòng)子<222>(1)..(902)<400>1cgcacatcaacataaactcatcagatgggaataatcggatctacgaaggacataaaactc60tttaatctcatgacaacgccagaagagcaagagtaaatatattctcataaaaaacaatga120acactagatgatgacgaagaacataagattcttcaaggagaaattgcggcagcggagatg180gcagccggaggcgagggggccaaaaactctgttgcggcggcagcggtagccttggtgaaa240cccacacgtttgcacaccatataagttgtttgcaagggttacatgggcctcgctctcgtg300aaaaagaaggtcatacatgggtcttggtctcgtgcaaaacgaaaggtcagcagtccatgg360gccggaggaaaaaccgggcaacaacacgccatgtgtgttttcgcgggaacccaattccga420aatcactcaccggcacctcgtcccgatgccttccagaacgttctacgtgcttccacaggg480ccagcccagccgtgggatcagatcaggatcagcacgaacattgaagctagcgcggcgata540tttttcccagcctccgcctcgctcgacgactgcatttcatttcgaaaacaaaaaaaagag600ctttctccttctcatcccgagcgccagaggagcaccagaaaggccacccacccaccctca660cgtaccgccctcgcacccgcgcggccacatctgggccgtccacttgggcagctggccgtt720ccattcccgaactgacgggcaggatcgagcgagcggcgcgcccacggctcctccggctat780ataacccgccacccacaccactcccctccggcgttccaccagagccttcctccctccacc840gcaccaccaccaccaccgcgccaaaaaccctagggagcgagcgagctcacctcgccccgc900c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