相關(guān)專(zhuān)利申請(qǐng)

本申請(qǐng)要求2015年5月28日提交的臨時(shí)申請(qǐng)no.62/167,650、2014年12月19日提交的臨時(shí)申請(qǐng)no.62/094,603、2014年11月7日提交的臨時(shí)申請(qǐng)no.62/076,836、2014年9月19日提交的臨時(shí)申請(qǐng)no.62/052,947以及2014年9月19日提交的臨時(shí)申請(qǐng)no.62/052,901的優(yōu)先權(quán)權(quán)益，這些臨時(shí)申請(qǐng)均據(jù)此全文以引用方式并入。

序列表

本申請(qǐng)包含以ascii格式通過(guò)電子方式提交的序列表，該序列表?yè)?jù)此以引用方式全文并入本文。2015年9月16日創(chuàng)建的所述ascii副本被命名為rpb-010.25_sl.txt，其大小為42,074字節(jié)。

背景技術(shù)：

經(jīng)遺傳修飾的嚙齒動(dòng)物已被證明是對(duì)許多抗原具有特異性的治療性抗體的重要來(lái)源，然而一些抗原已被證明難以靶向。因此，迫切需要一種新型治療性抗原結(jié)合蛋白以及可用于生成此類(lèi)抗原結(jié)合蛋白的方法和組合物。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本文提供了與嵌合抗原受體(car)相關(guān)的方法和組合物。例如，本文提供了car和car多肽、表達(dá)car和car多肽的非人動(dòng)物、編碼car和car多肽的核酸、以及可用于制備和使用此類(lèi)car、表達(dá)car的非人動(dòng)物和編碼car的核酸的組合物和方法。

如本文所述，car是這樣的抗原結(jié)合蛋白，其具有來(lái)源于免疫球蛋白(ig)可變結(jié)構(gòu)域的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域以及來(lái)源于t細(xì)胞受體(tcr)的恒定結(jié)構(gòu)域。一般來(lái)講，本文所提供的car包含兩條car多肽鏈，其中一條多肽鏈包含tcrα恒定結(jié)構(gòu)域，另一條多肽鏈包含tcrβ恒定結(jié)構(gòu)域。每條多肽鏈包含ig可變結(jié)構(gòu)域，其中一條多肽鏈包含重鏈ig可變結(jié)構(gòu)域，另一條鏈包含ig輕鏈(κ或λ)可變結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施例中，本文所提供的car對(duì)主要組織相容性復(fù)合體(mhc)蛋白(例如，i類(lèi)mhc蛋白或ii類(lèi)mhc蛋白)所遞呈的肽具有結(jié)合特異性。

在某些方面，本文提供了表達(dá)car多肽的經(jīng)遺傳修飾的非人動(dòng)物(例如，嚙齒動(dòng)物，如小鼠或大鼠)。在一些實(shí)施例中，非人動(dòng)物的生殖系中包含car基因座，該car基因座包含具有非重排人ig可變區(qū)基因區(qū)段(例如，非重排v、d和j重鏈基因區(qū)段、非重排vκ和jκ輕鏈基因區(qū)段或者非重排vλ和jλ輕鏈基因區(qū)段)的非重排可變區(qū)基因座以及tcr恒定區(qū)基因(例如，tcrα恒定區(qū)基因或tcrβ恒定區(qū)基因)。在一些實(shí)施例中，非重排ig可變區(qū)基因區(qū)段有效連接至tcr恒定區(qū)基因，使得經(jīng)遺傳修飾的非人動(dòng)物表達(dá)car多肽，該car多肽包含由來(lái)源于非重排可變區(qū)基因區(qū)段的重排ig可變區(qū)基因編碼的ig可變結(jié)構(gòu)域以及由tcr恒定區(qū)基因編碼的tcr恒定結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施例中，非重排ig可變區(qū)基因區(qū)段為人ig可變區(qū)基因區(qū)段。在一些實(shí)施例中，tcr恒定區(qū)基因?yàn)閮?nèi)源物種來(lái)源。在一些實(shí)施例中，tcr恒定結(jié)構(gòu)域?yàn)槿嘶驀X動(dòng)物(例如，小鼠或大鼠)。在一些實(shí)施例中，tcr恒定區(qū)基因?yàn)樾∈蠡虼笫髏cr恒定區(qū)。在一些實(shí)施例中，非重排可變區(qū)基因座包含ig可變區(qū)基因間序列(例如，重鏈基因間序列、κ基因間序列或λ基因間序列)。在一些實(shí)施例中，ig可變區(qū)基因間序列為人序列、小鼠序列或大鼠序列。在一些實(shí)施例中，非重排可變區(qū)基因座包含tcr可變區(qū)基因間序列(例如，tcrβ基因間序列或tcrα基因間序列)。在一些實(shí)施例中，tcr可變區(qū)基因間序列為人序列、小鼠序列或大鼠序列。

在一些方面，本文提供了表達(dá)car的經(jīng)遺傳修飾的非人動(dòng)物(例如，嚙齒動(dòng)物，如小鼠或大鼠)。在一些實(shí)施例中，非人動(dòng)物的生殖系中包含第一car基因座和第二car基因座。在一些實(shí)施例中，第一car基因座包含具有非重排人igvh、dh和jh基因區(qū)段的非重排可變區(qū)基因座以及具有內(nèi)源物種來(lái)源(例如，大鼠或小鼠源)的tcrβ恒定區(qū)基因的恒定區(qū)基因座，其中人非重排igvh、dh和jh基因區(qū)段有效連接至tcrβ恒定區(qū)基因，使得經(jīng)遺傳修飾的非人動(dòng)物表達(dá)第一car多肽鏈，該第一car多肽鏈包含由來(lái)源于非重排igvh、dh和jh基因區(qū)段的重排重鏈可變區(qū)基因編碼的ig重鏈可變結(jié)構(gòu)域以及由tcrβ恒定區(qū)基因編碼的tcrβ恒定結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施例中，第一car基因座包含具有ig重鏈可變區(qū)基因(通用重鏈可變區(qū))的重排可變區(qū)基因座以及具有內(nèi)源物種來(lái)源(例如，大鼠或小鼠源)的tcrβ恒定區(qū)基因的恒定區(qū)基因座，其中經(jīng)遺傳修飾的非人動(dòng)物表達(dá)第一car多肽鏈，該第一car多肽鏈包含由重排重鏈可變區(qū)基因編碼的ig重鏈可變結(jié)構(gòu)域以及由tcrβ恒定區(qū)基因編碼的tcrβ恒定結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施例中，第二car基因座包含具有非重排人igvκ和jκ的非重排可變區(qū)基因座以及具有內(nèi)源物種來(lái)源(例如，大鼠或小鼠源)的tcrα恒定區(qū)基因的恒定區(qū)基因座，其中人非重排igvκ和jκ基因區(qū)段有效連接至tcrα恒定區(qū)基因，使得經(jīng)遺傳修飾的非人動(dòng)物表達(dá)第二car多肽鏈，該第二car多肽鏈包含由來(lái)源于非重排igvκ和jκ基因區(qū)段的重排igκ可變區(qū)基因編碼的igκ可變結(jié)構(gòu)域以及由tcrα恒定區(qū)基因編碼的tcrα恒定結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施例中，第二car基因座包含具有非重排人igvλ和jλ的非重排可變區(qū)基因座以及具有內(nèi)源物種來(lái)源(例如，大鼠或小鼠源)的tcrα恒定區(qū)基因的恒定區(qū)基因座，其中人非重排igvλ和jλ基因區(qū)段有效連接至tcrα恒定區(qū)基因，使得經(jīng)遺傳修飾的非人動(dòng)物表達(dá)第二car多肽鏈，該第二car多肽鏈包含由來(lái)源于非重排igvλ和jλ基因區(qū)段的重排igλ可變區(qū)基因編碼的igλ可變結(jié)構(gòu)域以及由tcrα恒定區(qū)基因編碼的tcrα恒定結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施例中，第二car基因座包含具有ig輕鏈κ或λ可變區(qū)基因(通用輕鏈可變區(qū))的重排可變區(qū)基因座以及具有內(nèi)源物種來(lái)源(例如，大鼠或小鼠源)的tcrα恒定區(qū)基因的恒定區(qū)基因座，其中經(jīng)遺傳修飾的非人動(dòng)物表達(dá)第二car多肽鏈，該第二car多肽鏈包含由重排輕鏈可變區(qū)基因編碼的ig輕鏈可變結(jié)構(gòu)域以及由tcrα恒定區(qū)基因編碼的tcrα恒定區(qū)。在一些實(shí)施例中，經(jīng)遺傳修飾的非人動(dòng)物表達(dá)包含第一car多肽鏈和第二car多肽鏈的car。在一些實(shí)施例中，非重排可變區(qū)基因座中的一個(gè)或兩個(gè)包含ig可變區(qū)基因間序列(例如，重鏈基因間序列、κ基因間序列或λ基因間序列)。在一些實(shí)施例中，ig可變區(qū)基因間序列為人序列、小鼠序列或大鼠序列。在一些實(shí)施例中，一個(gè)或兩個(gè)非重排可變區(qū)基因座包含tcr可變區(qū)基因間序列(例如，tcrβ基因間序列或tcrα基因間序列)。在一些實(shí)施例中，tcr可變區(qū)基因間序列為人序列、小鼠序列或大鼠序列。

在一些實(shí)施例中，本文所述經(jīng)遺傳修飾的非人動(dòng)物表達(dá)car。在一些實(shí)施例中，car在非人動(dòng)物的t細(xì)胞(例如，cd4和/或cd8t細(xì)胞)上表達(dá)。在一些實(shí)施例中，表達(dá)car的t細(xì)胞在經(jīng)遺傳修飾的非人動(dòng)物的胸腺中經(jīng)歷了陽(yáng)性和/或陰性選擇。在一些實(shí)施例中，car對(duì)肽/mhc復(fù)合體(即，在mhc蛋白的溝槽中遞呈的肽)具有結(jié)合特異性。在一些實(shí)施例中，car對(duì)i類(lèi)mhc蛋白所遞呈的肽具有結(jié)合特異性。在一些實(shí)施例中，car對(duì)ii類(lèi)mhc蛋白所遞呈的肽具有結(jié)合特異性。

在本文所述經(jīng)遺傳修飾的非人動(dòng)物的一些實(shí)施例中，car基因座位于內(nèi)源tcr基因座(例如，內(nèi)源tcrα基因座或內(nèi)源tcrβ基因座)處。在一些實(shí)施例中，car基因座的tcr恒定區(qū)基因?yàn)閮?nèi)源tcr恒定區(qū)基因。在一些實(shí)施例中，內(nèi)源tcrα基因座和/或tcrβ基因座的可變區(qū)中的全部或一部分被替換為ig基因座的可變區(qū)的全部或一部分，從而形成car基因座。在一些實(shí)施例中，整個(gè)tcr可變區(qū)被替換為ig可變區(qū)。在一些實(shí)施例中，tcr可變區(qū)基因區(qū)段被替換為ig可變區(qū)基因區(qū)段。例如，在一些實(shí)施例中，內(nèi)源tcrβ基因座的v、d和j基因區(qū)段被替換為ig重鏈v、d和j基因區(qū)段。在一些實(shí)施例中，內(nèi)源tcrα基因座的v和j基因區(qū)段被替換為ig輕鏈(例如，κ或λ)v和j基因區(qū)段。在一些實(shí)施例中，car基因座位于內(nèi)源tcr基因座的外部。

在本文所述經(jīng)遺傳修飾的非人動(dòng)物的一些實(shí)施例中，car基因座的可變區(qū)基因座中的所有內(nèi)源tcr可變區(qū)基因區(qū)段被替換為ig可變區(qū)基因區(qū)段。在一些實(shí)施例中，car基因座的可變區(qū)基因座中的基本上所有tcr可變區(qū)基因區(qū)段被替換為ig可變區(qū)基因區(qū)段。在一些實(shí)施例中，不超過(guò)1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個(gè)tcr可變區(qū)基因區(qū)段位于car基因座的可變區(qū)基因座中和/或有效連接至tcr恒定區(qū)基因。在一些實(shí)施例中，car基因座中沒(méi)有功能性tcr可變區(qū)基因區(qū)段有效連接至tcr恒定區(qū)基因。在一些實(shí)施例中，car基因座中沒(méi)有tcr可變區(qū)基因區(qū)段有效連接至tcr恒定區(qū)基因。在一些實(shí)施例中，car基因座包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70或80個(gè)ig可變區(qū)基因區(qū)段。

在一些實(shí)施例中，經(jīng)遺傳修飾的非人動(dòng)物不表達(dá)功能性αβtcr。在一些實(shí)施例中，經(jīng)遺傳修飾的非人動(dòng)物不表達(dá)功能性tcrα鏈和/或功能性tcrβ鏈。在一些實(shí)施例中，內(nèi)源tcrα可變區(qū)基因座和/或tcrβ可變區(qū)基因座在經(jīng)遺傳修飾的非人動(dòng)物中是失活的。例如，在一些實(shí)施例中，通過(guò)使內(nèi)源基因座的全部或一部分缺失，而使內(nèi)源tcrα可變區(qū)基因座和/或tcrβ可變區(qū)基因座失活。在一些實(shí)施例中，通過(guò)破壞tcr可變區(qū)基因座與tcr恒定區(qū)基因座之間的有效連接(例如，通過(guò)使非編碼調(diào)節(jié)元件缺失，通過(guò)顛倒tcr可變區(qū)基因座或其一部分、和/或通過(guò)將核酸序列諸如編碼非重排ig可變區(qū)或其一部分的核酸序列插入在tcr可變區(qū)基因座的可變區(qū)基因區(qū)段與tcr恒定區(qū)基因座的tcr恒定區(qū)基因之間)，而使tcrα可變區(qū)基因座和/或tcrβ可變區(qū)基因座失活。

在一些實(shí)施例中，非人動(dòng)物不包含tcrδ基因座。tcrδ位于tcrα基因座的內(nèi)部，并介于tcrαv與tcrαj基因區(qū)段之間。因此，在一些實(shí)施例中，非人動(dòng)物在tcrα基因座處包含ig輕鏈的可變區(qū)，該ig輕鏈的可變區(qū)包含有效連接至tcrα恒定區(qū)的ig輕鏈v和j基因區(qū)段，并且tcrδ基因座被缺失或修飾，使得非人動(dòng)物不表達(dá)功能性δ/γtcr。在一些實(shí)施例中，tcrδ基因座被保留，并且非人動(dòng)物不表達(dá)功能性δ/γtcr。

在本文所提供的經(jīng)遺傳修飾的非人動(dòng)物的一些實(shí)施例中，car基因座的非重排可變區(qū)包含一種或多種胰蛋白酶原(try)基因(例如，通常存在于tcrβ可變區(qū)基因座中的try基因和/或假基因)。在一些實(shí)施例中，try基因?yàn)閮?nèi)源物種來(lái)源。在一些實(shí)施例中，try基因?yàn)樾∈髏ry基因。在一些實(shí)施例中，小鼠try基因選自try1、try2、try3、try4、try5、try6、try7、try8、try9、try10、try11、try12、try13、try14、try15、try16、try17、try18、try19和try20。在一些實(shí)施例中，一種或多種try基因位于非重排可變區(qū)的v區(qū)段的上游。在一些實(shí)施例中，一種或多種try基因位于非重排可變區(qū)的v區(qū)段的下游(例如，v區(qū)段的下游以及d和/或j區(qū)段的上游)。在一些實(shí)施例中，try1-7位于非重排可變區(qū)的v區(qū)段的上游，并且try8-20位于非重排可變區(qū)的v區(qū)段的下游(例如，v區(qū)段的下游以及d和/或j區(qū)段的上游)。

在一些實(shí)施例中，經(jīng)遺傳修飾的非人動(dòng)物表達(dá)一種或多種人源化mhci類(lèi)α鏈多肽。在一些實(shí)施例中，人源化mhci類(lèi)α鏈多肽為全人源的。在一些實(shí)施例中，人源化mhci類(lèi)α鏈多肽包含人胞外結(jié)構(gòu)域(人α1、α2和α3結(jié)構(gòu)域)和內(nèi)源物種來(lái)源的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施例中，人源化i類(lèi)α鏈多肽為hla-a、hla-b、hla-c、hla-e、hla-f、hla-g、hla-k或hla-l。在一些實(shí)施例中，非人動(dòng)物表達(dá)人源化hla-a、hla-b、hla-c、hla-e、hla-f、hla-g、hla-k和/或hla-l多肽。在一些實(shí)施例中，非人動(dòng)物的基因組中包含人源化mhci類(lèi)α鏈基因座，該基因座包含編碼人源化mhci類(lèi)α鏈多肽的核酸序列。在一些實(shí)施例中，人源化mhci類(lèi)α鏈基因座位于內(nèi)源mhci類(lèi)α鏈基因座處。在一些實(shí)施例中，非人動(dòng)物的內(nèi)源mhci類(lèi)α鏈基因座中的一個(gè)或多個(gè)(例如，全部)被替換為人源化mhci類(lèi)α鏈基因座。在一些實(shí)施例中，經(jīng)遺傳修飾的非人動(dòng)物不表達(dá)完全內(nèi)源物種來(lái)源的mhci類(lèi)α鏈多肽。

在一些實(shí)施例中，經(jīng)遺傳修飾的非人動(dòng)物表達(dá)人源化β-2-微球蛋白多肽。在一些實(shí)施例中，人源化β-2-微球蛋白多肽為全人源的。在一些實(shí)施例中，非人動(dòng)物的基因組中包含人源化β-2-微球蛋白基因座，該基因座包含編碼人源化β-2-微球蛋白多肽的核酸序列。在一些實(shí)施例中，人源化β-2-微球蛋白基因座位于內(nèi)源β-2-微球蛋白基因座處。在一些實(shí)施例中，內(nèi)源β-2-微球蛋白基因座被替換為人源化β-2-微球蛋白基因座。在一些實(shí)施例中，經(jīng)遺傳修飾的非人動(dòng)物不表達(dá)完全內(nèi)源物種來(lái)源的β-2-微球蛋白多肽。

在一些實(shí)施例中，經(jīng)遺傳修飾的非人動(dòng)物表達(dá)一種或多種人源化mhcii類(lèi)α鏈多肽。在一些實(shí)施例中，人源化mhcii類(lèi)α鏈多肽為全人源的。在一些實(shí)施例中，人源化mhcii類(lèi)α鏈多肽包含人胞外結(jié)構(gòu)域和內(nèi)源物種來(lái)源的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施例中，人源化ii類(lèi)α鏈多肽為hla-dma、hla-doa、hla-dpa、hla-dqa或hla-dra。在一些實(shí)施例中，非人動(dòng)物表達(dá)人源化hla-dma、hla-doa、hla-dpa、hla-dqa和/或hla-dra多肽。在一些實(shí)施例中，非人動(dòng)物的基因組中包含人源化mhcii類(lèi)α鏈基因座，該基因座包含編碼人源化mhcii類(lèi)α鏈多肽的核酸序列。在一些實(shí)施例中，人源化mhcii類(lèi)α鏈基因座位于內(nèi)源mhcii類(lèi)α鏈基因座處。在一些實(shí)施例中，非人動(dòng)物的內(nèi)源mhcii類(lèi)α鏈基因座中的一個(gè)或多個(gè)(例如，全部)被替換為人源化mhcii類(lèi)α鏈基因座。在一些實(shí)施例中，經(jīng)遺傳修飾的非人動(dòng)物不表達(dá)完全內(nèi)源物種來(lái)源的mhcii類(lèi)α鏈多肽。

在一些實(shí)施例中，經(jīng)遺傳修飾的非人動(dòng)物表達(dá)一種或多種人源化mhcii類(lèi)β鏈多肽。在一些實(shí)施例中，人源化mhcii類(lèi)β鏈多肽為全人源的。在一些實(shí)施例中，人源化mhcii類(lèi)β鏈多肽包含人胞外結(jié)構(gòu)域和內(nèi)源物種來(lái)源的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施例中，人源化ii類(lèi)β鏈多肽為hla-dmb、hla-dob、hla-dpb、hla-dqb或hla-drb。在一些實(shí)施例中，非人動(dòng)物表達(dá)人源化hla-dmb、hla-dob、hla-dpb、hla-dqb和/或hla-drb多肽。在一些實(shí)施例中，非人動(dòng)物的基因組中包含人源化mhcii類(lèi)β鏈基因座，該基因座包含編碼人源化mhcii類(lèi)β鏈多肽的核酸序列。在一些實(shí)施例中，人源化mhcii類(lèi)β鏈基因座位于內(nèi)源mhcii類(lèi)β鏈基因座處。在一些實(shí)施例中，非人動(dòng)物的內(nèi)源mhcii類(lèi)β鏈基因座中的一個(gè)或多個(gè)(例如，全部)被替換為人源化mhcii類(lèi)β鏈基因座。在一些實(shí)施例中，經(jīng)遺傳修飾的非人動(dòng)物不表達(dá)完全內(nèi)源物種來(lái)源的mhcii類(lèi)β鏈多肽。

在一些實(shí)施例中，經(jīng)遺傳修飾的非人動(dòng)物表達(dá)人源化cd8α鏈多肽。在一些實(shí)施例中，人源化cd8α鏈多肽為全人源的。在一些實(shí)施例中，人源化cd8α鏈多肽包含人胞外免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域和內(nèi)源物種來(lái)源的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施例中，非人動(dòng)物的基因組中包含人源化cd8α鏈基因座，該基因座包含編碼人源化cd8α鏈多肽的核酸序列。在一些實(shí)施例中，人源化cd8α鏈基因座位于內(nèi)源cd8α鏈基因座處。在一些實(shí)施例中，非人動(dòng)物的內(nèi)源cd8α鏈基因座被替換為人源化cd8α鏈基因座。在一些實(shí)施例中，經(jīng)遺傳修飾的非人動(dòng)物不表達(dá)完全內(nèi)源物種來(lái)源的cd8α鏈多肽。

在一些實(shí)施例中，經(jīng)遺傳修飾的非人動(dòng)物表達(dá)人源化cd8β鏈多肽。在一些實(shí)施例中，人源化cd8β鏈多肽為全人源的。在一些實(shí)施例中，人源化cd8β鏈多肽包含人胞外免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域和內(nèi)源物種來(lái)源的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施例中，非人動(dòng)物的基因組中包含人源化cd8β鏈基因座，該基因座包含編碼人源化cd8β鏈多肽的核酸序列。在一些實(shí)施例中，人源化cd8β鏈基因座位于內(nèi)源cd8β鏈基因座處。在一些實(shí)施例中，非人動(dòng)物的內(nèi)源cd8β鏈基因座被替換為人源化cd8β鏈基因座。在一些實(shí)施例中，經(jīng)遺傳修飾的非人動(dòng)物不表達(dá)完全內(nèi)源物種來(lái)源的cd8β鏈多肽。

在一些實(shí)施例中，經(jīng)遺傳修飾的非人動(dòng)物表達(dá)人源化cd4多肽。在一些實(shí)施例中，人源化cd4多肽為全人源的。在一些實(shí)施例中，人源化cd4多肽包含至少一個(gè)人胞外免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域和內(nèi)源物種來(lái)源的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施例中，人源化cd4多肽包含至少人d1免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域、人d2免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域和人d3免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域，以及內(nèi)源物種來(lái)源的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施例中，人源化cd4多肽包含人d1免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域、人d2免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域、人d3免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域、內(nèi)源物種來(lái)源的d4免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域以及內(nèi)源物種來(lái)源的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施例中，非人動(dòng)物的基因組中包含人源化cd4基因座，該基因座包含編碼人源化cd4多肽的核酸序列。在一些實(shí)施例中，人源化cd4基因座位于內(nèi)源cd4基因座處。在一些實(shí)施例中，非人動(dòng)物的內(nèi)源cd4基因座被替換為人源化cd4基因座。在一些實(shí)施例中，經(jīng)遺傳修飾的非人動(dòng)物不表達(dá)完全內(nèi)源物種來(lái)源的cd4多肽。

在某些方面，本文提供了用于制備表達(dá)car的t細(xì)胞的方法。在一些實(shí)施例中，car對(duì)肽/mhc復(fù)合體(例如，肽/i類(lèi)mhc復(fù)合體和/或肽/ii類(lèi)mhc復(fù)合體)具有抗原特異性。在一些實(shí)施例中，該方法包括使本文所述經(jīng)遺傳修飾的非人動(dòng)物暴露于包含肽的抗原而使得該肽遞呈在該非人動(dòng)物的mhc上的步驟。在一些實(shí)施例中，該方法包括從該經(jīng)遺傳修飾的非人動(dòng)物獲得表達(dá)對(duì)肽/mhc復(fù)合體具有特異性的car的t細(xì)胞的步驟。在一些實(shí)施例中，本文提供了根據(jù)本文所述方法制備的和/或由本文所述方法可獲得的t細(xì)胞。

在某些方面，本文提供了制備表達(dá)car的t細(xì)胞雜交瘤的方法。在一些實(shí)施例中，car對(duì)肽/mhc復(fù)合體(例如，肽/i類(lèi)mhc復(fù)合體和/或肽/ii類(lèi)mhc復(fù)合體)具有抗原特異性。在一些實(shí)施例中，該方法包括使本文所述經(jīng)遺傳修飾的非人動(dòng)物暴露于包含肽的抗原而使得該肽遞呈在該非人動(dòng)物的mhc上的步驟。在一些實(shí)施例中，該方法包括從該經(jīng)遺傳修飾的非人動(dòng)物獲得表達(dá)對(duì)肽/mhc復(fù)合體具有特異性的car的t細(xì)胞的步驟。在一些實(shí)施例中，該方法包括由t細(xì)胞制備t細(xì)胞雜交瘤的步驟。在一些實(shí)施例中，本文提供了根據(jù)本文所提供的方法制備的和/或由本文所提供的方法可獲得的t細(xì)胞雜交瘤。

在某些方面，本文提供了用于制備編碼ig可變結(jié)構(gòu)域(例如，ig重鏈可變結(jié)構(gòu)域、igκ可變結(jié)構(gòu)域和/或igλ可變結(jié)構(gòu)域)的核酸的方法。在一些實(shí)施例中，ig可變結(jié)構(gòu)域在單獨(dú)時(shí)或與另一個(gè)ig可變結(jié)構(gòu)域配對(duì)時(shí)，對(duì)肽/mhc復(fù)合體(例如，肽/i類(lèi)mhc復(fù)合體和/或肽/ii類(lèi)mhc復(fù)合體)具有結(jié)合特異性。在一些實(shí)施例中，該方法包括使本文所述的非人動(dòng)物暴露于包含肽的抗原而使得該肽遞呈在該非人動(dòng)物的mhc上的步驟。在一些實(shí)施例中，該方法包括從該經(jīng)遺傳修飾的非人動(dòng)物獲得表達(dá)對(duì)肽/mhc復(fù)合體具有特異性的car的t細(xì)胞的步驟。在一些實(shí)施例中，該方法包括從t細(xì)胞分離編碼car的ig可變結(jié)構(gòu)域的核酸。在一些實(shí)施例中，將編碼car的每個(gè)可變結(jié)構(gòu)域的核酸從t細(xì)胞分離。在一些實(shí)施例中，本文提供了根據(jù)本文所提供的方法制備的和/或由本文所提供的方法可獲得的編碼ig可變結(jié)構(gòu)域的核酸。

在某些方面，本文提供了用于制備抗體或抗體片段的方法。在一些實(shí)施例中，所述抗體或抗體片段對(duì)肽/mhc復(fù)合體(例如，肽/i類(lèi)mhc復(fù)合體和/或肽/ii類(lèi)mhc復(fù)合體)具有結(jié)合特異性。在一些實(shí)施例中，該方法包括使本文所述的非人動(dòng)物暴露于包含肽的抗原而使得該肽遞呈在該非人動(dòng)物的mhc上的步驟。在一些實(shí)施例中，該方法包括從該經(jīng)遺傳修飾的非人動(dòng)物獲得表達(dá)對(duì)肽/mhc復(fù)合體具有特異性的car的t細(xì)胞。在一些實(shí)施例中，該方法包括從t細(xì)胞分離編碼car的重鏈ig可變結(jié)構(gòu)域和/或輕鏈ig可變結(jié)構(gòu)域的核酸的步驟。在一些實(shí)施例中，該方法包括用一種或多種編碼重鏈ig可變結(jié)構(gòu)域和輕鏈ig可變結(jié)構(gòu)域的載體轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，使得該宿主細(xì)胞表達(dá)包含該重鏈可變結(jié)構(gòu)域和該輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的抗體或抗體片段的步驟。在一些實(shí)施例中，該方法包括將編碼該重鏈ig可變結(jié)構(gòu)域的核酸序列與編碼重鏈ig恒定結(jié)構(gòu)域的核酸序列在宿主細(xì)胞中有效連接，使得該宿主細(xì)胞表達(dá)包含該ig重鏈可變結(jié)構(gòu)域和該ig重鏈恒定結(jié)構(gòu)域的ig重鏈多肽的步驟。在一些實(shí)施例中，該方法包括將編碼該輕鏈ig可變結(jié)構(gòu)域的核酸序列與編碼輕鏈ig恒定結(jié)構(gòu)域的核酸序列在宿主細(xì)胞中有效連接，使得該宿主細(xì)胞表達(dá)包含該ig輕鏈可變結(jié)構(gòu)域和該ig重鏈恒定結(jié)構(gòu)域的ig輕鏈多肽的步驟。在一些實(shí)施例中，該方法包括將編碼該重鏈ig可變結(jié)構(gòu)域的核酸序列與編碼重鏈ig恒定結(jié)構(gòu)域的核酸序列在宿主細(xì)胞中有效連接，并且將編碼該輕鏈ig可變結(jié)構(gòu)域的核酸序列與編碼輕鏈ig恒定結(jié)構(gòu)域的核酸序列在宿主細(xì)胞中有效連接，使得該宿主細(xì)胞表達(dá)如下的抗體的步驟，該抗體具有包含該重鏈ig可變結(jié)構(gòu)域和該重鏈ig恒定結(jié)構(gòu)域的重鏈以及包含該輕鏈ig可變結(jié)構(gòu)域和該輕鏈ig恒定結(jié)構(gòu)域的輕鏈。在一些實(shí)施例中，該方法包括在使得宿主細(xì)胞表達(dá)抗體或抗體片段條件下培養(yǎng)該宿主細(xì)胞的步驟。在一些實(shí)施例中，ig輕鏈和/或重鏈恒定結(jié)構(gòu)域?yàn)槿薸g恒定結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施例中，本文提供了根據(jù)本文所提供的方法制備的和/或由本文所提供的方法可獲得的抗體或抗體片段。

在某些實(shí)施例中，本文提供了治療受試者的癌的方法，該方法包括給受試者施用本文所述的抗體或抗體片段(例如，對(duì)肽/mhc復(fù)合體具有結(jié)合特異性的和/或根據(jù)本文所述方法生成的抗體)。在一些實(shí)施例中，本文所述方法可用于治療任何癌性或癌前期腫瘤?？赏ㄟ^(guò)本文所述方法和組合物治療的癌包括但不限于來(lái)自膀胱、血液、骨、骨髓、腦、乳腺、結(jié)腸、食管、胃腸道、牙齦、頭部、腎、肝、肺、鼻咽、頸部、卵巢、前列腺、皮膚、胃、睪丸、舌頭或子宮的癌細(xì)胞。此外，所述癌具體而言可以是以下組織學(xué)類(lèi)型，但不限于此：瘤，惡性；癌；癌，未分化；巨細(xì)胞和梭形細(xì)胞癌；小細(xì)胞癌；乳頭狀癌；鱗狀細(xì)胞癌；淋巴上皮癌；基底細(xì)胞癌；毛母質(zhì)癌；移行細(xì)胞癌；乳頭狀移行細(xì)胞癌；腺癌；胃泌素瘤，惡性；膽管癌；肝細(xì)胞癌；混合型肝細(xì)胞癌和膽管癌；小梁性腺癌；腺樣囊性癌；腺瘤性息肉內(nèi)腺癌；腺癌，家族性結(jié)腸息肉??；實(shí)體癌；類(lèi)癌瘤，惡性；細(xì)支氣管肺泡腺癌；乳頭狀腺癌；嫌色細(xì)胞癌；嗜酸細(xì)胞癌；嗜酸性腺癌；嗜堿細(xì)胞癌；透明細(xì)胞腺癌；顆粒細(xì)胞癌；濾泡腺癌；乳頭狀和濾泡腺癌；非包囊性硬化性癌；腎上腺皮質(zhì)癌；卵巢內(nèi)膜樣癌；皮膚附屬器癌；大汗腺腺癌；皮脂腺癌；耵聹腺癌；粘液表皮樣癌；囊腺癌；乳頭狀囊腺癌；乳頭狀漿液性囊腺癌；粘液性囊腺癌；粘液性腺癌；印戒細(xì)胞癌；浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌；髓樣癌；小葉癌；炎性癌；佩吉特氏病，乳房；腺泡細(xì)胞癌；腺鱗癌；腺癌伴鱗狀上皮化生；胸腺瘤，惡性；卵巢間質(zhì)腫瘤，惡性；泡膜細(xì)胞瘤，惡性；顆粒細(xì)胞瘤，惡性；男性母細(xì)胞瘤，惡性；塞爾托利細(xì)胞癌；間質(zhì)細(xì)胞瘤，惡性；脂質(zhì)細(xì)胞瘤，惡性；副神經(jīng)節(jié)瘤，惡性；乳房外副神經(jīng)節(jié)瘤，惡性；嗜鉻細(xì)胞瘤；皮膚絲球肉瘤；惡性黑素瘤；無(wú)黑色素性黑素瘤；淺表擴(kuò)散性黑素瘤；巨大色素痣內(nèi)惡性黑素瘤；上皮樣細(xì)胞黑素瘤；藍(lán)痣，惡性；肉瘤；纖維肉瘤；纖維組織細(xì)胞瘤，惡性；粘液肉瘤；脂肪肉瘤；平滑肌肉瘤；橫紋肌肉瘤；胚胎性橫紋肌肉瘤；腺泡型橫紋肌肉瘤；間質(zhì)肉瘤；混合瘤，惡性；苗勒氏管混合瘤；腎母細(xì)胞瘤；肝母細(xì)胞瘤；癌肉瘤；間葉瘤，惡性；布倫納瘤，惡性；葉狀腫瘤，惡性；滑膜肉瘤；間皮瘤，惡性；無(wú)性細(xì)胞瘤；胚胎性癌；畸胎瘤，惡性；卵巢甲狀腺腫，惡性；絨毛膜癌；中腎瘤，惡性；血管肉瘤；血管內(nèi)皮瘤，惡性；卡波氏肉瘤；血管外皮細(xì)胞瘤，惡性；淋巴管肉瘤；骨肉瘤；皮質(zhì)旁成骨肉瘤；軟骨肉瘤；軟骨母細(xì)胞瘤，惡性；間葉性軟骨肉瘤；骨巨細(xì)胞瘤；尤文氏肉瘤；牙源性腫瘤，惡性；成釉細(xì)胞牙肉瘤；成釉細(xì)胞瘤，惡性；成釉細(xì)胞纖維肉瘤；松果體瘤，惡性；脊索瘤；神經(jīng)膠質(zhì)瘤，惡性；室管膜瘤；星形細(xì)胞瘤；原漿性星形細(xì)胞瘤；纖維性星形細(xì)胞瘤；星形母細(xì)胞瘤；膠質(zhì)母細(xì)胞瘤；少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤；成少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤；原始神經(jīng)外胚層瘤；小腦肉瘤；神經(jīng)節(jié)神經(jīng)母細(xì)胞瘤；神經(jīng)母細(xì)胞瘤；視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤；嗅神經(jīng)源性腫瘤；腦膜瘤，惡性；神經(jīng)纖維肉瘤；神經(jīng)鞘瘤，惡性；顆粒細(xì)胞瘤，惡性；惡性淋巴瘤；霍奇金病；霍奇金淋巴瘤；副肉芽腫；惡性淋巴瘤，小淋巴細(xì)胞性；惡性淋巴瘤，大細(xì)胞，彌漫性；惡性淋巴瘤，濾泡性；蕈樣肉芽腫；其他指定的非霍奇金淋巴瘤；惡性組織細(xì)胞增生癥；多發(fā)性骨髓瘤；肥大細(xì)胞肉瘤；免疫增殖性小腸病；白血??；淋巴性白血?。粷{細(xì)胞白血??；紅白血病；淋巴肉瘤細(xì)胞白血??；骨髓性白血??；嗜堿性粒細(xì)胞白血病；嗜酸性粒細(xì)胞白血病；單核細(xì)胞白血?。环蚀蠹?xì)胞白血??；巨核細(xì)胞白血??；骨髓性肉瘤；以及毛細(xì)胞白血病。

在某些實(shí)施例中，本文提供了治療患有感染(包括病毒感染、細(xì)菌感染、蠕蟲(chóng)感染或原蟲(chóng)感染)的受試者的方法，該方法包括給受試者施用本文所述抗體或抗體片段(例如，對(duì)肽/mhc復(fù)合體具有結(jié)合特異性的和/或根據(jù)本文所述方法生成的抗體)。例如，在一些實(shí)施例中，本文提供了治療病毒感染性疾病的方法，所述病毒感染性疾病包括hpv、hbv、丙型肝炎病毒(hcv)、逆轉(zhuǎn)錄病毒如人類(lèi)免疫缺陷病毒(hiv-1和hiv-2)、皰疹病毒如eb病毒(ebv)、巨細(xì)胞病毒(cmv)、hsv-1和hsv-2，以及流感病毒。在一些實(shí)施例中，所治療的病原體是寄生蟲(chóng)，例如瘧原蟲(chóng)。在一些實(shí)施例中，本文提供了對(duì)細(xì)菌性、真菌性和其他病原性疾病的治療，例如曲霉(aspergillus)、布魯線蟲(chóng)(brugia)、念珠菌(candida)、衣原體(chlamydia)、球蟲(chóng)(coccidia)、隱球菌(cryptococcus)、惡絲蟲(chóng)(dirofilaria)、淋球菌(gonococcus)、組織胞漿菌(histoplasma)、利什曼原蟲(chóng)(leishmania)、分枝桿菌(mycobacterium)、支原體(mycoplasma)、草履蟲(chóng)(paramecium)、百日咳菌(pertussis)、瘧原蟲(chóng)(plasmodium)、肺炎球菌(pneumococcus)、肺囊蟲(chóng)(pneumocystis)、立克次氏體(rickettsia)、沙門(mén)氏菌(salmonella)、志賀氏菌(shigella)、葡萄球菌(staphylococcus)、鏈球菌(streptococcus)、弓形蟲(chóng)(toxoplasma)以及霍亂弧菌(vibriocholerae)。示例性物種包括淋病奈瑟氏菌(neisseriagonorrhea)、結(jié)核分枝桿菌(mycobacteriumtuberculosis)、白色念珠菌(candidaalbicans)、熱帶念珠菌(candidatropicalis)、陰道毛滴蟲(chóng)(trichomonasvaginalis)、陰道嗜血桿菌(haemophilusvaginalis)、b族鏈球菌(groupbstreptococcussp.)、人型支原體(microplasmahominis)、杜氏嗜血菌(hemophilusducreyi)、腹股溝肉芽腫(granulomainguinale)、性病性淋巴肉芽腫(lymphopathiavenereum)、梅毒螺旋體(treponemapallidum)、流產(chǎn)布魯氏菌(brucellaabortus)、馬耳他布魯氏菌(brucellamelitensis)、豬布魯氏菌(brucellasuis)、犬布魯氏菌(brucellacanis)、胎兒彎曲菌(campylobacterfetus)、胎兒彎曲菌腸亞種(campylobacterfetusintestinalis)、波蒙納鉤端螺旋體(leptospirapomona)、單核細(xì)胞增多性李斯特菌(listeriamonocytogenes)、綿羊布魯氏菌(brucellaovis)、鸚鵡熱衣原體(chlamydiapsittaci)、胎兒三毛滴蟲(chóng)(trichomonasfoetus)、剛地弓形蟲(chóng)(toxoplasmagondii)、大腸桿菌(escherichiacoli)、馬放線桿菌(actinobacillusequuli)、綿羊流產(chǎn)沙門(mén)菌(salmonellaabortusovis)、馬流產(chǎn)沙門(mén)菌(salmonellaabortusequi)、銅綠假單胞菌(pseudomonasaeruginosa)、馬棒狀桿菌(corynebacteriumequi)、化膿棒狀桿菌(corynebacteriumpyogenes)、精液放線桿菌(actinobaccilusseminis)、牛生殖道支原體(mycoplasmabovigenitalium)、煙曲霉(aspergillusfumigatus)、分枝犁頭霉(absidiaramosa)、馬媾疫錐蟲(chóng)(trypanosomaequiperdum)、駑巴貝斯蟲(chóng)(babesiacaballi)、破傷風(fēng)梭菌(clostridiumtetani)、肉毒梭菌(clostridiumbotulinum)；或真菌，例如巴西副球孢子菌(paracoccidioidesbrasiliensis)；或其他病原體，例如惡性瘧原蟲(chóng)(plasmodiumfalciparum)。

在一些方面，本文提供了用于制備表達(dá)car的細(xì)胞(例如，人細(xì)胞，如人t細(xì)胞)的方法。在一些實(shí)施例中，所述抗體或抗體片段對(duì)肽/mhc復(fù)合體(例如，肽/i類(lèi)mhc復(fù)合體和/或肽/ii類(lèi)mhc復(fù)合體)具有結(jié)合特異性。在一些實(shí)施例中，該方法包括使本文所述的非人動(dòng)物暴露于包含肽的抗原而使得該肽遞呈在該非人動(dòng)物的mhc上的步驟。在一些實(shí)施例中，該方法包括從該經(jīng)遺傳修飾的非人動(dòng)物獲得表達(dá)對(duì)在mhc上遞呈的該肽具有特異性的car的t細(xì)胞。在一些實(shí)施例中，該方法包括從t細(xì)胞分離編碼car的重鏈ig可變結(jié)構(gòu)域和/或輕鏈ig可變結(jié)構(gòu)域的核酸的步驟。在一些實(shí)施例中，該方法包括將編碼該重鏈ig可變結(jié)構(gòu)域的核酸序列與編碼tcr恒定結(jié)構(gòu)域(例如，tcrβ恒定結(jié)構(gòu)域或tcrα恒定結(jié)構(gòu)域)的核酸序列在細(xì)胞(例如，人細(xì)胞，如人t細(xì)胞)中有效連接，使得該細(xì)胞表達(dá)包含該ig重鏈可變結(jié)構(gòu)域和該tcr恒定結(jié)構(gòu)域的car多肽的步驟。在一些實(shí)施例中，該方法包括將編碼該輕鏈ig可變結(jié)構(gòu)域的核酸序列與編碼tcr恒定結(jié)構(gòu)域(例如，tcrβ恒定結(jié)構(gòu)域或tcrα恒定結(jié)構(gòu)域)的核酸序列在細(xì)胞(例如，人細(xì)胞，如人t細(xì)胞)中有效連接，使得該細(xì)胞表達(dá)包含該ig輕鏈可變結(jié)構(gòu)域和該tcr恒定結(jié)構(gòu)域的car多肽的步驟。在一些實(shí)施例中，該方法包括將編碼該重鏈ig可變結(jié)構(gòu)域的核酸序列與第一tcr恒定結(jié)構(gòu)域(例如，tcrβ恒定結(jié)構(gòu)域或tcrα恒定結(jié)構(gòu)域)在細(xì)胞(例如，人細(xì)胞，如人t細(xì)胞)中有效連接，并且將編碼該輕鏈ig可變結(jié)構(gòu)域的核酸序列與編碼第二tcr恒定結(jié)構(gòu)域(例如，如果第一tcr恒定結(jié)構(gòu)域?yàn)閠crα恒定結(jié)構(gòu)域，則其為tcrβ恒定結(jié)構(gòu)域，或者如果第一tcr恒定結(jié)構(gòu)域?yàn)閠crβ恒定結(jié)構(gòu)域，則其為tcrα恒定結(jié)構(gòu)域)的核酸序列在該細(xì)胞中有效連接，使得該細(xì)胞表達(dá)如下的car的步驟，該car具有包含該重鏈ig可變結(jié)構(gòu)域和該第一tcr恒定結(jié)構(gòu)域的第一car鏈多肽以及包含該輕鏈ig可變結(jié)構(gòu)域和該第二tcr恒定結(jié)構(gòu)域的第二car多肽。在一些實(shí)施例中，tcr恒定結(jié)構(gòu)域?yàn)槿藅cr恒定結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施例中，所述細(xì)胞為離體細(xì)胞(例如，離體人細(xì)胞，如離體人t細(xì)胞)。在一些實(shí)施例中，本文提供了根據(jù)本文所提供的方法制備的和/或由本文所提供的方法可獲得的表達(dá)car的細(xì)胞。

在一些實(shí)施例中，任何使本文所述經(jīng)遺傳修飾的非人動(dòng)物暴露于包含肽的抗原而使得該肽遞呈在該非人動(dòng)物的mhc上的方法都可使用。在一些實(shí)施例中，通過(guò)用包含編碼該抗原的核酸序列的病毒(例如，逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒或慢病毒)感染經(jīng)遺傳修飾的非人動(dòng)物，而使該非人動(dòng)物暴露于該抗原。在一些實(shí)施例中，通過(guò)給經(jīng)遺傳修飾的非人動(dòng)物施用編碼該肽的核酸，使得該肽在該非人動(dòng)物中表達(dá)，而使該動(dòng)物暴露于該抗原。在一些實(shí)施例中，給非人動(dòng)物施用編碼單鏈肽/mhc復(fù)合體的核酸。在一些實(shí)施例中，通過(guò)給經(jīng)遺傳修飾的非人動(dòng)物施用肽/mhc復(fù)合體，而使經(jīng)遺傳修飾的非人動(dòng)物暴露于該抗原。在一些實(shí)施例中，給非人動(dòng)物施用單鏈肽/mhc復(fù)合體(例如，單鏈胞外mhc/β-2-微球蛋白/肽蛋白復(fù)合體)。在一些實(shí)施例中，肽/mhc復(fù)合體作為多聚體(例如，四聚體)施用。在一些實(shí)施例中，肽/mhc復(fù)合體存在于細(xì)胞(例如，抗原遞呈細(xì)胞，如巨噬細(xì)胞或樹(shù)突細(xì)胞)的表面上。在一些實(shí)施例中，b7.1、b7.2或icos-l存在于該細(xì)胞的表面上。在一些實(shí)施例中，細(xì)胞表達(dá)t細(xì)胞刺激細(xì)胞因子(例如，il-1、il-2、il-4、il-6、il-12、il-13、ifn-γ、tnf-α、tgf-β、ifn-α和/或ifn-β)。

在本文所述方法的一些實(shí)施例中，可使用任何方法來(lái)分離編碼ig可變結(jié)構(gòu)域的核酸。在一些實(shí)施例中，分離該核酸的步驟包括由t細(xì)胞制備t細(xì)胞雜交瘤并且從該t細(xì)胞雜交瘤分離該核酸。在一些實(shí)施例中，使用核酸擴(kuò)增方法(例如，pcr)分離核酸。在一些實(shí)施例中，通過(guò)對(duì)t細(xì)胞或t細(xì)胞雜交瘤的car基因座中的重排ig可變區(qū)基因進(jìn)行測(cè)序并合成包含該重排ig可變區(qū)基因的核酸序列來(lái)分離該核酸。

在某些方面，本文提供了由本文所述經(jīng)遺傳修飾的非人動(dòng)物獲得的或可獲得的表達(dá)car的細(xì)胞。在一些實(shí)施例中，該細(xì)胞為t細(xì)胞。在一些實(shí)施例中，該細(xì)胞為t細(xì)胞雜交瘤。在一些實(shí)施例中，car對(duì)肽/mhc復(fù)合體具有結(jié)合特異性。

在某些方面，本文提供了由本文所述經(jīng)遺傳修飾的非人動(dòng)物或細(xì)胞獲得的或可獲得的、包含重排ig可變區(qū)基因(例如，重鏈ig可變區(qū)基因或輕鏈重鏈可變區(qū)基因)的核酸。在一些實(shí)施例中，該核酸還包含tcr恒定區(qū)基因(例如，tcrα恒定區(qū)基因或tcrβ恒定區(qū)基因)。在一些實(shí)施例中，該核酸編碼car多肽。在一些實(shí)施例中，ig可變區(qū)基因編碼對(duì)肽/mhc復(fù)合體具有結(jié)合特異性的ig可變結(jié)構(gòu)域。

在某些方面，本文提供了由本文所述經(jīng)遺傳修飾的非人動(dòng)物或細(xì)胞獲得的或可獲得的car或car多肽。在一些實(shí)施例中，該car或car多肽對(duì)肽/mhc復(fù)合體具有結(jié)合特異性。

在某些方面，本文提供了在其基因組中包含car基因座的非人胚胎干(es)細(xì)胞(例如，嚙齒動(dòng)物es細(xì)胞，如小鼠es細(xì)胞或大鼠es細(xì)胞)。在一些實(shí)施例中，該car基因座包含具有非重排人ig可變區(qū)基因區(qū)段(例如，非重排v、d和j重鏈基因區(qū)段、非重排vκ和jκ輕鏈基因區(qū)段、或者非重排vλ和jλ輕鏈基因區(qū)段)的非重排可變區(qū)基因座以及tcr恒定區(qū)基因(例如，tcrα恒定區(qū)基因或tcrβ恒定區(qū)基因)。在一些實(shí)施例中，非重排ig可變區(qū)基因區(qū)段有效連接至tcr恒定區(qū)基因。在一些實(shí)施例中，非重排ig可變區(qū)基因區(qū)段為人ig可變區(qū)基因區(qū)段。在一些實(shí)施例中，tcr恒定區(qū)基因?yàn)閮?nèi)源物種來(lái)源。在一些實(shí)施例中，非重排可變區(qū)基因座包含ig可變區(qū)基因間序列(例如，重鏈基因間序列、κ基因間序列或λ基因間序列)。在一些實(shí)施例中，ig可變區(qū)基因間序列為人序列、小鼠序列或大鼠序列。在一些實(shí)施例中，非重排可變區(qū)基因座包含tcr可變區(qū)基因間序列(例如，tcrβ基因間序列或tcrα基因間序列)。在一些實(shí)施例中，tcr可變區(qū)基因間序列為人序列、小鼠序列或大鼠序列。

在一些方面，本文提供了在其基因組中包含第一car基因座和第二car基因座的非人es細(xì)胞(例如，嚙齒動(dòng)物es細(xì)胞，如小鼠es細(xì)胞或大鼠es細(xì)胞)。在一些實(shí)施例中，第一car基因座包含具有非重排人igvh、dh和jh基因區(qū)段的非重排可變區(qū)基因座以及具有內(nèi)源物種來(lái)源的tcrβ恒定區(qū)基因的恒定區(qū)基因座，其中人非重排igvh、dh和jh基因區(qū)段有效連接至tcrβ恒定區(qū)基因。在一些實(shí)施例中，第一car基因座包含具有ig重鏈可變區(qū)基因(通用重鏈可變區(qū))的重排可變區(qū)基因座以及具有內(nèi)源物種來(lái)源的tcrβ恒定區(qū)基因的恒定區(qū)基因座。在一些實(shí)施例中，第二car基因座包含具有非重排人igvκ和jκ的非重排可變區(qū)基因座以及具有內(nèi)源物種來(lái)源的tcrα恒定區(qū)基因的恒定區(qū)基因座，其中人非重排igvκ和jκ基因區(qū)段有效連接至tcrα恒定區(qū)基因。在一些實(shí)施例中，第二car基因座包含具有非重排人igvλ和jλ的非重排可變區(qū)基因座以及具有內(nèi)源物種來(lái)源的tcrα恒定區(qū)基因的恒定區(qū)基因座，其中人非重排igvλ和jλ基因區(qū)段有效連接至tcrα恒定區(qū)基因。在一些實(shí)施例中，第二car基因座包含具有ig輕鏈κ或λ可變區(qū)基因(通用輕鏈可變區(qū))的重排可變區(qū)基因座以及具有內(nèi)源物種來(lái)源的tcrα恒定區(qū)基因的恒定區(qū)基因座。在一些實(shí)施例中，非重排可變區(qū)基因座中的一個(gè)或兩個(gè)包含ig可變區(qū)基因間序列(例如，重鏈基因間序列、κ基因間序列或λ基因間序列)。在一些實(shí)施例中，ig可變區(qū)基因間序列為人序列、小鼠序列或大鼠序列。在一些實(shí)施例中，非重排可變區(qū)基因座中的一個(gè)或兩個(gè)包含tcr可變區(qū)基因間序列(例如，tcrβ基因間序列或tcrα基因間序列)。在一些實(shí)施例中，tcr可變區(qū)基因間序列為人序列、小鼠序列或大鼠序列。

在本文所述非人動(dòng)物es細(xì)胞的一些實(shí)施例中，car基因座位于內(nèi)源tcr基因座(例如，內(nèi)源tcrα基因座或內(nèi)源tcrβ基因座)處。在一些實(shí)施例中，car基因座的tcr恒定區(qū)基因?yàn)閮?nèi)源tcr恒定區(qū)基因。在一些實(shí)施例中，內(nèi)源tcrα基因座和/或tcrβ基因座的可變區(qū)中的全部或一部分被替換為ig基因座的可變區(qū)中的全部或一部分，從而形成car基因座。在一些實(shí)施例中，整個(gè)tcr可變區(qū)被替換為ig可變區(qū)。在一些實(shí)施例中，tcr可變區(qū)基因區(qū)段被替換為ig可變區(qū)基因區(qū)段。例如，在一些實(shí)施例中，內(nèi)源tcrβ基因座的v、d和j基因區(qū)段被替換為ig重鏈v、d和j基因區(qū)段。在一些實(shí)施例中，內(nèi)源tcrα基因座的v和j基因區(qū)段被替換為ig輕鏈(例如，κ或λ)v和j基因區(qū)段。

在一些實(shí)施例中，非人es細(xì)胞不包含功能性tcr基因座。在一些實(shí)施例中，非人es細(xì)胞不包含功能性tcrα鏈基因座和/或功能性tcrβ鏈基因座。在一些實(shí)施例中，內(nèi)源tcrα基因座和/或tcrβ基因座在經(jīng)遺傳修飾的非人es細(xì)胞中是失活的(例如，通過(guò)使內(nèi)源基因座中的全部或一部分缺失而失活)。在一些實(shí)施例中，非人es細(xì)胞不包含功能性tcrδ基因座。

在本文所述非人動(dòng)物es細(xì)胞的一些實(shí)施例中，car基因座的非重排可變區(qū)包含一種或多種胰蛋白酶原(try)基因(例如，通常存在于tcrβ可變區(qū)基因座中的try基因和/或假基因)。在一些實(shí)施例中，try基因?yàn)閮?nèi)源物種來(lái)源。在一些實(shí)施例中，try基因?yàn)樾∈髏ry基因。在一些實(shí)施例中，小鼠try基因選自try1、try2、try3、try4、try5、try6、try7、try8、try9、try10、try11、try12、try13、try14、try15、try16、try17、try18、try19和try20。在一些實(shí)施例中，一種或多種try基因位于非重排可變區(qū)的v區(qū)段的上游。在一些實(shí)施例中，一種或多種try基因位于非重排可變區(qū)的v區(qū)段的下游(例如，v區(qū)段的下游以及d和/或j區(qū)段的上游)。在一些實(shí)施例中，try1-7位于非重排可變區(qū)的v區(qū)段的上游，并且try8-20位于非重排可變區(qū)的v區(qū)段的下游(例如，v區(qū)段的下游以及d和/或j區(qū)段的上游)。

在一些實(shí)施例中，非人es細(xì)胞的基因組中包含編碼人源化mhci類(lèi)α鏈多肽的基因座。在一些實(shí)施例中，人源化mhci類(lèi)α鏈多肽為全人源的。在一些實(shí)施例中，人源化mhci類(lèi)α鏈多肽包含人胞外結(jié)構(gòu)域(人α1、α2和α3結(jié)構(gòu)域)和內(nèi)源物種來(lái)源的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施例中，人源化i類(lèi)α鏈多肽為hla-a、hla-b、hla-c、hla-e、hla-f、hla-g、hla-k或hla-l。在一些實(shí)施例中，非人es細(xì)胞包含編碼人源化hla-a、hla-b、hla-c、hla-e、hla-f、hla-g、hla-k和/或hla-l多肽的基因座。在一些實(shí)施例中，人源化mhci類(lèi)α鏈基因座位于內(nèi)源mhci類(lèi)α鏈基因座處。在一些實(shí)施例中，非人es細(xì)胞的內(nèi)源mhci類(lèi)α鏈基因座中的一個(gè)或多個(gè)(例如，全部)被全部或部分地替換為人源化mhci類(lèi)α鏈基因座。在一些實(shí)施例中，非人es細(xì)胞不包含功能性?xún)?nèi)源mhci類(lèi)α鏈基因座(例如，編碼完全內(nèi)源物種來(lái)源的mhci類(lèi)α鏈的基因座)。

在一些實(shí)施例中，非人es細(xì)胞的基因組中包含編碼人源化β-2-微球蛋白多肽的基因座。在一些實(shí)施例中，人源化β-2-微球蛋白多肽為全人源的。在一些實(shí)施例中，人源化β-2-微球蛋白基因座位于內(nèi)源β-2-微球蛋白基因座處。在一些實(shí)施例中，內(nèi)源β-2-微球蛋白基因座被全部或部分地替換為人源化β-2-微球蛋白基因座。在一些實(shí)施例中，非人es細(xì)胞的基因組中不包含功能性?xún)?nèi)源β-2-微球蛋白基因座(例如，編碼完全內(nèi)源物種來(lái)源的β-2-微球蛋白多肽的基因座)。

在一些實(shí)施例中，非人es細(xì)胞的基因組中包含編碼人源化mhcii類(lèi)α鏈多肽的基因座。在一些實(shí)施例中，人源化mhcii類(lèi)α鏈多肽為全人源的。在一些實(shí)施例中，人源化mhcii類(lèi)α鏈多肽包含人胞外結(jié)構(gòu)域和內(nèi)源物種來(lái)源的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施例中，人源化ii類(lèi)α鏈多肽為hla-dma、hla-doa、hla-dpa、hla-dqa或hla-dra。在一些實(shí)施例中，非人es細(xì)胞包含編碼人源化hla-dma、hla-doa、hla-dpa、hla-dqa和/或hla-dra多肽的基因座。在一些實(shí)施例中，人源化mhcii類(lèi)α鏈基因座位于內(nèi)源mhcii類(lèi)α鏈基因座處。在一些實(shí)施例中，非人es細(xì)胞的內(nèi)源mhcii類(lèi)α鏈基因座中的一個(gè)或多個(gè)(例如，全部)被全部或部分地替換為人源化mhcii類(lèi)α鏈基因座。在一些實(shí)施例中，經(jīng)遺傳修飾的非人es細(xì)胞的基因組中不包含功能性?xún)?nèi)源mhcii類(lèi)α鏈基因座(例如，編碼完全內(nèi)源物種來(lái)源的mhcii類(lèi)α鏈的基因座)。

在一些實(shí)施例中，非人es細(xì)胞的基因組中包含編碼人源化mhcii類(lèi)β鏈多肽的基因座。在一些實(shí)施例中，人源化mhcii類(lèi)β鏈多肽為全人源的。在一些實(shí)施例中，人源化mhcii類(lèi)β鏈多肽包含人胞外結(jié)構(gòu)域和內(nèi)源物種來(lái)源的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施例中，人源化ii類(lèi)β鏈多肽為hla-dmb、hla-dob、hla-dpb、hla-dqb或hla-drb。在一些實(shí)施例中，非人es細(xì)胞的基因組中包含編碼人源化hla-dmb、hla-dob、hla-dpb、hla-dqb和/或hla-drb多肽的基因座。在一些實(shí)施例中，人源化mhcii類(lèi)β鏈基因座位于內(nèi)源mhcii類(lèi)β鏈基因座處。在一些實(shí)施例中，非人es細(xì)胞的內(nèi)源mhcii類(lèi)β鏈基因座中的一個(gè)或多個(gè)(例如，全部)被全部或部分地替換為人源化mhcii類(lèi)β鏈基因座。在一些實(shí)施例中，非人es細(xì)胞的基因組中不包含功能性?xún)?nèi)源mhcii類(lèi)β鏈基因座(例如，編碼完全內(nèi)源物種來(lái)源的mhcii類(lèi)β鏈的基因座)。

在一些實(shí)施例中，非人es細(xì)胞的基因組中包含編碼人源化cd8α鏈多肽的基因座。在一些實(shí)施例中，人源化cd8α鏈多肽為全人源的。在一些實(shí)施例中，人源化cd8α鏈多肽包含人胞外免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域和內(nèi)源物種來(lái)源的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施例中，人源化cd8α鏈基因座位于內(nèi)源cd8α鏈基因座處。在一些實(shí)施例中，非人es細(xì)胞的內(nèi)源cd8α鏈基因座被全部或部分地替換為人源化cd8α鏈基因座。在一些實(shí)施例中，非人es細(xì)胞的基因組中不包含功能性?xún)?nèi)源cd8α鏈基因座(例如，編碼完全內(nèi)源物種來(lái)源的cd8α鏈的基因座)。

在一些實(shí)施例中，非人es細(xì)胞的基因組中包含編碼人源化cd8β鏈多肽的基因座。在一些實(shí)施例中，人源化cd8β鏈多肽為全人源的。在一些實(shí)施例中，人源化cd8β鏈多肽包含人胞外免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域和內(nèi)源物種來(lái)源的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施例中，人源化cd8β鏈基因座位于內(nèi)源cd8β鏈基因座處。在一些實(shí)施例中，非人es細(xì)胞的內(nèi)源cd8β鏈基因座被全部或部分地替換為人源化cd8β鏈基因座。在一些實(shí)施例中，非人es細(xì)胞的基因組中不包含功能性?xún)?nèi)源cd8β鏈基因座(例如，編碼完全內(nèi)源物種來(lái)源的cd8β鏈的基因座)。

在一些實(shí)施例中，非人es細(xì)胞的基因組中包含編碼人源化cd4多肽的基因座。在一些實(shí)施例中，人源化cd4多肽為全人源的。在一些實(shí)施例中，人源化cd4多肽包含至少人d1免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域、人d2免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域和人d3免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域，以及內(nèi)源物種來(lái)源的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施例中，人源化cd4多肽包含人d1免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域、人d2免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域、人d3免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域、內(nèi)源物種來(lái)源的d4免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域以及內(nèi)源物種來(lái)源的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施例中，人源化cd4基因座位于內(nèi)源cd4基因座處。在一些實(shí)施例中，非人es細(xì)胞的內(nèi)源cd4基因座被全部或部分地替換為人源化cd4基因座。在一些實(shí)施例中，非人es細(xì)胞的基因組中不包含功能性?xún)?nèi)源cd4鏈基因座(例如，編碼完全內(nèi)源物種來(lái)源的cd4鏈的基因座)。

在某些方面，本文提供了使用本文所述es細(xì)胞生成的或由本文所述es細(xì)胞可獲得的經(jīng)遺傳修飾的非人動(dòng)物。在一些實(shí)施例中，經(jīng)遺傳修飾的非人動(dòng)物為嚙齒動(dòng)物。在一些實(shí)施例中，經(jīng)遺傳修飾的非人動(dòng)物為小鼠或大鼠。在一些實(shí)施例中，本文提供了包含本文所述非人es細(xì)胞的非人胚胎。

在某些方面，本文提供了用于制備表達(dá)car和/或car多肽的經(jīng)遺傳修飾的非人動(dòng)物的方法。在某些實(shí)施例中，該方法包括使用本文所述非人es細(xì)胞生成非人動(dòng)物。在某些實(shí)施例中，非人es細(xì)胞為小鼠非人es細(xì)胞。在一些實(shí)施例中，該方法包括使用如美國(guó)專(zhuān)利no.7,294,754中所述的方法，該專(zhuān)利據(jù)此以引用方式并入。在某些實(shí)施例中，本文提供了使用本文所提供的方法生成的或由本文所提供的方法可獲得的經(jīng)遺傳修飾的非人動(dòng)物。

在某些方面，本文提供了car基因座，該car基因座包含具有非重排人ig可變區(qū)基因區(qū)段的非重排可變區(qū)基因座；以及具有嚙齒動(dòng)物tcr恒定區(qū)基因(例如，小鼠tcr恒定區(qū)基因或大鼠tcr恒定區(qū)基因)的恒定區(qū)基因座，其中人非重排ig可變區(qū)基因區(qū)段有效連接至tcr恒定區(qū)基因。在一些實(shí)施例中，非重排ig可變區(qū)基因區(qū)段為人ig重鏈(igh)可變區(qū)基因區(qū)段。在一些實(shí)施例中，非重排ig可變區(qū)基因區(qū)段為人ig輕鏈(igl)可變區(qū)基因區(qū)段(例如，igκ基因區(qū)段或igλ基因區(qū)段)。在一些實(shí)施例中，tcr恒定區(qū)基因?yàn)閠crα恒定區(qū)基因。在一些實(shí)施例中，car基因座位于內(nèi)源tcrα基因座處。在一些實(shí)施例中，非重排人ig可變區(qū)基因區(qū)段替換內(nèi)源tcrα可變區(qū)基因區(qū)段。在一些實(shí)施例中，tcrα恒定區(qū)基因?yàn)閮?nèi)源tcrα恒定區(qū)基因。在一些實(shí)施例中，tcr恒定區(qū)基因?yàn)閠crβ恒定區(qū)基因。在一些實(shí)施例中，car基因座位于內(nèi)源tcrβ基因座處。在一些實(shí)施例中，非重排人ig可變區(qū)基因區(qū)段替換內(nèi)源tcrβ可變區(qū)基因區(qū)段。在一些實(shí)施例中，tcrβ恒定區(qū)基因?yàn)閮?nèi)源tcrβ恒定區(qū)基因。在一些實(shí)施例中，非重排可變區(qū)基因座還包含一種或多種胰蛋白酶原基因。在一些實(shí)施例中，非重排可變區(qū)基因座包含ig可變區(qū)基因間序列(例如，重鏈基因間序列、κ基因間序列或λ基因間序列)。在一些實(shí)施例中，ig可變區(qū)基因間序列為人序列、小鼠序列或大鼠序列。在一些實(shí)施例中，非重排可變區(qū)基因座包含tcr可變區(qū)基因間序列(例如，tcrβ基因間序列或tcrα基因間序列)。在一些實(shí)施例中，tcr可變區(qū)基因間序列為人序列、小鼠序列或大鼠序列。

在某些方面，本文提供了car基因座，該car基因座包含具有非重排人igvh、dh和jh基因區(qū)段的非重排可變區(qū)基因座以及具有嚙齒動(dòng)物tcrβ恒定區(qū)基因(例如，大鼠tcrβ恒定區(qū)基因或小鼠tcrβ恒定區(qū)基因)的恒定區(qū)基因座，其中人非重排igvh、dh和jh基因區(qū)段有效連接至tcrβ恒定區(qū)基因。在某些實(shí)施例中，car基因座位于內(nèi)源tcrβ基因座處。在某些實(shí)施例中，非重排人igvh、dh和jh基因區(qū)段替換內(nèi)源tcrβ可變區(qū)基因區(qū)段。在一些實(shí)施例中，tcrβ恒定區(qū)基因?yàn)閮?nèi)源tcrβ恒定區(qū)基因。在一些實(shí)施例中，非重排可變區(qū)基因座還包含一種或多種胰蛋白酶原基因。在一些實(shí)施例中，非重排可變區(qū)基因座包含ig可變區(qū)基因間序列(例如，重鏈基因間序列、κ基因間序列或λ基因間序列)。在一些實(shí)施例中，ig可變區(qū)基因間序列為人序列、小鼠序列或大鼠序列。在一些實(shí)施例中，非重排可變區(qū)基因座包含tcr可變區(qū)基因間序列(例如，tcrβ基因間序列或tcrα基因間序列)。在一些實(shí)施例中，tcr可變區(qū)基因間序列為人序列、小鼠序列或大鼠序列。

在某些方面，本文提供了car基因座，該car基因座包含具有非重排人igvκ和jκ基因區(qū)段的非重排可變區(qū)基因座以及具有嚙齒動(dòng)物tcrα恒定區(qū)基因的恒定區(qū)基因座，其中人非重排igvκ和jκ基因區(qū)段有效連接至tcrα恒定區(qū)基因。在一些實(shí)施例中，car基因座位于內(nèi)源tcrα基因座處。在一些實(shí)施例中，非重排人igvκ和jκ基因區(qū)段替換內(nèi)源tcrα可變區(qū)基因區(qū)段。在一些實(shí)施例中，tcrα恒定區(qū)基因?yàn)閮?nèi)源tcrα恒定區(qū)基因。在一些實(shí)施例中，car基因座不包含功能性tcrδ基因座；在一些實(shí)施例中，tcrδ基因座被缺失。

在某些方面，本文提供了在其生殖系中包含本文所述car基因座的嚙齒動(dòng)物(例如，大鼠或小鼠)。在一些方面，本文提供了在其生殖系中包含本文所述car基因座的嚙齒動(dòng)物細(xì)胞(例如，大鼠細(xì)胞或小鼠細(xì)胞)。在一些實(shí)施例中，該細(xì)胞為es細(xì)胞。在一些實(shí)施例中，本文提供了編碼本文所述car基因座的核酸(例如，載體)。在一些實(shí)施例中，非重排可變區(qū)基因座包含ig可變區(qū)基因間序列(例如，重鏈基因間序列、κ基因間序列或λ基因間序列)。在一些實(shí)施例中，ig可變區(qū)基因間序列為人序列、小鼠序列或大鼠序列。在一些實(shí)施例中，非重排可變區(qū)基因座包含tcr可變區(qū)基因間序列(例如，tcrβ基因間序列或tcrα基因間序列)。在一些實(shí)施例中，tcr可變區(qū)基因間序列為人序列、小鼠序列或大鼠序列。

在某些方面，本文提供了制備表達(dá)本文所述car的非人動(dòng)物(例如，小鼠或大鼠)的方法。在某些實(shí)施例中，該方法包括對(duì)非人動(dòng)物進(jìn)行遺傳修飾，使得其生殖系中包含本文所述的car基因座。在一些實(shí)施例中，該方法包括對(duì)非人es細(xì)胞(例如，小鼠es細(xì)胞或大鼠es細(xì)胞)進(jìn)行遺傳修飾，使得其包含本文所述的car基因座。在一些實(shí)施例中，該方法包括向非人es細(xì)胞中引入包含有效連接至tcrα恒定區(qū)的非重排ig輕鏈基因區(qū)段(輕鏈v和j區(qū)段)的car基因座，并且向非人es細(xì)胞中引入包含有效連接至tcrβ恒定區(qū)的非重排ig重鏈基因區(qū)段(重鏈v、d和j區(qū)段)的car基因座。在一些實(shí)施例中，該方法包括對(duì)非人動(dòng)物es細(xì)胞的tcrα基因座進(jìn)行修飾，以包含有效連接至tcrα恒定區(qū)的非重排ig輕鏈基因區(qū)段(輕鏈v和j區(qū)段)，并且對(duì)非人動(dòng)物es細(xì)胞的tcrβ基因座進(jìn)行修飾，以包含有效連接至tcrβ恒定區(qū)的非重排ig重鏈基因區(qū)段(重鏈v、d和j區(qū)段)。

在某些方面，本文提供了嵌合抗原受體(car)，該嵌合抗原受體包含具有ig重鏈可變結(jié)構(gòu)域和tcrβ恒定結(jié)構(gòu)域的第一car多肽，以及具有ig輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(例如，igκ可變結(jié)構(gòu)域或igλ可變結(jié)構(gòu)域)和tcrα恒定結(jié)構(gòu)域的第二car多肽，其中該car對(duì)肽/mhc復(fù)合體具有結(jié)合特異性(參見(jiàn)例如圖1)。在一些實(shí)施例中，肽/mhc復(fù)合體為肽/i類(lèi)mhc復(fù)合體。在一些實(shí)施例中，肽/mhc復(fù)合體為肽/ii類(lèi)mhc復(fù)合體。在一些實(shí)施例中，ig重鏈可變結(jié)構(gòu)域和/或ig輕鏈可變結(jié)構(gòu)域?yàn)槿薸g可變結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施例中，tcrβ恒定結(jié)構(gòu)域和/或tcrα恒定結(jié)構(gòu)域?yàn)閲X動(dòng)物恒定結(jié)構(gòu)域(例如，大鼠或小鼠恒定結(jié)構(gòu)域)。在一些實(shí)施例中，tcrβ恒定結(jié)構(gòu)域和/或tcrα恒定結(jié)構(gòu)域?yàn)槿撕愣ńY(jié)構(gòu)域。

在某些方面，本文提供了嵌合抗原受體(car)，該嵌合抗原受體包含具有ig重鏈可變結(jié)構(gòu)域和tcrα恒定結(jié)構(gòu)域的第一car多肽，以及具有ig輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(例如，igκ可變結(jié)構(gòu)域或igλ可變結(jié)構(gòu)域)和tcrβ恒定結(jié)構(gòu)域的第二car多肽，其中該car對(duì)肽/mhc復(fù)合體具有結(jié)合特異性(參見(jiàn)例如圖2)。在一些實(shí)施例中，肽/mhc復(fù)合體為肽/i類(lèi)mhc復(fù)合體。在一些實(shí)施例中，肽/mhc復(fù)合體為肽/ii類(lèi)mhc復(fù)合體。在一些實(shí)施例中，ig重鏈可變結(jié)構(gòu)域和/或ig輕鏈可變結(jié)構(gòu)域?yàn)槿薸g可變結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施例中，tcrβ恒定結(jié)構(gòu)域和/或tcrα恒定結(jié)構(gòu)域?yàn)閲X動(dòng)物恒定結(jié)構(gòu)域(例如，大鼠或小鼠恒定結(jié)構(gòu)域)。在一些實(shí)施例中，tcrβ恒定結(jié)構(gòu)域和/或tcrα恒定結(jié)構(gòu)域?yàn)槿撕愣ńY(jié)構(gòu)域。

在某些方面，本文提供了表達(dá)本文所述car的細(xì)胞或非人動(dòng)物。在一些實(shí)施例中，該細(xì)胞為t細(xì)胞。在一些實(shí)施例中，該細(xì)胞或動(dòng)物為人或嚙齒動(dòng)物(例如，大鼠或小鼠)。在某些實(shí)施例中，本文提供了包含本文所述細(xì)胞的非人動(dòng)物(例如，嚙齒動(dòng)物，如大鼠或小鼠)。

在一些方面，本文提供了在受試者中誘導(dǎo)對(duì)肽/mhc復(fù)合體的免疫應(yīng)答的方法。在一些實(shí)施例中，該方法包括給受試者施用表達(dá)car的細(xì)胞(例如，人t細(xì)胞，如cd4t細(xì)胞或cd8t細(xì)胞)，該car包含具有人ig重鏈可變結(jié)構(gòu)域和人tcrβ恒定結(jié)構(gòu)域的第一car多肽，以及具有人ig輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(例如，igκ可變結(jié)構(gòu)域或igλ可變結(jié)構(gòu)域)和人tcrα恒定結(jié)構(gòu)域的第二car多肽，其中該car對(duì)肽/mhc復(fù)合體具有結(jié)合特異性。在一些實(shí)施例中，肽/mhc復(fù)合體為肽/i類(lèi)mhc復(fù)合體。在一些實(shí)施例中，肽/mhc復(fù)合體為肽/ii類(lèi)mhc復(fù)合體。

在一些方面，本文提供了在受試者(例如，人受試者)中誘導(dǎo)對(duì)肽/mhc復(fù)合體的免疫應(yīng)答的方法。在一些實(shí)施例中，該方法包括給受試者施用表達(dá)car的細(xì)胞(例如，人t細(xì)胞，如cd4t細(xì)胞或cd8t細(xì)胞)，該car包含具有人ig重鏈可變結(jié)構(gòu)域和人tcrα恒定結(jié)構(gòu)域的第一car多肽，以及具有人ig輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(例如，igκ可變結(jié)構(gòu)域或igλ可變結(jié)構(gòu)域)和人tcrβ恒定結(jié)構(gòu)域的第二car多肽，其中該car對(duì)肽/mhc復(fù)合體具有結(jié)合特異性。在一些實(shí)施例中，肽/mhc復(fù)合體為肽/i類(lèi)mhc復(fù)合體。在一些實(shí)施例中，肽/mhc復(fù)合體為肽/ii類(lèi)mhc復(fù)合體。

在某些方面，本文提供了在受試者(例如，人受試者)中誘導(dǎo)對(duì)肽/mhc復(fù)合體的免疫應(yīng)答的方法。在一些實(shí)施例中，該方法包括從該受試者分離t細(xì)胞(例如，cd4t細(xì)胞或cd8t細(xì)胞)。在一些實(shí)施例中，該方法包括誘導(dǎo)t細(xì)胞表達(dá)car，該car包含具有人ig重鏈可變結(jié)構(gòu)域和人tcrβ恒定結(jié)構(gòu)域的第一car多肽，以及具有人ig輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(例如，igκ可變結(jié)構(gòu)域或igλ可變結(jié)構(gòu)域)和人tcrα恒定結(jié)構(gòu)域的第二car多肽，其中該car對(duì)肽/mhc復(fù)合體具有結(jié)合特異性。在一些實(shí)施例中，該方法包括給受試者施用t細(xì)胞。在一些實(shí)施例中，該方法包括用包含編碼第一car多肽的核酸序列的第一載體以及包含編碼第二car多肽的核酸序列的第二載體轉(zhuǎn)染t細(xì)胞。在一些實(shí)施例中，該方法包括用包含編碼第一car多肽的核酸序列以及編碼第二car多肽的核酸序列的載體轉(zhuǎn)染t細(xì)胞。在一些實(shí)施例中，該方法包括抑制t細(xì)胞表達(dá)內(nèi)源tcrα和/或tcrβ的步驟。

在某些方面，本文提供了在受試者(例如，人受試者)中誘導(dǎo)對(duì)肽/mhc復(fù)合體的免疫應(yīng)答的方法。在一些實(shí)施例中，該方法包括從該受試者分離t細(xì)胞(例如，cd4t細(xì)胞或cd8t細(xì)胞)。在一些實(shí)施例中，該方法包括誘導(dǎo)t細(xì)胞表達(dá)car，該car包含具有人ig重鏈可變結(jié)構(gòu)域和人tcrα恒定結(jié)構(gòu)域的第一car多肽，以及具有人ig輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(例如，igκ可變結(jié)構(gòu)域或igλ可變結(jié)構(gòu)域)和人tcrβ恒定結(jié)構(gòu)域的第二car多肽，其中該car對(duì)肽/mhc復(fù)合體具有結(jié)合特異性。在一些實(shí)施例中，該方法包括給受試者施用t細(xì)胞。在一些實(shí)施例中，該方法包括用包含編碼第一car多肽的核酸序列的第一載體以及包含編碼第二car多肽的核酸序列的第二載體轉(zhuǎn)染t細(xì)胞。在一些實(shí)施例中，該方法包括用包含編碼第一car多肽的核酸序列以及編碼第二car多肽的核酸序列的載體轉(zhuǎn)染t細(xì)胞。在一些實(shí)施例中，該方法包括抑制t細(xì)胞表達(dá)內(nèi)源tcrα和/或tcrβ的步驟。

在某些方面，本文提供了一種核酸組合物，該核酸組合物包含編碼具有ig重鏈可變結(jié)構(gòu)域和tcrβ恒定結(jié)構(gòu)域的第一car多肽的第一核酸序列，以及編碼具有ig輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(例如，igκ可變結(jié)構(gòu)域或igλ可變結(jié)構(gòu)域)和tcrα恒定結(jié)構(gòu)域的第二car多肽的第二核酸序列，其中包含第一car多肽和第二car多肽的car對(duì)肽/mhc復(fù)合體具有結(jié)合特異性。在某些實(shí)施例中，ig重鏈可變結(jié)構(gòu)域和/或ig輕鏈可變結(jié)構(gòu)域?yàn)槿薸g可變結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施例中，tcrβ恒定結(jié)構(gòu)域和/或tcrα恒定結(jié)構(gòu)域?yàn)閲X動(dòng)物恒定結(jié)構(gòu)域(例如，大鼠恒定結(jié)構(gòu)域或小鼠恒定結(jié)構(gòu)域)。在一些實(shí)施例中，tcrβ恒定結(jié)構(gòu)域和/或tcrα恒定結(jié)構(gòu)域?yàn)槿撕愣ńY(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施例中，第一核酸序列和第二核酸序列位于單一核酸分子上。在一些實(shí)施例中，第一核酸序列和第二核酸序列位于分別的核酸分子上。

在某些方面，本文提供了一種核酸組合物，該核酸組合物包含編碼具有ig重鏈可變結(jié)構(gòu)域和tcrα恒定結(jié)構(gòu)域的第一car多肽的第一核酸序列，以及編碼具有ig輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(例如，igκ可變結(jié)構(gòu)域或igλ可變結(jié)構(gòu)域)和tcrβ恒定結(jié)構(gòu)域的第二car多肽的第二核酸序列，其中包含第一car多肽和第二car多肽的car對(duì)肽/mhc復(fù)合體具有結(jié)合特異性。在某些實(shí)施例中，ig重鏈可變結(jié)構(gòu)域和/或ig輕鏈可變結(jié)構(gòu)域?yàn)槿薸g可變結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施例中，tcrβ恒定結(jié)構(gòu)域和/或tcrα恒定結(jié)構(gòu)域?yàn)閲X動(dòng)物恒定結(jié)構(gòu)域(例如，大鼠恒定結(jié)構(gòu)域或小鼠恒定結(jié)構(gòu)域)。在一些實(shí)施例中，tcrβ恒定結(jié)構(gòu)域和/或tcrα恒定結(jié)構(gòu)域?yàn)槿撕愣ńY(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施例中，第一核酸序列和第二核酸序列位于單一核酸分子上。在一些實(shí)施例中，第一核酸序列和第二核酸序列位于分別的核酸分子上。

在某些方面，本文提供了制備表達(dá)car的細(xì)胞的方法，該方法包括用本文所述核酸組合物轉(zhuǎn)染該細(xì)胞。在一些實(shí)施例中，該細(xì)胞為人細(xì)胞。在一些實(shí)施例中，該細(xì)胞為嚙齒動(dòng)物細(xì)胞(例如，大鼠細(xì)胞或小鼠細(xì)胞)。在一些實(shí)施例中，該細(xì)胞為t細(xì)胞。在一些實(shí)施例中，該細(xì)胞為離體t細(xì)胞。在一些實(shí)施例中，本文提供了根據(jù)本文所述方法制備的或由本文所述方法可獲得的細(xì)胞。

在某些方面，本文提供了治療受試者的疾病或障礙的方法，該方法包括給受試者施用表達(dá)本文所述car的t細(xì)胞。在一些實(shí)施例中，所述疾病或障礙為癌，并且car對(duì)mhc遞呈的癌抗原具有結(jié)合特異性。在一些實(shí)施例中，所述疾病或障礙為傳染病，并且car對(duì)病原體抗原(例如，病毒、細(xì)菌或寄生蟲(chóng)抗原)具有結(jié)合特異性。在一些實(shí)施例中，所述疾病或障礙為自身免疫性和/或炎性疾病，并且car對(duì)自身免疫性自體抗原具有特異性并由調(diào)節(jié)性t細(xì)胞表達(dá)。在一些實(shí)施例中，該t細(xì)胞為cd4⁺t細(xì)胞。在一些實(shí)施例中，該t細(xì)胞為cd8⁺t細(xì)胞。

附圖說(shuō)明

圖1示出了本文所述示例性car與抗原遞呈細(xì)胞上的肽/mhc復(fù)合體相互作用的示意圖。

圖2示出了本文所述示例性car與抗原遞呈細(xì)胞上的肽/mhc復(fù)合體相互作用的示意圖。

圖3示出了使用慢病毒載體將人ig可變區(qū)連接至小鼠tcr基因座的示例性方案。該圖公開(kāi)了作為seqidno:155的“sgsg”。

圖4示出了表達(dá)car的細(xì)胞響應(yīng)于抗原遞呈而發(fā)生的細(xì)胞因子分泌。

圖5示出了構(gòu)建用于將igκ可變區(qū)基因區(qū)段插入小鼠內(nèi)源tcrα基因座中的大靶向載體(ltvec)的示例性方案(未按比例繪制)。除非另外具體指明(例如，選擇盒等)，否則小鼠序列由實(shí)心形狀和單線示出，并且人序列由空心形狀和雙線示出。其中指示了某些用于克隆的限制性位點(diǎn)。

圖6示出了將igκ可變區(qū)基因區(qū)段插入小鼠內(nèi)源tcrα基因座中的示例性方案(未按比例繪制)。除非另外具體指明，否則小鼠序列由實(shí)心形狀和單線示出，并且人序列由空心形狀和雙線示出。其中指示了taqman探針雜交位置。

圖7示出了將附加igκ可變區(qū)基因區(qū)段插入小鼠內(nèi)源tcrα基因座中的示例性方案(未按比例繪制)。除非另外具體指明，否則小鼠序列由實(shí)心形狀和單線示出，并且人序列由空心形狀和雙線示出。其中指示了taqman探針雜交位置。

圖8示出了將附加igκ可變區(qū)基因區(qū)段插入小鼠內(nèi)源tcrα基因座中的示例性方案(未按比例繪制)。除非另外具體指明，否則小鼠序列由實(shí)心形狀和單線示出，并且人序列由空心形狀和雙線示出。其中指示了taqman探針雜交位置。

圖9示出了將附加igκ可變區(qū)基因區(qū)段插入小鼠內(nèi)源tcrα基因座中的示例性方案(未按比例繪制)。除非另外具體指明，否則小鼠序列由實(shí)心形狀和單線示出，并且人序列由空心形狀和雙線示出。其中指示了taqman探針雜交位置。

圖10示出了構(gòu)建用于將ig重鏈可變區(qū)基因區(qū)段插入小鼠內(nèi)源tcrβ基因座中的ltvec的示例性方案(未按比例繪制)。除非另外具體指明，否則小鼠序列由實(shí)心形狀和單線示出，并且人序列由空心形狀和雙線示出。

圖11示出了將ig重鏈可變區(qū)基因區(qū)段插入小鼠內(nèi)源tcrβ基因座中的示例性方案(未按比例繪制)。除非另外具體指明，否則小鼠序列由實(shí)心形狀和單線示出，并且人序列由空心形狀和雙線示出。

圖12示出了可用于將ig重鏈可變區(qū)基因區(qū)段插入小鼠內(nèi)源tcrβ基因座中的示例性ltvec(未按比例繪制)。除非另外具體指明，否則小鼠序列由實(shí)心形狀和單線示出，并且人序列由空心形狀和雙線示出。

圖13示出了將ig重鏈可變區(qū)基因區(qū)段插入小鼠內(nèi)源tcrβ基因座中的方案的示例性方案(未按比例繪制)。步驟4示出了使tcrvβ31基因區(qū)段缺失的任選步驟。除非另外具體指明，否則小鼠序列由實(shí)心形狀和單線示出，并且人序列由空心形狀和雙線示出。

圖14示出了在轉(zhuǎn)基因小鼠胸腺細(xì)胞和脾t細(xì)胞中的igκ/tcrαcar基因座重排期間的vκ和jκ利用率，其中內(nèi)源tcrα可變區(qū)基因座已被替換為非重排igκ可變區(qū)基因區(qū)段(4個(gè)功能性vκ和5個(gè)功能性jκ)。igkv7-3為假基因。

圖15示出了三只轉(zhuǎn)基因小鼠的脾t細(xì)胞中igκ/tcrαcar基因座的有效重排與無(wú)效重排的比較，其中內(nèi)源tcrα可變區(qū)基因座已被替換為非重排igκ可變區(qū)基因區(qū)段(4個(gè)功能性vκ和5個(gè)功能性jκ)。本文的有效重排(“prod”)包括這樣的重排，其中重排的核酸序列可被翻譯成蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)具有有效連接的vκ序列、接著是jκ序列、然后是tcrα恒定結(jié)構(gòu)域序列。無(wú)效重排(“nonprod”)包括這樣的重排，其中重排的vκjκ外顯子與編碼tcrα恒定結(jié)構(gòu)域的核酸序列不同框，或與編碼tcrα結(jié)構(gòu)域的序列在同框，但包含終止密碼子，因此它們無(wú)法被翻譯成蛋白質(zhì)。

圖16示出了在轉(zhuǎn)基因小鼠胸腺細(xì)胞和脾t細(xì)胞中的igκ/tcrαcar基因座重排期間的vκ和jκ利用率，其中內(nèi)源tcrα可變區(qū)基因座已被替換為非重排igκ可變區(qū)基因區(qū)段(16個(gè)功能性vκ和5個(gè)功能性jκ)。

圖17示出了轉(zhuǎn)基因小鼠胸腺細(xì)胞和脾t細(xì)胞中igκ/tcrαcar基因座的有效重排與無(wú)效重排的比較，其中內(nèi)源tcrα可變區(qū)基因座已被替換為非重排igκ可變區(qū)基因區(qū)段(16個(gè)功能性vκ和5個(gè)功能性jκ)。本文的有效重排(“prod”)包括這樣的重排，其中重排的核酸序列可被翻譯成蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)具有有效連接的vκ序列、接著是jκ序列、然后是tcrα恒定結(jié)構(gòu)域序列。無(wú)效重排(“nonprod”)包括這樣的重排，其中重排的vκjκ外顯子與編碼tcrα恒定結(jié)構(gòu)域的序列不同框，或與tcrα同框，但包含終止密碼子，因此它們無(wú)法被翻譯成蛋白質(zhì)。

圖18示出了在轉(zhuǎn)基因小鼠胸腺細(xì)胞和脾t細(xì)胞中的igh/tcrβcar基因座重排期間的vh和jh利用率，其中內(nèi)源tcrβ可變區(qū)基因座已被替換為非重排igh可變區(qū)基因區(qū)段(3個(gè)功能性vh以及所有功能性d和jh)。

圖19示出了轉(zhuǎn)基因小鼠胸腺細(xì)胞和脾t細(xì)胞中igh/tcrβcar基因座的有效重排與無(wú)效重排的比較，其中內(nèi)源tcrβ可變區(qū)基因座已被替換為非重排igh可變區(qū)基因區(qū)段(3個(gè)功能性vh以及所有功能性d和jh)。本文的有效重排(“prod”)包括這樣的重排，其中重排的核酸序列可被翻譯成蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)具有有效連接的vh序列、接著是d序列、之后是jh序列、然后是tcrβ恒定結(jié)構(gòu)域序列。無(wú)效重排(“nonprod”)包括這樣的重排，其中重排的vdj外顯子與編碼tcrβ恒定結(jié)構(gòu)域的序列不同框，或與tcrβ在同框，但包含終止密碼子，因此它們無(wú)法被翻譯成蛋白質(zhì)。

具體實(shí)施方式

概述

本文提供了與嵌合抗原受體(car)相關(guān)的方法和組合物，所述嵌合抗原受體具有來(lái)源于免疫球蛋白(ig)的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域以及來(lái)源于t細(xì)胞受體(tcr)的恒定結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施例中，car對(duì)主要組織相容性復(fù)合體(mhc)蛋白所遞呈的肽具有結(jié)合特異性。

抗體已被證明是有價(jià)值的治療劑，這是由于它們能夠以高親和力和特異性結(jié)合至靶抗原?，F(xiàn)有抗體治療技術(shù)的弱點(diǎn)之一在于難以靶向某些抗原，諸如細(xì)胞內(nèi)抗原，原因在于遞送抗體跨過(guò)細(xì)胞膜時(shí)面臨挑戰(zhàn)。因此，當(dāng)前抗體治療劑一般針對(duì)胞外抗原(例如，細(xì)胞表面蛋白)和可溶性因子(例如，細(xì)胞因子)。另一方面，細(xì)胞內(nèi)靶標(biāo)(包括許多腫瘤抗原和病毒抗原)仍然難以靶向。

可通過(guò)使用能夠識(shí)別主要組織相容性復(fù)合體(mhc)蛋白上所遞呈的肽抗原的抗體，避免遞送抗體跨過(guò)細(xì)胞膜的挑戰(zhàn)。所有有核哺乳動(dòng)物細(xì)胞將內(nèi)源細(xì)胞蛋白加工成肽，這些肽被裝載到i類(lèi)mhc蛋白上并遞呈到細(xì)胞的表面上。類(lèi)似地，專(zhuān)職抗原遞呈細(xì)胞(apc)(例如，樹(shù)突細(xì)胞或巨噬細(xì)胞)將外源性抗原加工成肽，這些肽被裝載到ii類(lèi)mhc蛋白上并遞呈到apc細(xì)胞表面上。在胸腺中的t細(xì)胞發(fā)育期間，t細(xì)胞經(jīng)歷陽(yáng)性和陰性選擇，這確保只有那些表達(dá)對(duì)mhc具有極弱的非肽依賴(lài)性親和力的tcr的少數(shù)t細(xì)胞在胸腺中出現(xiàn)(陽(yáng)性選擇)，而表達(dá)對(duì)自體肽/mhc具有中等至高親和力的tcr的t細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡(陰性選擇)。與tcr不同，抗體通常不經(jīng)歷基于mhc的陽(yáng)性和陰性選擇，已證實(shí)難以使用常規(guī)抗體生成技術(shù)來(lái)生成對(duì)肽/mhc復(fù)合體具有特異性的抗體。

如本文所述，在一些實(shí)施例中，可使用經(jīng)遺傳修飾的非人動(dòng)物(例如，小鼠)來(lái)生成對(duì)肽/mhc復(fù)合體具有特異性的可溶性抗原結(jié)合分子諸如抗體，所述非人動(dòng)物經(jīng)改造而具有表達(dá)car的t細(xì)胞，所述car具有ig可變結(jié)構(gòu)域和tcr恒定結(jié)構(gòu)域。此類(lèi)非人動(dòng)物具有來(lái)源于有效連接至tcrα和tcrβ恒定區(qū)的非重排ig輕鏈和重鏈可變(v(d)j)基因區(qū)段的ig可變結(jié)構(gòu)域，并且在遇到抗原(例如，肽/mhc)時(shí)在car基因座處會(huì)經(jīng)歷v(d)j重排以生成重排的car分子，從而在t細(xì)胞上進(jìn)行car表達(dá)。由于此類(lèi)t細(xì)胞經(jīng)歷陽(yáng)性和陰性選擇，因此所表達(dá)的car對(duì)肽/mhc具有抗原特異性。此類(lèi)小鼠因此可用于生成能夠靶向肽/mhc復(fù)合體的抗原結(jié)合蛋白。例如，可以用肽/mhc抗原對(duì)小鼠進(jìn)行免疫接種，使得生成抗原特異性t細(xì)胞。編碼抗原特異性t細(xì)胞上所表達(dá)的car的ig可變結(jié)構(gòu)域的核酸可以在宿主細(xì)胞中有效連接至編碼ig恒定結(jié)構(gòu)域的核酸，使得宿主細(xì)胞表達(dá)肽/mhc特異性抗體。

定義

詞語(yǔ)“一個(gè)(種、條)”在本文中用來(lái)指一個(gè)(種、條)或一個(gè)(種、條)以上(即，至少一個(gè)(種、條))的該詞語(yǔ)所修飾對(duì)象。例如，“一個(gè)要素”意指一個(gè)要素或一個(gè)以上要素。

術(shù)語(yǔ)“氨基酸”旨在包括所有這樣的分子，無(wú)論是天然的還是合成的，所述分子同時(shí)包含氨基官能團(tuán)和酸官能團(tuán)兩者并且能夠被包含到天然存在的氨基酸的聚合物中。示例性氨基酸包括天然存在的氨基酸；其類(lèi)似物、衍生物和同系物；具有變異側(cè)鏈的氨基酸類(lèi)似物；以及上述物質(zhì)中任一種的全部立體異構(gòu)體。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“抗體”可指完整抗體及其抗原結(jié)合片段兩者。完整抗體是包含通過(guò)二硫鍵互相連接的至少兩條重(h)鏈和兩條輕(l)鏈的糖蛋白。每條重鏈包含重鏈可變結(jié)構(gòu)域和重鏈恒定結(jié)構(gòu)域。每條輕鏈包含輕鏈可變結(jié)構(gòu)域和輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域。重鏈可變結(jié)構(gòu)域和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域可進(jìn)一步細(xì)分為超變性的區(qū)域，稱(chēng)為互補(bǔ)決定區(qū)(cdr)，散布的更保守區(qū)域，稱(chēng)為骨架區(qū)(fr)。每個(gè)重鏈可變結(jié)構(gòu)域和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域由三個(gè)cdr和四個(gè)fr構(gòu)成，按下列順序從氨基末端排列至羧基末端：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4。重鏈和輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域包含會(huì)與抗原相互作用的結(jié)合結(jié)構(gòu)域。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)抗體的“抗原結(jié)合片段”和“抗原結(jié)合部分”是指抗體的一個(gè)或多個(gè)保留結(jié)合至抗原的能力的片段。涵蓋于術(shù)語(yǔ)抗體的“抗原結(jié)合片段”內(nèi)的結(jié)合片段的例子包括fab、fab'、f(ab')2、fv、scfv、二硫鍵連接的fv、fd、單鏈抗體、分離的cdrh3以及其他保留完整抗體的可變結(jié)構(gòu)域的至少一部分的抗體片段。這些抗體片段可使用常規(guī)重組和/或酶法技術(shù)獲得，并且可按與完整抗體相同的方式針對(duì)抗原結(jié)合進(jìn)行篩選。

如本文所用，“嵌合抗原受體”或“car”是指包含免疫球蛋白抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域(例如，免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域)和t細(xì)胞受體(tcr)恒定結(jié)構(gòu)域的抗原結(jié)合蛋白。如本文所用，tcr多肽的“恒定結(jié)構(gòu)域”包括近膜tcr恒定結(jié)構(gòu)域，并且還可包括tcr跨膜結(jié)構(gòu)域和/或tcr胞質(zhì)尾。例如，在一些實(shí)施例中，該car為包含第一多肽和第二多肽的二聚體，該第一多肽包含連接至tcrβ恒定結(jié)構(gòu)域的免疫球蛋白重鏈可變結(jié)構(gòu)域，并且該第二多肽包含連接至tcrα恒定結(jié)構(gòu)域的免疫球蛋白輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(例如，κ或λ可變結(jié)構(gòu)域)。在一些實(shí)施例中，該car為包含第一多肽和第二多肽的二聚體，該第一多肽包含連接至tcrα恒定結(jié)構(gòu)域的免疫球蛋白重鏈可變結(jié)構(gòu)域，并且該第二多肽包含連接至tcrβ恒定結(jié)構(gòu)域的免疫球蛋白輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(例如，κ或λ可變結(jié)構(gòu)域)。

短語(yǔ)“來(lái)源于”當(dāng)在“來(lái)源于”非重排可變區(qū)和/或非重排可變區(qū)基因區(qū)段的重排可變區(qū)基因方面使用時(shí)，是指能夠?qū)⒃撝嘏趴勺儏^(qū)基因的序列追溯到一組非重排可變區(qū)基因區(qū)段，該組非重排可變區(qū)基因區(qū)段發(fā)生重排而形成表達(dá)該可變結(jié)構(gòu)域的基因(在適用時(shí)，考慮到剪接差異和體細(xì)胞突變)。例如，已經(jīng)歷體細(xì)胞突變的重排可變區(qū)基因仍然來(lái)源于非重排可變區(qū)基因區(qū)段。在一些實(shí)施例中，在內(nèi)源基因座被替換為通用輕鏈或重鏈基因座的情況下，術(shù)語(yǔ)“來(lái)源于”指示能夠?qū)⒃撔蛄械膩?lái)源追溯到所述重排基因座，即便該序列可能已經(jīng)歷體細(xì)胞突變。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“基因座”是指染色體上包含一組相關(guān)遺傳元件(例如，基因、基因區(qū)段、調(diào)節(jié)元件)的位置。例如，非重排免疫球蛋白基因座可包含免疫球蛋白可變區(qū)基因區(qū)段、一種或多種免疫球蛋白恒定區(qū)基因以及引導(dǎo)v(d)j重組和免疫球蛋白表達(dá)的相關(guān)調(diào)節(jié)元件(例如，啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、開(kāi)關(guān)元件等)。類(lèi)似地，非重排car基因座可包含免疫球蛋白可變區(qū)基因區(qū)段、tcr恒定區(qū)基因以及引導(dǎo)v(d)j重組和car表達(dá)的相關(guān)調(diào)節(jié)元件(例如，啟動(dòng)子、增強(qiáng)子等)?；蜃蔀閮?nèi)源或非內(nèi)源的。術(shù)語(yǔ)“內(nèi)源基因座”是指染色體上天然存在特定遺傳元件的位置。例如，內(nèi)源小鼠tcrα基因座是指小鼠染色體14上包含野生型小鼠tcrα可變區(qū)基因區(qū)段和恒定區(qū)基因的位置，而內(nèi)源小鼠tcrβ基因座是指小鼠染色體6上包含野生型小鼠tcrβ可變區(qū)基因區(qū)段和恒定區(qū)基因的位置。

如果非重排可變區(qū)基因區(qū)段能夠重排以形成重排可變區(qū)基因，該重排可變區(qū)基因與恒定區(qū)基因一起被表達(dá)為抗原結(jié)合蛋白的多肽鏈，則非重排可變區(qū)基因區(qū)段“有效連接”至相鄰的恒定區(qū)基因。例如，在car基因座中，非重排免疫球蛋白可變區(qū)基因區(qū)段有效連接至tcr恒定區(qū)基因。

術(shù)語(yǔ)“多核苷酸”和“核酸”可互換使用。它們是指任何長(zhǎng)度的核苷酸(脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)或其類(lèi)似物的聚合物形式。多核苷酸可具有任何三維結(jié)構(gòu)，并且可執(zhí)行任何功能。以下是多核苷酸的非限制性例子：基因或基因片段的編碼或非編碼區(qū)、由連鎖分析界定的基因座、外顯子、內(nèi)含子、信使rna(mrna)、轉(zhuǎn)運(yùn)rna、核糖體rna、核酶、cdna、重組多核苷酸、分支多核苷酸、質(zhì)粒、載體、任何序列的分離dna、任何序列的分離rna、核酸探針和引物。多核苷酸可包含經(jīng)修飾的核苷酸例如甲基化核苷酸和核苷酸類(lèi)似物。如果存在，則對(duì)核苷酸結(jié)構(gòu)的修飾可以在聚合物組裝之前或之后進(jìn)行。多核苷酸可以被進(jìn)一步修飾，例如通過(guò)與標(biāo)記組分綴合來(lái)修飾。在本文提供的所有核酸序列中，u核苷酸可與t核苷酸互換。

如本文所用，“特異性結(jié)合”和“抗原特異性”是指抗原結(jié)合分子(例如，抗體或car)能夠結(jié)合至預(yù)定靶標(biāo)，例如預(yù)定肽/mhc復(fù)合體。通常，抗原結(jié)合分子以對(duì)應(yīng)于約10^-7m或更小的kd的親和力特異性地結(jié)合至其預(yù)定靶標(biāo)，并且以比其結(jié)合至非特異性和非相關(guān)靶標(biāo)(例如，bsa、酪蛋白)的親和力小至少10倍、小至少100倍或小至少1000倍的親和力(如由kd表示)結(jié)合至預(yù)定靶標(biāo)。

術(shù)語(yǔ)“非重排”包括免疫球蛋白、tcr或car可變區(qū)基因座或可變區(qū)基因區(qū)段的狀態(tài)，其中v基因區(qū)段和j基因區(qū)段(對(duì)于重鏈或tcrβ可變區(qū)、d基因區(qū)段也一樣)被單獨(dú)地保留，但能夠接合以形成包含v(d)j組庫(kù)(repertoire)的單個(gè)v,(d),j的重排v(d)j基因(“可變區(qū)基因”)。

嵌合抗原受體基因座

在某些方面，本文提供了嵌合抗原受體(car)基因座。此類(lèi)car基因座一般包含可變區(qū)基因座和恒定區(qū)基因座?？勺儏^(qū)基因座包含非重排ig可變區(qū)基因區(qū)段，而恒定區(qū)基因座包含tcr恒定區(qū)基因，其中ig可變區(qū)基因區(qū)段有效連接至恒定區(qū)基因。在一些實(shí)施例中，可變區(qū)將為非重排可變區(qū)，并將因此包含非重排ig可變區(qū)基因區(qū)段。在一些實(shí)施例中，可變區(qū)將為重排可變區(qū)，并將因此包含重排可變區(qū)基因。在某些實(shí)施例中，ig可變區(qū)基因區(qū)段為人可變區(qū)基因區(qū)段，并且tcr恒定區(qū)基因?yàn)榉侨撕愣▍^(qū)基因。例如，在一些實(shí)施例中，tcr恒定區(qū)基因?yàn)閲X動(dòng)物恒定區(qū)基因，諸如大鼠恒定區(qū)基因或小鼠恒定區(qū)基因。在某些實(shí)施例中，ig可變區(qū)基因區(qū)段為人可變區(qū)基因區(qū)段，并且tcr恒定區(qū)基因?yàn)槿撕愣▍^(qū)基因。

在一些實(shí)施例中，本文所述car基因座位于內(nèi)源tcr基因座處。例如，在一些實(shí)施例中，包含tcrα恒定區(qū)基因的car基因座位于內(nèi)源tcrα恒定區(qū)基因座處。在一些實(shí)施例中，通過(guò)將tcrα非重排可變區(qū)的一些或全部替換為非重排ig可變區(qū)來(lái)構(gòu)建這種基因座。在一些實(shí)施例中，包含tcrβ恒定區(qū)基因的car基因座位于內(nèi)源tcrβ恒定區(qū)基因座處。在一些實(shí)施例中，通過(guò)將tcrβ非重排可變區(qū)的一些或全部替換為非重排ig可變區(qū)來(lái)構(gòu)建這種基因座。用于構(gòu)建示例性car基因座的方法在本文實(shí)例2中提供。

在某些實(shí)施例中，car可變區(qū)基因座將包含非重排人ig可變區(qū)基因區(qū)段。本領(lǐng)域已描述了包含人可變區(qū)基因區(qū)段的示例性可變區(qū)基因座。例如，此類(lèi)基因座在美國(guó)專(zhuān)利no.5,770,429、no.5,814,318、no.6,114,598、no.6,998,514、no.8,232,449、no.8,502,018和no.8,697,940中有描述，這些專(zhuān)利中的每一篇均據(jù)此以引用方式并入，并且此類(lèi)基因座在美國(guó)專(zhuān)利公布no.2008/0098490、no.2012/0167237、no.2013/0145484、no.2013/0326647、no.2014/013275和no.2014/093908中有描述，這些專(zhuān)利公布中的每一篇均據(jù)此以引用方式并入。

在某些實(shí)施例中，car可變區(qū)基因座包含非重排人ig重鏈可變區(qū)基因區(qū)段。在一些實(shí)施例中，非重排人ig可變區(qū)基因區(qū)段包含多個(gè)人vh區(qū)段、一個(gè)或多個(gè)人dh區(qū)段以及一個(gè)或多個(gè)人jh區(qū)段。在一些實(shí)施例中，非重排人ig可變區(qū)基因區(qū)段包含至少3個(gè)vh基因區(qū)段、至少18個(gè)vh基因區(qū)段、至少20個(gè)vh基因區(qū)段、至少30個(gè)vh基因區(qū)段、至少40個(gè)vh基因區(qū)段、至少50個(gè)vh基因區(qū)段、至少60個(gè)vh基因區(qū)段、至少70個(gè)vh基因區(qū)段或至少80個(gè)vh基因區(qū)段。在一些實(shí)施例中，非重排人ig基因區(qū)段包含全部人dh基因區(qū)段。在一些實(shí)施例中，car可變區(qū)還包含tcrβ可變區(qū)基因區(qū)段(例如，v、d和/或j基因區(qū)段)。在一個(gè)實(shí)施例中，car可變區(qū)還包含遠(yuǎn)側(cè)tcrvβ基因區(qū)段，例如tcrvβ31基因區(qū)段。在另一個(gè)實(shí)施例中，遠(yuǎn)側(cè)tcrvβ基因區(qū)段(例如tcrvβ31基因區(qū)段)已功能性地失活或缺失。在一些實(shí)施例中，非重排人ig基因區(qū)段包含全部人jh基因區(qū)段。包含ig重鏈基因區(qū)段的示例性可變區(qū)例如在macdonaldetal.,proc.natl.acad.sci.usa111:5147-52(macdonald等人，《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》，第111卷，第5147-5152頁(yè))及補(bǔ)充信息中提供，該文獻(xiàn)據(jù)此以引用方式并入。

在一些實(shí)施例中，包含非重排人ig重鏈可變區(qū)基因區(qū)段的car可變基因座還包含人ig重鏈可變區(qū)基因間序列。在一些實(shí)施例中，car可變基因座包含非人(例如，嚙齒動(dòng)物、大鼠、小鼠)ig重鏈可變區(qū)基因間序列。在一些實(shí)施例中，car可變基因座包含人或非人(例如，嚙齒動(dòng)物、大鼠、小鼠)tcrβ可變區(qū)基因間序列。例如，在一些實(shí)施例中，car基因座的非重排可變區(qū)包含一種或多種(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20種)胰蛋白酶原(try)基因(例如，通常存在于tcrβ可變區(qū)基因座中的try基因和/或假基因)。在一些實(shí)施例中，try基因?yàn)樾∈髏ry基因。在一些實(shí)施例中，小鼠try基因選自try1、try2、try3、try4、try5、try6、try7、try8、try9、try10、try11、try12、try13、try14、try15、try16、try17、try18、try19和try20。在一些實(shí)施例中，一種或多種try基因位于非重排可變區(qū)的vh區(qū)段的上游。在一些實(shí)施例中，一種或多種try基因位于非重排可變區(qū)的vh區(qū)段的下游以及dh區(qū)段的上游。在一些實(shí)施例中，try1-7位于非重排可變區(qū)的vh區(qū)段的上游，并且try8-20位于非重排可變區(qū)的vh區(qū)段的下游以及dh區(qū)段的上游。有關(guān)位于人和/或小鼠tcrβ基因座中的try基因的另外信息在glusmanetal.,immunity15:337-349(2001)(glusman等人，《免疫》，第15卷，第337-349頁(yè)，2001年)和skoketal.,natureimmunology8:378-387(2007)(skok等人，《自然免疫學(xué)》，第8卷，第378-387頁(yè)，2007年)中提供，所述文獻(xiàn)中的每一篇均以引用方式并入。在一些實(shí)施例中，car基因座包含非人調(diào)節(jié)元件(例如，非人啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子)。在一些實(shí)施例中，非人調(diào)節(jié)元件為嚙齒動(dòng)物調(diào)節(jié)元件(例如，大鼠或小鼠啟動(dòng)子或增強(qiáng)子)。在一些實(shí)施例中，car基因座包含igm增強(qiáng)子(eμ)。在一些實(shí)施例中，igm增強(qiáng)子為非人eμ(例如，嚙齒動(dòng)物eμ，如小鼠或大鼠eμ)。

在某些實(shí)施例中，car可變區(qū)基因座包含非重排人igκ可變區(qū)基因區(qū)段。在一些實(shí)施例中，非重排人免疫球蛋白可變區(qū)基因區(qū)段包含多個(gè)人vκ區(qū)段以及一個(gè)或多個(gè)人jκ區(qū)段。在一些實(shí)施例中，免疫球蛋白可變區(qū)基因區(qū)段包含四個(gè)功能性vκ區(qū)段和全部人jκ區(qū)段。在一些實(shí)施例中，免疫球蛋白可變區(qū)基因區(qū)段包含16個(gè)功能性vκ區(qū)段和全部人jκ區(qū)段。在一些實(shí)施例中，非重排人免疫球蛋白可變區(qū)基因區(qū)段包含全部人vκ區(qū)段和全部人jκ區(qū)段。包含igκ基因區(qū)段的示例性可變區(qū)例如在macdonaldetal.,proc.natl.acad.sci.usa111:5147-52(macdonald等人，《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》，第111卷，第5147-5152頁(yè))及補(bǔ)充信息中提供，該文獻(xiàn)據(jù)此以引用方式并入。在一些實(shí)施例中，非重排人免疫球蛋白可變區(qū)基因區(qū)段包含全部人jκ區(qū)段。在一些實(shí)施例中，car可變區(qū)還包含tcrα可變區(qū)基因區(qū)段(例如，v和/或j基因區(qū)段)。

在某些實(shí)施例中，car可變區(qū)基因座包含非重排人igλ可變區(qū)基因區(qū)段。在一些實(shí)施例中，非重排人免疫球蛋白可變區(qū)基因區(qū)段包含多個(gè)人vλ區(qū)段以及一個(gè)或多個(gè)人jλ區(qū)段。在一些實(shí)施例中，非重排人免疫球蛋白可變區(qū)基因區(qū)段包含全部人vλ區(qū)段。在一些實(shí)施例中，非重排人免疫球蛋白可變區(qū)基因區(qū)段包含全部人jλ區(qū)段。在一些實(shí)施例中，car可變區(qū)還包含tcrα可變區(qū)基因區(qū)段(例如，v和/或j基因區(qū)段)。包含igλ基因區(qū)段的示例性可變區(qū)例如在美國(guó)專(zhuān)利公布no.2012/0073004和no.2002/0088016中提供，這些專(zhuān)利公布中的每一篇均據(jù)此以引用方式并入。

在一些實(shí)施例中，包含非重排人ig輕鏈可變區(qū)基因區(qū)段的car可變基因座還包含人ig輕鏈可變區(qū)基因間序列(例如，κ可變區(qū)基因間序列和/或λ可變區(qū)基因間序列)。在一些實(shí)施例中，car可變基因座包含非人(例如，嚙齒動(dòng)物、大鼠、小鼠)ig輕鏈可變區(qū)基因間序列(例如，κ可變區(qū)基因間序列和/或λ可變區(qū)基因間序列)。在一些實(shí)施例中，car可變基因座包含人或非人(例如，嚙齒動(dòng)物、大鼠、小鼠)tcrα可變區(qū)基因間序列。在一些實(shí)施例中，car基因座包含非人調(diào)節(jié)元件(例如，非人啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子)。在一些實(shí)施例中，非人調(diào)節(jié)元件為嚙齒動(dòng)物調(diào)節(jié)元件(例如，大鼠或小鼠啟動(dòng)子或增強(qiáng)子)。

在一些實(shí)施例中，car可變區(qū)基因座為包含ig重鏈可變區(qū)基因(通用重鏈可變區(qū))的重排可變區(qū)基因座。在一些實(shí)施例中，重排ig重鏈可變區(qū)基因?yàn)槿酥嘏舏g重鏈可變區(qū)基因。通用重鏈可變區(qū)的使用有利于雙特異性抗體的生成，其中至少一個(gè)抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域?qū)﹄?mhc復(fù)合體具有特異性。示例性重排ig重鏈可變區(qū)在美國(guó)專(zhuān)利公布no.2014/0245468中提供，該專(zhuān)利公布據(jù)此以引用方式并入。

在一些實(shí)施例中，car可變區(qū)基因座為包含ig輕鏈可變區(qū)基因(通用輕鏈可變區(qū))的重排可變區(qū)基因座。在一些實(shí)施例中，重排ig輕鏈可變區(qū)基因?yàn)槿酥嘏舏g輕鏈可變區(qū)基因。通用輕鏈可變區(qū)的使用有利于雙特異性抗體的生成，其中至少一個(gè)抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域?qū)﹄?mhc復(fù)合體具有結(jié)合特異性。示例性重排ig重鏈可變區(qū)在美國(guó)專(zhuān)利公布no.2013/0185821中提供，該專(zhuān)利公布據(jù)此以引用方式并入。

在某些實(shí)施例中，car恒定區(qū)基因座包含tcrα或tcrβ恒定區(qū)基因。在一些實(shí)施例中，car恒定區(qū)基因座還包含免疫球蛋白調(diào)節(jié)序列(例如，人或內(nèi)源物種來(lái)源的調(diào)節(jié)序列)。在一些實(shí)施例中，car恒定區(qū)基因座包含位于tcrβc2上游的小鼠或大鼠igm增強(qiáng)子(eμ)。在一些實(shí)施例中，tcr恒定區(qū)基因還包含ig恒定區(qū)序列。例如，在一些實(shí)施例中，car恒定區(qū)基因座包含tcrβ恒定區(qū)基因，該tcrβ恒定區(qū)基因包含編碼ig重鏈ch1結(jié)構(gòu)域的核酸序列。在一些實(shí)施例中，car恒定區(qū)基因座包含tcrα恒定區(qū)基因，該tcrα恒定區(qū)基因包含編碼igλ或igκ恒定區(qū)或其一部分的核酸序列。

人源化mhc

在一些實(shí)施例中，本文所述經(jīng)遺傳修飾的非人動(dòng)物和es細(xì)胞表達(dá)和/或在其基因組中包含編碼人源化mhci類(lèi)α鏈多肽(例如，人源化hla-a、hla-b、hla-c、hla-e、hla-f、hla-g、hla-k和/或hla-l)的基因座。在一些實(shí)施例中，人源化mhci類(lèi)α鏈多肽為全人源的。在一些實(shí)施例中，人源化mhci類(lèi)α鏈多肽包含人胞外結(jié)構(gòu)域(例如，人α1、α2和α3結(jié)構(gòu)域)和內(nèi)源物種來(lái)源的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。人源化mhci類(lèi)α鏈多肽、編碼人源化mhci類(lèi)α鏈多肽的基因座以及表達(dá)人源化mhci類(lèi)α鏈多肽的非人動(dòng)物在美國(guó)專(zhuān)利公布no.2013/0111617、no.2013/0185819和no.2014/0245467中有描述，這些專(zhuān)利公布中的每一篇均以引用方式并入本文。

在一些實(shí)施例中，本文所述經(jīng)遺傳修飾的非人動(dòng)物和es細(xì)胞表達(dá)和/或在其基因組中包含編碼人源化β-2-微球蛋白多肽的基因座。人源化β-2-微球蛋白多肽、編碼人源化β-2-微球蛋白多肽的基因座以及表達(dá)人源化β-2-微球蛋白多肽的非人動(dòng)物在美國(guó)專(zhuān)利公布no.2013/0111617和no.2013/0185819中有描述，這些專(zhuān)利公布中的每一篇均以引用方式并入本文。

在一些實(shí)施例中，本文所述經(jīng)遺傳修飾的非人動(dòng)物和es細(xì)胞表達(dá)和/或在其基因組中包含編碼人源化mhcii類(lèi)α鏈多肽(例如，人源化hla-dma、hla-doa、hla-dpa、hla-dqa和/或hla-dra)的基因座。在一些實(shí)施例中，人源化mhcii類(lèi)α鏈多肽為全人源的。在一些實(shí)施例中，人源化mhcii類(lèi)α鏈多肽包含人胞外結(jié)構(gòu)域和內(nèi)源物種來(lái)源的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。人源化mhcii類(lèi)α鏈多肽、編碼人源化mhcii類(lèi)α鏈多肽的基因座以及表達(dá)人源化mhcii類(lèi)α鏈多肽的非人動(dòng)物在美國(guó)專(zhuān)利no.8,847,005和no.9,043,996以及美國(guó)專(zhuān)利公布no.2014/0245467中有描述，這些專(zhuān)利和專(zhuān)利公布中的每一篇均以引用方式并入本文。

在一些實(shí)施例中，本文所述經(jīng)遺傳修飾的非人動(dòng)物和es細(xì)胞表達(dá)和/或在其基因組中包含編碼人源化mhcii類(lèi)β鏈多肽(例如，人源化hla-dmb、hla-dob、hla-dpb、hla-dqb和/或hla-drb)的基因座。在一些實(shí)施例中，人源化mhcii類(lèi)β鏈多肽為全人源的。在一些實(shí)施例中，人源化mhcii類(lèi)β鏈多肽包含人胞外結(jié)構(gòu)域和內(nèi)源物種來(lái)源的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。人源化mhcii類(lèi)β鏈多肽、編碼人源化mhcii類(lèi)β鏈多肽的基因座以及表達(dá)人源化mhcii類(lèi)β鏈多肽的非人動(dòng)物在美國(guó)專(zhuān)利no.8,847,005和no.9,043,996以及美國(guó)專(zhuān)利公布no.2014/0245467中有描述，這些專(zhuān)利和專(zhuān)利公布中的每一篇均以引用方式并入本文。

包含car基因座和人源化mhci和/或mhcii(mhciiα/iiβ)基因座的經(jīng)遺傳修飾的非人動(dòng)物可通過(guò)使用常規(guī)方法進(jìn)行培育而生成；另選地，它們可通過(guò)以下方式生成：在已經(jīng)包含一個(gè)或多個(gè)經(jīng)基因工程改造的基因座(例如，car基因座)的es細(xì)胞中進(jìn)行同源重組，并且由所述es細(xì)胞生成非人動(dòng)物。

人源化cd4和cd8受體

在一些實(shí)施例中，本文所述經(jīng)遺傳修飾的非人動(dòng)物和es細(xì)胞表達(dá)和/或在其基因組中包含編碼人源化cd8α鏈多肽的基因座。在一些實(shí)施例中，人源化cd8α鏈多肽為全人源的。在一些實(shí)施例中，人源化cd8α鏈多肽包含人胞外免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域和內(nèi)源物種來(lái)源的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。人源化cd8α鏈多肽、編碼人源化cd8α鏈多肽的基因座以及表達(dá)人源化cd8α鏈多肽的非人動(dòng)物在美國(guó)專(zhuān)利公布no.2014/0245466中有描述，該專(zhuān)利公布以引用方式并入本文。

在一些實(shí)施例中，本文所述經(jīng)遺傳修飾的非人動(dòng)物和es細(xì)胞表達(dá)和/或在其基因組中包含編碼人源化cd8β鏈多肽的基因座。在一些實(shí)施例中，人源化cd8β鏈多肽為全人源的。在一些實(shí)施例中，人源化cd8β鏈多肽包含人胞外免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域和內(nèi)源物種來(lái)源的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。人源化cd8β鏈多肽、編碼人源化cd8β鏈多肽的基因座以及表達(dá)人源化cd8β鏈多肽的非人動(dòng)物在美國(guó)專(zhuān)利公布no.2014/0245466中有描述，該專(zhuān)利公布以引用方式并入本文。

在一些實(shí)施例中，本文所述經(jīng)遺傳修飾的非人動(dòng)物和es細(xì)胞表達(dá)和/或在其基因組中包含編碼人源化cd4多肽的基因座。在一些實(shí)施例中，人源化cd4多肽為全人源的。在一些實(shí)施例中，人源化cd4多肽包含至少一個(gè)人胞外免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域和內(nèi)源物種來(lái)源的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施例中，人源化cd4多肽包含至少人d1免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域、人d2免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域和人d3免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域，以及內(nèi)源物種來(lái)源的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施例中，人源化cd4多肽包含人d1免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域、人d2免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域、人d3免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域、內(nèi)源物種來(lái)源的d4免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域以及內(nèi)源物種來(lái)源的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。人源化cd4多肽、編碼人源化cd4多肽的基因座以及表達(dá)人源化cd4多肽的非人動(dòng)物在美國(guó)專(zhuān)利公布no.2014/0245466中有描述，該專(zhuān)利公布以引用方式并入本文。

包含car基因座和人源化cd4和/或cd8(cd8α/cd8β)基因座的經(jīng)遺傳修飾的非人動(dòng)物可通過(guò)使用常規(guī)方法進(jìn)行培育而生成；另選地，它們可通過(guò)以下方式生成：在已經(jīng)包含一個(gè)或多個(gè)經(jīng)基因工程改造的基因座(例如，car基因座)的es細(xì)胞中進(jìn)行同源重組，并且由所述es細(xì)胞生成非人動(dòng)物。

經(jīng)遺傳修飾的非人動(dòng)物和es細(xì)胞

在某些方面，本文提供了表達(dá)car和/或car肽的經(jīng)遺傳修飾的非人動(dòng)物，以及可用于制備此類(lèi)非人動(dòng)物的經(jīng)遺傳修飾的非人動(dòng)物es細(xì)胞。

在某些方面，本文提供了在其生殖系和/或基因組中包含本文所述car基因座的經(jīng)遺傳修飾的非人動(dòng)物和非人動(dòng)物es細(xì)胞。在一些實(shí)施例中，非人動(dòng)物或es細(xì)胞在其生殖系和/或基因組中包含兩個(gè)car基因座。在一些實(shí)施例中，一個(gè)基因座包含tcrα恒定區(qū)基因，另一個(gè)基因座包含tcrβ恒定區(qū)基因。在一些實(shí)施例中，car基因座位于內(nèi)源tcr基因座處。

在一些實(shí)施例中，非人動(dòng)物可為任何非人動(dòng)物。在一些實(shí)施例中，非人動(dòng)物為脊椎動(dòng)物。在一些實(shí)施例中，非人動(dòng)物為哺乳動(dòng)物。在一些實(shí)施例中，本文所述經(jīng)遺傳修飾的非人動(dòng)物可選自小鼠、大鼠、兔、豬、牛(例如，奶牛、公牛、水牛)、鹿、綿羊、山羊、美洲駝、雞、貓、狗、雪貂、靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物(例如，狨猴、恒河猴)。對(duì)于不易獲得合適的可遺傳修飾的es細(xì)胞的非人動(dòng)物而言，可采用其他方法制備包含本文所述遺傳修飾的非人動(dòng)物。此類(lèi)方法包括例如對(duì)非es細(xì)胞基因組(例如，成纖維細(xì)胞或誘導(dǎo)多能細(xì)胞)進(jìn)行修飾并采用核移植將經(jīng)修飾的基因組轉(zhuǎn)移到合適的細(xì)胞，例如卵母細(xì)胞，并且在合適的條件下在非人動(dòng)物中孕育經(jīng)修飾的細(xì)胞(例如，經(jīng)修飾的卵母細(xì)胞)以形成胚胎。

在一些實(shí)施例中，非人動(dòng)物為哺乳動(dòng)物。在一些實(shí)施例中，非人動(dòng)物為例如跳鼠總科(dipodoidea)或鼠總科(muroidea)的小型哺乳動(dòng)物。在一些實(shí)施例中，非人動(dòng)物為嚙齒動(dòng)物。在某些實(shí)施例中，嚙齒動(dòng)物為小鼠、大鼠或倉(cāng)鼠。在一些實(shí)施例中，嚙齒動(dòng)物選自鼠總科。在一些實(shí)施例中，非人動(dòng)物來(lái)自選自下列的科：麗倉(cāng)鼠科(calomyscidae)(例如，麗倉(cāng)鼠)、倉(cāng)鼠科(cricetidae)(例如，倉(cāng)鼠、新世界鼠、田鼠)、鼠科(muridae)(例如，真小鼠和大鼠(truemiceandrats)、沙鼠、非洲刺毛鼠、冠鼠)、馬島鼠科(nesomyidae)(例如，攀鼠、巖鼠、白尾鼠、馬島鼠(malagasyratsandmice))、刺睡鼠科(platacanthomyidae)(例如，刺睡鼠)以及鼴形鼠科(spalacidae)(例如，鼴形鼠、竹鼠和鼢鼠)。在一些實(shí)施例中，嚙齒動(dòng)物選自真小鼠或大鼠(鼠科)、沙鼠、非洲刺毛鼠和冠鼠。在一些實(shí)施例中，小鼠來(lái)自鼠科的成員。在一些實(shí)施例中，非人動(dòng)物為嚙齒動(dòng)物。在一些實(shí)施例中，嚙齒動(dòng)物選自小鼠和大鼠。在一些實(shí)施例中，非人動(dòng)物為小鼠。

在一些實(shí)施例中，非人動(dòng)物為c57bl品系的小鼠。在一些實(shí)施例中，c57bl品系選自c57bl/a、c57bl/an、c57bl/grfa、c57bl/kalwn、c57bl/6、c57bl/6j、c57bl/6byj、c57bl/6nj、c57bl/10、c57bl/10scsn、c57bl/10cr和c57bl/ola。在一些實(shí)施例中，非人動(dòng)物為129品系的小鼠。在一些實(shí)施例中，129品系選自129p1、129p2、129p3、129x1、129s1(例如，129s1/sv、129s1/svim)、129s2、129s4、129s5、129s9/svevh、129s6(129/svevtac)、129s7、129s8、129t1、129t2品系。在一些實(shí)施例中，經(jīng)遺傳修飾的小鼠為129品系與c57bl品系的混合型。在一些實(shí)施例中，小鼠為129品系的混合型和/或c57bl/6品系的混合型。在一些實(shí)施例中，該混合型的129品系為129s6(129/svevtac)品系。在一些實(shí)施例中，小鼠為balb品系(例如，balb/c)。在一些實(shí)施例中，小鼠為balb品系與另一品系(例如，c57bl品系和/或129品系)的混合型。在一些實(shí)施例中，本文所提供的非人動(dòng)物可以是來(lái)源于上述品系的任何組合的小鼠。

在一些實(shí)施例中，本文所提供的非人動(dòng)物為大鼠。在一些實(shí)施例中，大鼠選自wistar大鼠、lea品系、spraguedawley品系、fischer品系、f344、f6和darkagouti。在一些實(shí)施例中，大鼠品系為選自wistar、lea、spraguedawley、fischer、f344、f6和darkagouti中的兩種或更多種品系的混合型。

在某些實(shí)施例中，經(jīng)遺傳修飾的非人動(dòng)物或es細(xì)胞在其基因組和/或生殖系中包含car基因座、人源化mhci類(lèi)α鏈基因座、人源化β-2-微球蛋白基因座、人源化mhcii類(lèi)α鏈基因座、人源化mhcii類(lèi)β鏈基因座、人源化cd8α鏈基因座、人源化cd8β鏈基因座和/或人源化cd4基因座。在一些實(shí)施例中，人源化mhci類(lèi)α鏈基因座位于內(nèi)源mhci類(lèi)α鏈基因座處。在某個(gè)實(shí)施例中，人源化β-2-微球蛋白基因座位于內(nèi)源β-2-微球蛋白基因座處。在一些實(shí)施例中，人源化mhcii類(lèi)α鏈基因座位于內(nèi)源mhcii類(lèi)α鏈基因座處。在一些實(shí)施例中，人源化mhcii類(lèi)β鏈基因座位于內(nèi)源mhcii類(lèi)β鏈基因座處。在一些實(shí)施例中，人源化cd8α鏈基因座位于內(nèi)源cd8α鏈基因座處。在一些實(shí)施例中，人源化cd8β鏈基因座位于內(nèi)源cd8β鏈基因座處。在一些實(shí)施例中，人源化cd4基因座位于內(nèi)源cd4基因座處。在一些實(shí)施例中，經(jīng)遺傳修飾的非人動(dòng)物不表達(dá)內(nèi)源mhci類(lèi)α鏈多肽、內(nèi)源β-2-微球蛋白多肽、內(nèi)源mhcii類(lèi)α鏈多肽、內(nèi)源mhcii類(lèi)β鏈多肽、內(nèi)源cd8α鏈多肽、內(nèi)源cd8β鏈多肽和/或內(nèi)源cd4多肽。此類(lèi)動(dòng)物在例如美國(guó)專(zhuān)利公布no.2013/0111617、no.2013/0185819、no.2014/0245466和no.2014/0245467以及美國(guó)專(zhuān)利no.8,847,005和no.9,043,996中有描述，這些專(zhuān)利公布和專(zhuān)利中的每一篇均以引用方式并入本文。

在某些方面，經(jīng)遺傳修飾的非人動(dòng)物表達(dá)本文所述的car多肽。在一些實(shí)施例中，經(jīng)遺傳修飾的非人動(dòng)物表達(dá)包含兩種car多肽的car。在某些實(shí)施例中，car對(duì)肽/mhc復(fù)合體具有結(jié)合特異性。在一些實(shí)施例中，car在非人動(dòng)物的t細(xì)胞(例如，cd4t細(xì)胞或cd8t細(xì)胞)上表達(dá)。在一些實(shí)施例中，非人動(dòng)物不表達(dá)αβtcr。在一些實(shí)施例中，表達(dá)car的t細(xì)胞在t細(xì)胞發(fā)育期間經(jīng)歷陽(yáng)性選擇。在一些實(shí)施例中，表達(dá)car的t細(xì)胞在t細(xì)胞發(fā)育期間經(jīng)歷陰性選擇。

經(jīng)遺傳修飾的非人動(dòng)物和es細(xì)胞可使用本領(lǐng)域已知的任何適當(dāng)方法生成。例如，此類(lèi)經(jīng)遺傳修飾的非人動(dòng)物es細(xì)胞可使用技術(shù)生成，該技術(shù)在美國(guó)專(zhuān)利no.6,586,251、no.6,596,541、no.7,105,348以及valenzuelaetal.(2003)“high-throughputengineeringofthemousegenomecoupledwithhigh-resolutionexpressionanalysis”nat.biotech.21(6):652-659(valenzuela等人，2003年，“與高分辨表達(dá)分析偶聯(lián)的小鼠基因組的高通量工程改造”，《自然生物技術(shù)》，第21卷，第6期，第652-659頁(yè))中有描述，這些專(zhuān)利和文獻(xiàn)均據(jù)此以引用方式并入。還可使用基因組靶向核酸酶系統(tǒng)諸如crispr/cas系統(tǒng)、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶(talen)系統(tǒng)或鋅指核酸酶(zfn)系統(tǒng)進(jìn)行修飾。在一些實(shí)施例中，使用crispr/cas系統(tǒng)進(jìn)行修飾，如例如在美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)no.14/314,866、no.14/515,503、no.14/747,461和no.14/731,914中所述，這些專(zhuān)利申請(qǐng)中的每一篇均以引用方式并入。在一些實(shí)施例中，通過(guò)一系列靶向事件將可變區(qū)基因區(qū)段連續(xù)添加到car基因座，其中將大靶向載體一個(gè)接一個(gè)地依次添加到擴(kuò)展的car基因座。在一些實(shí)施例中，將多個(gè)大靶向載體(例如，兩個(gè)或更多個(gè))在單個(gè)靶向事件(例如，雙重靶向事件)中同時(shí)并入到car基因座中。制備此類(lèi)經(jīng)遺傳修飾的非人動(dòng)物和es細(xì)胞的示例性方法在本文實(shí)例2中提供。

本文所述es細(xì)胞可然后用于利用本領(lǐng)域已知的方法來(lái)生成非人動(dòng)物。例如，本文所述小鼠非人動(dòng)物es細(xì)胞可用于利用方法來(lái)生成經(jīng)遺傳修飾的小鼠，如美國(guó)專(zhuān)利no.7,294,754和poueymirouetal.,naturebiotech25:91-99(2007)(poueymirou等人，《自然生物技術(shù)》，第25卷，第91-99頁(yè)，2007年)中所述，所述專(zhuān)利和文獻(xiàn)中的每一篇均據(jù)此以引用方式并入。可將所得小鼠培育成純合性。

使用經(jīng)遺傳修飾的非人動(dòng)物的方法

可在任何可能用得上表達(dá)car的動(dòng)物的方法中使用本文所述經(jīng)遺傳修飾的非人動(dòng)物。例如，此類(lèi)非人動(dòng)物可用于制備car，制備表達(dá)car的t細(xì)胞，制備表達(dá)car的t細(xì)胞雜交瘤，制備編碼重排ig可變區(qū)的核酸，以及制備抗體或抗體片段。

在某些實(shí)施例中，本文所述方法包括對(duì)轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物進(jìn)行免疫接種，以誘導(dǎo)對(duì)肽/mhc復(fù)合體的t細(xì)胞免疫應(yīng)答。在一些實(shí)施例中，使本文所述經(jīng)遺傳修飾的非人動(dòng)物暴露于包含肽的抗原，使得該肽遞呈在該非人動(dòng)物的mhc上。

在一些實(shí)施例中，可以使用任何這樣的方法：使本文所述經(jīng)遺傳修飾的非人動(dòng)物暴露于包含肽的抗原，使得該肽遞呈在該非人動(dòng)物的mhc上，從而在該動(dòng)物中誘導(dǎo)對(duì)該肽的t細(xì)胞應(yīng)答。

在一些實(shí)施例中，其上遞呈肽的mhc為i類(lèi)mhc。在一些實(shí)施例中，i類(lèi)mhc為hla-a、hla-b、hla-c、hla-e、hla-f或hla-g。在一些實(shí)施例中，該肽的長(zhǎng)度為8-10個(gè)氨基酸。

在一些實(shí)施例中，其上遞呈肽的mhc為ii類(lèi)mhc。在一些實(shí)施例中，ii類(lèi)mhc為hla-dm、hla-do、hla-dp、hla-dq或hla-dr。在一些實(shí)施例中，該肽的長(zhǎng)度為10-25個(gè)氨基酸。在一些實(shí)施例中，該肽的長(zhǎng)度為13-25個(gè)氨基酸。在一些實(shí)施例中，該肽的長(zhǎng)度為15-18個(gè)氨基酸。

在一些實(shí)施例中，該肽包含癌相關(guān)抗原的表位。癌相關(guān)抗原的例子包括但不限于親脂素、aim-2、aldh1a1、α-輔肌動(dòng)蛋白-4、甲胎蛋白(“afp”)、artc1、b-raf、bage-1、bclx(l)、bcr-abl融合蛋白b3a2、β-聯(lián)蛋白、bing-4、ca-125、calca、癌胚抗原(“cea”)、casp-5、casp-8、cd274、cd45、cdc27、cdk12、cdk4、cdkn2a、cea、clpp、coa-1、cpsf、csnk1a1、ctag1、ctag2、細(xì)胞周期蛋白d1、細(xì)胞周期蛋白-a1、dek-can融合蛋白、dkk1、eftud2、延伸因子2、enah(hmena)、ep-cam、epcam、epha3、上皮腫瘤抗原(“eta”)、etv6-aml1融合蛋白、ezh2、fgf5、flt3-itd、fn1、g250/mn/caix、gage-1,2,8、gage-3,4,5,6,7、gas7、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3、gntv、gp100/pmel17、gpnmb、haus3、hepsin、her-2/neu、herv-k-mel、hla-a11、hla-a2、hla-dob、hsp70-2、ido1、igf2b3、il13rα2、腸羧酸酯酶、k-ras、激肽釋放酶4、kif20a、kk-lc-1、kklc1、km-hn-1、kmhn1(也稱(chēng)為ccdc110)、lage-1、ldlr-巖藻糖轉(zhuǎn)移酶as融合蛋白、lengsin、m-csf、mage-a1、mage-a10、mage-a12、mage-a2、mage-a3、mage-a4、mage-a6、mage-a9、mage-c1、mage-c2、蘋(píng)果酸酶、乳腺球蛋白-a、mart2、matn、mc1r、mcsp、mdm-2、me1、melan-a/mart-1、meloe、midkine、mmp-2、mmp-7、muc1、muc5ac、粘蛋白、mum-1、mum-2、mum-3、肌球蛋白、肌球蛋白i類(lèi)、n-raw、na88-a、neo-pap、nfyc、ny-br-1、ny-eso-1/lage-2、oa1、ogt、os-9、p多肽、p53、pap、pax5、pbf、pml-rarα融合蛋白、多形上皮粘蛋白(“pem”)、ppp1r3b、prame、prdx5、psa、psma、ptprk、rab38/ny-mel-1、rage-1、rbaf600、rgs5、rhoc、rnf43、ru2as、sage、secernin1、sirt2、snrpd1、sox10、sp17、spa17、ssx-2、ssx-4、steap1、生存素、syt-ssx1或-ssx2融合蛋白、tag-1、tag-2、端粒酶、tgf-βrii、tpbg、trag-3、磷酸丙糖異構(gòu)酶、trp-1/gp75、trp-2、trp2-int2、酪氨酸酶、酪氨酸酶(“tyr”)、vegf、wt1、xage-1b/gaged2a。在一些實(shí)施例中，該抗原為新抗原。

在某個(gè)實(shí)施例中，該肽包含由傳染性病原體表達(dá)的抗原的表位。在一些實(shí)施例中，病原體為病毒、細(xì)菌、真菌、蠕蟲(chóng)或原蟲(chóng)。例如，在一些實(shí)施例中，病毒為hpv、hbv、丙型肝炎病毒(hcv)、逆轉(zhuǎn)錄病毒如人類(lèi)免疫缺陷病毒(hiv-1和hiv-2)、皰疹病毒如eb病毒(ebv)、巨細(xì)胞病毒(cmv)、hsv-1和hsv-2，以及流感病毒。在一些實(shí)施例中，寄生蟲(chóng)為瘧原蟲(chóng)。在一些實(shí)施例中，病原體為曲霉、布魯線蟲(chóng)、念珠菌、衣原體、球蟲(chóng)、隱球菌、惡絲蟲(chóng)、淋球菌、組織胞漿菌、利什曼原蟲(chóng)、分枝桿菌、支原體、草履蟲(chóng)、百日咳菌、瘧原蟲(chóng)、肺炎球菌、肺囊蟲(chóng)、立克次氏體、沙門(mén)氏菌、志賀氏菌、葡萄球菌、鏈球菌、弓形蟲(chóng)和霍亂弧菌。示例性物種包括淋病奈瑟氏菌、結(jié)核分枝桿菌、白色念珠菌、熱帶念珠菌、陰道毛滴蟲(chóng)、陰道嗜血桿菌、b族鏈球菌、人型支原體、杜氏嗜血菌、腹股溝肉芽腫、性病性淋巴肉芽腫、梅毒螺旋體、流產(chǎn)布魯氏菌、馬耳他布魯氏菌、豬布魯氏菌、犬布魯氏菌、胎兒彎曲菌、胎兒彎曲菌腸亞種、波蒙納鉤端螺旋體、單核細(xì)胞增多性李斯特菌、綿羊布魯氏菌、鸚鵡熱衣原體、胎兒三毛滴蟲(chóng)、剛地弓形蟲(chóng)、大腸桿菌、馬放線桿菌、綿羊流產(chǎn)沙門(mén)菌、馬流產(chǎn)沙門(mén)菌、銅綠假單胞菌、馬棒狀桿菌、化膿棒狀桿菌、精液放線桿菌、牛生殖道支原體、煙曲霉、分枝犁頭霉、馬媾疫錐蟲(chóng)、駑巴貝斯蟲(chóng)、破傷風(fēng)梭菌、肉毒梭菌；或真菌，例如巴西副球孢子菌；或其他病原體，例如惡性瘧原蟲(chóng)。

在一些實(shí)施例中，所述肽包含這樣的蛋白的表位，該蛋白是炎性疾病、皮膚或器官移植排斥反應(yīng)、移植物抗宿主病(gvhd)或自身免疫疾病中的自身反應(yīng)性t細(xì)胞的靶標(biāo)。自身免疫疾病的例子包括例如腎小球腎炎、關(guān)節(jié)炎、擴(kuò)張性心肌病樣疾病、潰瘍性結(jié)腸炎、干燥綜合征、克羅恩病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、慢性類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化癥、銀屑病、變應(yīng)性接觸性皮炎、多肌炎、厚皮、結(jié)節(jié)性動(dòng)脈周?chē)住L(fēng)濕熱、尋常性白斑、胰島素依賴(lài)性糖尿病、白塞病、橋本病、愛(ài)迪生氏病、皮肌炎、重癥肌無(wú)力、賴(lài)特綜合征、格雷夫斯病、惡性貧血、肺出血腎炎綜合征、不育癥、慢性活動(dòng)性肝炎、天皰瘡、自身免疫性血小板減少性紫癜和自身免疫性溶血性貧血、活動(dòng)性慢性肝炎、愛(ài)迪生氏病、抗磷脂綜合征、特應(yīng)性變態(tài)反應(yīng)、自身免疫性萎縮性胃炎、自身免疫性胃酸缺乏、乳糜瀉、庫(kù)欣綜合征、皮肌炎、盤(pán)狀狼瘡、紅斑狼瘡、肺出血腎炎綜合征、橋本甲狀腺炎、特發(fā)性腎上腺萎縮、特發(fā)性血小板減少癥、胰島素依賴(lài)性糖尿病、蘭伯特-伊頓綜合征、類(lèi)狼瘡肝炎、淋巴細(xì)胞減少癥的一些病例、混合性結(jié)締組織病、類(lèi)天皰瘡、尋常天皰瘡、惡性貧血、晶狀體源性葡萄膜炎、結(jié)節(jié)性多動(dòng)脈炎、自身免疫性多腺體綜合征、原發(fā)性膽汁性肝硬化、原發(fā)性硬化性膽管炎、雷諾氏綜合征、復(fù)發(fā)性多軟骨炎、施密特氏綜合征、局限性硬皮病(或crest綜合征)、交感性眼炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、大動(dòng)脈炎、顳動(dòng)脈炎、甲狀腺毒癥、b型胰島素抵抗、潰瘍性結(jié)腸炎和韋格納氏肉芽腫。自身反應(yīng)性t細(xì)胞所靶向的示例性蛋白質(zhì)包括例如p205、胰島素、促甲狀腺激素、酪氨酸酶、trp1和髓磷脂。

在一些實(shí)施例中，通過(guò)給非人動(dòng)物施用包含編碼該肽的核酸序列的病毒(例如，逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、牛痘病毒或慢病毒)，而使經(jīng)遺傳修飾的非人動(dòng)物暴露于該肽。用于病毒疫苗接種的方法例如在美國(guó)專(zhuān)利no.6,001,349、no.8,663,622、no.8,691,502、no.8,377,688以及precopioetal.,jem204:1405-1416(2007)(precopio等人，《實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志》，第204卷，第1405-1416頁(yè)，2007年)中提供，這些專(zhuān)利和文獻(xiàn)中的每一篇均據(jù)此全文以引用方式并入。在一些實(shí)施例中，直接向非人動(dòng)物施用病毒，使得非人動(dòng)物加工抗原并將抗原遞呈在其mhc上。在一些實(shí)施例中，以體外或離體方式用病毒感染細(xì)胞(例如，抗原遞呈細(xì)胞，如樹(shù)突細(xì)胞)，然后給非人動(dòng)物施用該細(xì)胞。在一些實(shí)施例中，該病毒編碼肽/mhc復(fù)合體(例如，單鏈肽/mhc復(fù)合體)?；趩捂滊?mhc的疫苗的例子在truscottetal.,j.immunol.178:6280-6289(2007)(truscott等人，《免疫學(xué)雜志》，第178卷，第6280-6289頁(yè)，2007年)、ep1773383、kimetal.,vaccine30:2178-2186(2012)(kim等人，《疫苗》，第30卷，第2178-2186頁(yè)，2012年)、kimetal.,j.immunol.184:4423-4430(2010)(kim等人，《免疫學(xué)雜志》，第184卷，第4423-4430頁(yè)，2010年)中提供，這些文獻(xiàn)和專(zhuān)利中的每一篇均據(jù)此以引用方式并入。

在一些實(shí)施例中，通過(guò)給經(jīng)遺傳修飾的非人動(dòng)物施用編碼該肽的核酸，使得該肽在該非人動(dòng)物中表達(dá)，而使該動(dòng)物暴露于該肽。在一些實(shí)施例中，給非人動(dòng)物施用編碼單鏈肽/mhc復(fù)合體的核酸。基于單鏈肽/mhc的疫苗的例子在truscottetal.,j.immunol.178:6280-6289(2007)(truscott等人，《免疫學(xué)雜志》，第178卷，第6280-6289頁(yè)，2007年)、ep1773383、kimetal.,vaccine30:2178-2186(2012)(kim等人，《疫苗》，第30卷，第2178-2186頁(yè)，2012年)、kimetal.,j.immunol.184:4423-4430(2010)(kim等人，《免疫學(xué)雜志》，第184卷，第4423-4430頁(yè)，2010年)中提供，這些文獻(xiàn)和專(zhuān)利中的每一篇均據(jù)此以引用方式并入。在某些實(shí)施例中，該核酸為dna載體。核酸的遞送可采用本領(lǐng)域已知的任何技術(shù)，包括病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移和脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移。目標(biāo)多核苷酸與脂質(zhì)體相結(jié)合而形成基因遞送媒介，如在例如美國(guó)專(zhuān)利no.6,770,291、no.7,001,614、no.6,749,863、no.5,512,295和no.7,112,338中所述，這些專(zhuān)利中的每一篇均據(jù)此以引用方式并入。在一些實(shí)施例中，該核酸為mrna載體。用于生成和施用mrna載體的示例性方法在例如美國(guó)專(zhuān)利no.8,278,036和美國(guó)專(zhuān)利公布no.2013/151736和no.2012/135805中所述，這些專(zhuān)利公布中的每一篇均據(jù)此以引用方式并入。

在一些實(shí)施例中，通過(guò)給經(jīng)遺傳修飾的非人動(dòng)物施用肽/mhc復(fù)合體，而使經(jīng)遺傳修飾的非人動(dòng)物暴露于該肽。在一些實(shí)施例中，給非人動(dòng)物施用單鏈肽/mhc復(fù)合體(例如，單鏈胞外mhc/β-2-微球蛋白/肽蛋白復(fù)合體)。在一些實(shí)施例中，肽/mhc復(fù)合體作為多聚體(例如，二聚體、三聚體、四聚體)施用。在一些實(shí)施例中，肽/mhc復(fù)合體存在于細(xì)胞的表面上。用于生成和施用肽/mhc復(fù)合體的示例性方法在美國(guó)專(zhuān)利no.6,045,796、no.5,869,270和no.7,141,656、truscottetal.,j.immunol.178:6280-6289(2007)(truscott等人，《免疫學(xué)雜志》，第178卷，第6280-6289頁(yè)，2007年)、ep1773383、kimetal.,vaccine30:2178-2186(2012)(kim等人，《疫苗》，第30卷，第2178-2186頁(yè)，2012年)、kimetal.,j.immunol.184:4423-4430(2010)(kim等人，《免疫學(xué)雜志》，第184卷，第4423-4430頁(yè)，2010年)以及l(fā)ivingstonemethods:acompaniontomethodsinenzymology9:422-429(1996)(livingstone，《方法：酶學(xué)方法指南》，第9卷，第422-429頁(yè)，1996年)中提供，這些專(zhuān)利和文獻(xiàn)中的每一篇均據(jù)此以引用方式并入。

在本文所述方法的一些實(shí)施例中，該方法包括從經(jīng)遺傳修飾的非人動(dòng)物獲得表達(dá)對(duì)肽/mhc復(fù)合體具有特異性的car的t細(xì)胞的步驟。在某些實(shí)施例中，可使用本領(lǐng)域已知的任何方法來(lái)獲得此類(lèi)t細(xì)胞。例如，可從動(dòng)物的脾、淋巴結(jié)和/或外周血獲得此類(lèi)t細(xì)胞?？墒褂帽绢I(lǐng)域中可用的方法針對(duì)結(jié)合特異性來(lái)篩選此類(lèi)t細(xì)胞。例如，可使用上樣于固相載體(諸如管柱或微珠如磁珠)上的肽/mhc復(fù)合體，來(lái)純化表達(dá)對(duì)特定肽/mhc復(fù)合體具有特異性的car的細(xì)胞，或者可使用標(biāo)記的肽/mhc對(duì)此類(lèi)t細(xì)胞進(jìn)行染色，然后可使用熒光激活細(xì)胞分選(facs)和/或磁激活細(xì)胞分選(macs)進(jìn)行純化。

在一些實(shí)施例中，本文所述方法包括由t細(xì)胞制備t細(xì)胞雜交瘤的步驟?？捎糜谥苽鋞細(xì)胞雜交瘤的方法是本領(lǐng)域已知的，并且例如在hedricketal.,cell30:141-152(1982)(hedrick等人，《細(xì)胞》，第30卷，第141-152頁(yè)，1982年)和kruisbeekcurr.protoc.immunol.chapter3(2001)(kruisbeek，《免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室指南》，第3章，2001年)以及whiteetal.,methodsinmolecularbiology134:185-193(2000)(white等人，《分子生物學(xué)方法》，第134卷，第185-193頁(yè)，2000年)中有描述，這些文獻(xiàn)中的每一篇均據(jù)此以引用方式并入。

在一些實(shí)施例中，本文所提供的方法包括從t細(xì)胞分離編碼car的ig可變結(jié)構(gòu)域的核酸的步驟。在本文所述方法的一些實(shí)施例中，可使用任何方法來(lái)分離編碼ig可變結(jié)構(gòu)域的核酸。

在一些實(shí)施例中，分離核酸的步驟包括由t細(xì)胞制備t細(xì)胞雜交瘤并且從該t細(xì)胞雜交瘤分離核酸。在一些實(shí)施例中，使用核酸擴(kuò)增方法分離核酸。例如，在一些實(shí)施例中，核酸擴(kuò)增方法為聚合酶鏈反應(yīng)(pcr)、連接酶鏈反應(yīng)(lcr)、鏈置換擴(kuò)增(sda)、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增(tma)、自主序列復(fù)制(3sr)、基于qβ復(fù)制酶的擴(kuò)增、基于核酸序列的擴(kuò)增(nasba)、修復(fù)鏈反應(yīng)(rcr)、自返式dna擴(kuò)增(boomerangdnaamplification,bda)或滾環(huán)擴(kuò)增(rca)。

在一些實(shí)施例中，通過(guò)對(duì)t細(xì)胞或t細(xì)胞雜交瘤的car基因座中的重排ig可變區(qū)基因進(jìn)行測(cè)序并合成包含該重排ig可變區(qū)基因的核酸序列來(lái)分離核酸。示例性核酸測(cè)序方法包括但不限于鏈終止測(cè)序、連接測(cè)序、邊合成邊測(cè)序、焦磷酸測(cè)序、離子半導(dǎo)體測(cè)序、單分子實(shí)時(shí)測(cè)序、454測(cè)序和/或dilute-‘n’-go測(cè)序。

一旦獲得編碼重鏈和輕鏈ig可變區(qū)區(qū)段的dna片段，就可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)重組dna技術(shù)進(jìn)一步對(duì)這些dna片段進(jìn)行操縱，例如以將可變區(qū)基因轉(zhuǎn)變?yōu)槿L(zhǎng)抗體鏈基因、轉(zhuǎn)變?yōu)閒ab片段基因或轉(zhuǎn)變?yōu)閟cfv基因。在這些操縱中，編碼可變結(jié)構(gòu)域的dna片段有效連接至編碼另一種蛋白(例如，抗體恒定結(jié)構(gòu)域或柔性接頭)的另一dna片段。如該語(yǔ)境中所用，術(shù)語(yǔ)“有效連接”旨在意指這兩個(gè)dna片段接合在一起，使得由這兩個(gè)dna片段編碼的氨基酸序列保持同框。

可通過(guò)將編碼重鏈可變結(jié)構(gòu)域的分離dna有效連接至編碼重鏈恒定結(jié)構(gòu)域(ch1、ch2和ch3)的另一dna分子，而將編碼重鏈可變結(jié)構(gòu)域的分離dna轉(zhuǎn)變?yōu)槿L(zhǎng)重鏈基因。人重鏈恒定區(qū)基因的序列是本領(lǐng)域已知的(參見(jiàn)例如kabat,e.a.,etal.(1991)sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,fifthedition,u.s.departmentofhealthandhumanservices,nihpublicationno.91-3242(kabat,e.a。等人，1991年，《具有免疫學(xué)重要性的蛋白序列》，第五版，美國(guó)衛(wèi)生和公眾服務(wù)部，nih出版物編號(hào)91-3242))，并且可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)pcr擴(kuò)增來(lái)獲得涵蓋這些區(qū)域的dna片段。重鏈恒定結(jié)構(gòu)域可為igg1、igg2、igg3、igg4、iga、ige、igm或igd恒定結(jié)構(gòu)域，但最優(yōu)選地為igg1或igg4恒定結(jié)構(gòu)域。對(duì)于fab片段重鏈基因而言，編碼vh的dna可有效連接至僅編碼重鏈ch1恒定結(jié)構(gòu)域的另一dna分子。

可通過(guò)將編碼輕鏈ig可變結(jié)構(gòu)域的分離dna有效連接至編碼輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域(例如，κ或λ恒定結(jié)構(gòu)域)的另一dna分子，而將編碼輕鏈ig可變結(jié)構(gòu)域的分離dna轉(zhuǎn)變?yōu)槿L(zhǎng)輕鏈基因(以及fab輕鏈基因)。人輕鏈恒定區(qū)基因的序列是本領(lǐng)域已知的(參見(jiàn)例如kabat,e.a.,etal.(1991)sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,fifthedition,u.s.departmentofhealthandhumanservices,nihpublicationno.91-3242(kabat,e.a.等人，1991年，《具有免疫學(xué)重要性的蛋白序列》，第五版，美國(guó)衛(wèi)生和公眾服務(wù)部，nih出版物編號(hào)91-3242))，并且可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)pcr擴(kuò)增來(lái)獲得涵蓋這些區(qū)域的dna片段。

因此，在一些實(shí)施例中，本文所述方法包括將編碼重鏈ig可變結(jié)構(gòu)域的核酸序列與編碼重鏈ig恒定結(jié)構(gòu)域的核酸序列在宿主細(xì)胞中有效連接，使得宿主細(xì)胞表達(dá)包含ig重鏈可變結(jié)構(gòu)域和ig重鏈恒定結(jié)構(gòu)域的ig重鏈多肽的步驟。在一些實(shí)施例中，該方法包括將編碼輕鏈ig可變結(jié)構(gòu)域的核酸序列與編碼輕鏈ig恒定結(jié)構(gòu)域的核酸序列在宿主細(xì)胞中有效連接，使得宿主細(xì)胞表達(dá)包含ig輕鏈可變結(jié)構(gòu)域和ig重鏈恒定結(jié)構(gòu)域的ig輕鏈多肽的步驟。在一些實(shí)施例中，該方法包括將編碼重鏈ig可變結(jié)構(gòu)域的核酸序列與編碼重鏈ig恒定結(jié)構(gòu)域的核酸序列在宿主細(xì)胞中有效連接，并且將編碼輕鏈ig可變結(jié)構(gòu)域的核酸序列與編碼輕鏈ig恒定結(jié)構(gòu)域的核酸序列在宿主細(xì)胞中有效連接，使得宿主細(xì)胞表達(dá)這樣的抗體的步驟，該抗體具有包含重鏈ig可變結(jié)構(gòu)域和重鏈ig恒定結(jié)構(gòu)域的重鏈以及包含輕鏈ig可變結(jié)構(gòu)域和輕鏈ig恒定結(jié)構(gòu)域的輕鏈?？墒褂帽绢I(lǐng)域熟知的標(biāo)準(zhǔn)分子生物技術(shù)使ig可變區(qū)與ig恒定區(qū)相連。在一些實(shí)施例中，可使用任何能夠表達(dá)免疫球蛋白多肽的宿主細(xì)胞。在一些實(shí)施例中，該細(xì)胞為cho細(xì)胞、hek-293細(xì)胞、bhk細(xì)胞、ns0細(xì)胞、sp2/0細(xì)胞或vero細(xì)胞。

在一些實(shí)施例中，本文所提供的方法包括將編碼重鏈ig可變結(jié)構(gòu)域的核酸序列與編碼tcr恒定結(jié)構(gòu)域(例如，tcrβ恒定結(jié)構(gòu)域或tcrα恒定結(jié)構(gòu)域)的核酸序列在細(xì)胞(例如，人細(xì)胞，如人t細(xì)胞)中有效連接，使得該細(xì)胞表達(dá)包含ig重鏈可變結(jié)構(gòu)域和tcr恒定結(jié)構(gòu)域的car多肽的步驟。在一些實(shí)施例中，該方法包括將編碼輕鏈ig可變結(jié)構(gòu)域的核酸序列與編碼tcr恒定結(jié)構(gòu)域(例如，tcrβ恒定結(jié)構(gòu)域或tcrα恒定結(jié)構(gòu)域)的核酸序列在細(xì)胞(例如，人細(xì)胞，如人t細(xì)胞)中有效連接，使得該細(xì)胞表達(dá)包含ig輕鏈可變結(jié)構(gòu)域和tcr恒定結(jié)構(gòu)域的car多肽。在一些實(shí)施例中，該方法包括將編碼重鏈ig可變結(jié)構(gòu)域的核酸序列與第一tcr恒定結(jié)構(gòu)域(例如，tcrβ恒定結(jié)構(gòu)域或tcrα恒定結(jié)構(gòu)域)在細(xì)胞(例如，人細(xì)胞，如人t細(xì)胞)中有效連接，并且將編碼輕鏈ig可變結(jié)構(gòu)域的核酸序列與編碼第二tcr恒定結(jié)構(gòu)域(例如，如果第一tcr恒定結(jié)構(gòu)域?yàn)閠crα恒定結(jié)構(gòu)域，則其為tcrβ恒定結(jié)構(gòu)域，或者如果第一tcr恒定結(jié)構(gòu)域?yàn)閠crβ恒定結(jié)構(gòu)域，則其為tcrα恒定結(jié)構(gòu)域)的核酸序列在該細(xì)胞中有效連接，使得該細(xì)胞表達(dá)這樣的car，該car具有包含重鏈ig可變結(jié)構(gòu)域和第一tcr恒定結(jié)構(gòu)域的第一car鏈多肽以及包含輕鏈ig可變結(jié)構(gòu)域和第二tcr恒定結(jié)構(gòu)域的第二car多肽。在一些實(shí)施例中，tcr恒定結(jié)構(gòu)域?yàn)槿藅cr恒定結(jié)構(gòu)域?？墒褂帽绢I(lǐng)域熟知的標(biāo)準(zhǔn)分子生物技術(shù)使ig可變區(qū)與tcr恒定區(qū)相連。在一些實(shí)施例中，該細(xì)胞為從受試者分離的離體細(xì)胞(例如，離體人細(xì)胞，如離體人t細(xì)胞)。

抗體

在某些方面，本文提供了對(duì)肽/mhc復(fù)合體(例如，肽/i類(lèi)mhc復(fù)合體或肽/ii類(lèi)mhc復(fù)合體)具有結(jié)合特異性的抗體。在一些實(shí)施例中，所述抗體為全人源的。在一些實(shí)施例中，根據(jù)本文所述方法(例如，使用包含如本文所述的car基因座的非人動(dòng)物)可獲得和/或獲得car。

在某些實(shí)施例中，本文所提供的抗體和抗體片段能夠以不大于10^-6、10^-7、10^-8或10^-9m的解離常數(shù)特異性地結(jié)合肽/mhc復(fù)合體。在一些實(shí)施例中，抗體對(duì)肽/mhc復(fù)合體的結(jié)合親和力(如由kd表示)比在相同mhc蛋白遞呈無(wú)關(guān)肽時(shí)抗體對(duì)肽的親和力小至少10倍、小至少100倍或小至少1000倍。用于評(píng)價(jià)抗體的結(jié)合能力的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定法是本領(lǐng)域已知的，包括例如elisa、蛋白印跡和ria。也可通過(guò)本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定法，諸如通過(guò)biacore分析，評(píng)估抗體的結(jié)合動(dòng)力學(xué)(例如，結(jié)合親和力)。

在一些實(shí)施例中，抗體對(duì)肽/mhci類(lèi)復(fù)合體具有特異性。在一些實(shí)施例中，mhci類(lèi)為hla-a、hla-b、hla-c、hla-e、hla-f或hla-g。在一些實(shí)施例中，肽的長(zhǎng)度為8-10個(gè)氨基酸。

在一些實(shí)施例中，抗體對(duì)肽/mhci類(lèi)復(fù)合體具有特異性。在一些實(shí)施例中，mhcii類(lèi)為hla-dm、hla-do、hla-dp、hla-dq或hla-dr。在一些實(shí)施例中，該肽的長(zhǎng)度為10-25個(gè)氨基酸。在一些實(shí)施例中，該肽的長(zhǎng)度為13-25個(gè)氨基酸。在一些實(shí)施例中，該肽的長(zhǎng)度為15-18個(gè)氨基酸。

在一些實(shí)施例中，該肽包含癌相關(guān)抗原的表位。癌相關(guān)抗原的例子包括但不限于親脂素、aim-2、aldh1a1、α-輔肌動(dòng)蛋白-4、甲胎蛋白(“afp”)、artc1、b-raf、bage-1、bclx(l)、bcr-abl融合蛋白b3a2、β-聯(lián)蛋白、bing-4、ca-125、calca、癌胚抗原(“cea”)、casp-5、casp-8、cd274、cd45、cdc27、cdk12、cdk4、cdkn2a、cea、clpp、coa-1、cpsf、csnk1a1、ctag1、ctag2、細(xì)胞周期蛋白d1、細(xì)胞周期蛋白-a1、dek-can融合蛋白、dkk1、eftud2、延伸因子2、enah(hmena)、ep-cam、epcam、epha3、上皮腫瘤抗原(“eta”)、etv6-aml1融合蛋白、ezh2、fgf5、flt3-itd、fn1、g250/mn/caix、gage-1,2,8、gage-3,4,5,6,7、gas7、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3、gntv、gp100/pmel17、gpnmb、haus3、hepsin、her-2/neu、herv-k-mel、hla-a11、hla-a2、hla-dob、hsp70-2、ido1、igf2b3、il13rα2、腸羧酸酯酶、k-ras、激肽釋放酶4、kif20a、kk-lc-1、kklc1、km-hn-1、kmhn1(也稱(chēng)為ccdc110)、lage-1、ldlr-巖藻糖轉(zhuǎn)移酶as融合蛋白、lengsin、m-csf、mage-a1、mage-a10、mage-a12、mage-a2、mage-a3、mage-a4、mage-a6、mage-a9、mage-c1、mage-c2、蘋(píng)果酸酶、乳腺球蛋白-a、mart2、matn、mc1r、mcsp、mdm-2、me1、melan-a/mart-1、meloe、midkine、mmp-2、mmp-7、muc1、muc5ac、粘蛋白、mum-1、mum-2、mum-3、肌球蛋白、肌球蛋白i類(lèi)、n-raw、na88-a、neo-pap、nfyc、ny-br-1、ny-eso-1/lage-2、oa1、ogt、os-9、p多肽、p53、pap、pax5、pbf、pml-rarα融合蛋白、多形上皮粘蛋白(“pem”)、ppp1r3b、prame、prdx5、psa、psma、ptprk、rab38/ny-mel-1、rage-1、rbaf600、rgs5、rhoc、rnf43、ru2as、sage、secernin1、sirt2、snrpd1、sox10、sp17、spa17、ssx-2、ssx-4、steap1、生存素、syt-ssx1或-ssx2融合蛋白、tag-1、tag-2、端粒酶、tgf-βrii、tpbg、trag-3、磷酸丙糖異構(gòu)酶、trp-1/gp75、trp-2、trp2-int2、酪氨酸酶、酪氨酸酶(“tyr”)、vegf、wt1、xage-1b/gaged2a。在一些實(shí)施例中，該抗原為新抗原。

在某個(gè)實(shí)施例中，該肽包含由傳染性病原體表達(dá)的抗原的表位。在一些實(shí)施例中，病原體為病毒、細(xì)菌、真菌、蠕蟲(chóng)或原蟲(chóng)。例如，在一些實(shí)施例中，病毒為hpv、hbv、丙型肝炎病毒(hcv)、逆轉(zhuǎn)錄病毒如人類(lèi)免疫缺陷病毒(hiv-1和hiv-2)、皰疹病毒如eb病毒(ebv)、巨細(xì)胞病毒(cmv)、hsv-1和hsv-2，以及流感病毒。在一些實(shí)施例中，寄生蟲(chóng)為瘧原蟲(chóng)。在一些實(shí)施例中，病原體為曲霉、布魯線蟲(chóng)、念珠菌、衣原體、球蟲(chóng)、隱球菌、惡絲蟲(chóng)、淋球菌、組織胞漿菌、利什曼原蟲(chóng)、分枝桿菌、支原體、草履蟲(chóng)、百日咳菌、瘧原蟲(chóng)、肺炎球菌、肺囊蟲(chóng)、立克次氏體、沙門(mén)氏菌、志賀氏菌、葡萄球菌、鏈球菌、弓形蟲(chóng)和霍亂弧菌。示例性物種包括淋病奈瑟氏菌、結(jié)核分枝桿菌、白色念珠菌、熱帶念珠菌、陰道毛滴蟲(chóng)、陰道嗜血桿菌、b族鏈球菌、人型支原體、杜氏嗜血菌、腹股溝肉芽腫、性病性淋巴肉芽腫、梅毒螺旋體、流產(chǎn)布魯氏菌、馬耳他布魯氏菌、豬布魯氏菌、犬布魯氏菌、胎兒彎曲菌、胎兒彎曲菌腸亞種、波蒙納鉤端螺旋體、單核細(xì)胞增多性李斯特菌、綿羊布魯氏菌、鸚鵡熱衣原體、胎兒三毛滴蟲(chóng)、剛地弓形蟲(chóng)、大腸桿菌、馬放線桿菌、綿羊流產(chǎn)沙門(mén)菌、馬流產(chǎn)沙門(mén)菌、銅綠假單胞菌、馬棒狀桿菌、化膿棒狀桿菌、精液放線桿菌、牛生殖道支原體、煙曲霉、分枝犁頭霉、馬媾疫錐蟲(chóng)、駑巴貝斯蟲(chóng)、破傷風(fēng)梭菌、肉毒梭菌；或真菌，例如巴西副球孢子菌；或其他病原體，例如惡性瘧原蟲(chóng)。

在一些實(shí)施例中，該肽包含這樣的蛋白的表位，該蛋白是炎性疾病、皮膚或器官移植排斥反應(yīng)、移植物抗宿主病(gvhd)或自身免疫疾病中的自身反應(yīng)性t細(xì)胞的靶標(biāo)。自身免疫疾病的例子包括例如腎小球腎炎、關(guān)節(jié)炎、擴(kuò)張性心肌病樣疾病、潰瘍性結(jié)腸炎、干燥綜合征、克羅恩病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、慢性類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化癥、銀屑病、變應(yīng)性接觸性皮炎、多肌炎、厚皮、結(jié)節(jié)性動(dòng)脈周?chē)?、風(fēng)濕熱、尋常性白斑、胰島素依賴(lài)性糖尿病、白塞病、橋本病、愛(ài)迪生氏病、皮肌炎、重癥肌無(wú)力、賴(lài)特綜合征、格雷夫斯病、惡性貧血、肺出血腎炎綜合征、不育癥、慢性活動(dòng)性肝炎、天皰瘡、自身免疫性血小板減少性紫癜和自身免疫性溶血性貧血、活動(dòng)性慢性肝炎、愛(ài)迪生氏病、抗磷脂綜合征、特應(yīng)性變態(tài)反應(yīng)、自身免疫性萎縮性胃炎、自身免疫性胃酸缺乏、乳糜瀉、庫(kù)欣綜合征、皮肌炎、盤(pán)狀狼瘡、紅斑狼瘡、肺出血腎炎綜合征、橋本甲狀腺炎、特發(fā)性腎上腺萎縮、特發(fā)性血小板減少癥、胰島素依賴(lài)性糖尿病、蘭伯特-伊頓綜合征、類(lèi)狼瘡肝炎、淋巴細(xì)胞減少癥的一些病例、混合性結(jié)締組織病、類(lèi)天皰瘡、尋常天皰瘡、惡性貧血、晶狀體源性葡萄膜炎、結(jié)節(jié)性多動(dòng)脈炎、自身免疫性多腺體綜合征、原發(fā)性膽汁性肝硬化、原發(fā)性硬化性膽管炎、雷諾氏綜合征、復(fù)發(fā)性多軟骨炎、施密特氏綜合征、局限性硬皮病(或crest綜合征)、交感性眼炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、大動(dòng)脈炎、顳動(dòng)脈炎、甲狀腺毒癥、b型胰島素抵抗、潰瘍性結(jié)腸炎和韋格納氏肉芽腫。自身反應(yīng)性t細(xì)胞所靶向的示例性蛋白質(zhì)包括例如p205、胰島素、促甲狀腺激素、酪氨酸酶、trp1和髓磷脂。

在一些實(shí)施例中，本文所提供的抗體包含人重鏈可變結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施例中，該抗體包含人重鏈恒定結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施例中，本文所提供的抗體包含igg1、igg2、igg3、igg4、iga、ige、igm或igd恒定結(jié)構(gòu)域。人重鏈恒定結(jié)構(gòu)域的序列是本領(lǐng)域已知的(參見(jiàn)例如kabat,e.a.,etal.(1991)sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,fifthedition,u.s.departmentofhealthandhumanservices,nihpublicationno.91-3242(kabat,e.a.等人，1991年，《具有免疫學(xué)重要性的蛋白序列》，第五版，美國(guó)衛(wèi)生和公眾服務(wù)部，nih出版物編號(hào)91-3242))。在一些實(shí)施例中，本文所提供的抗體不含重鏈恒定結(jié)構(gòu)域或其一部分。

在一些實(shí)施例中，本文所提供的抗體包含經(jīng)修飾的fc結(jié)構(gòu)域(例如，改變fc與fc受體之間的相互作用的突變)。例如，在一些實(shí)施例中，本文所提供的抗體包含在位置235、236、237、239、265、267、268、269、270、298、326、327、330、332、350、351、366、392、394、405和/或407(使用eu編號(hào)系統(tǒng))處對(duì)其fc結(jié)構(gòu)域的修飾。在一些實(shí)施例中，所述修飾選自l235a、g236e、g237f、s239e、s239d、d265e、d265s、s267e、s267d、s267g、h268e、h268d、e269l、d270n、d270e、s298a、k326a、k326d、a327h、a327v、a327l、a330i、a330s、i332e、t350v、l351y、t366l、k392m、k392l、t394w、f405a和/或y407v(使用eu編號(hào)系統(tǒng))。在一些實(shí)施例中，所述抗體包含對(duì)其fc結(jié)構(gòu)域的多種修飾。在一些實(shí)施例中，所述多種修飾選自d270n/k326d、s239e/s298a/k326a/a327h、l235a/s239e/d265e/a327h、g236e/g237f/s239e、g237f/s239e/d265e、g327f/s239e/h268d、g236e/d270n/a327v/i332e、g237f/s239e/a327h、g237f/a327l/a330i、s239d/d265s/s298a/i332e、s239e/d265s/h268d/i332e、s239e/d265s/i332e、s239e/s267e/h268d、s239e/a327l/a330i、d265e/s267d/a330s、s267g/h268e/d270e、h268d/e269l/s298a/k326a/a327h、h268d//k326a/a327h。附加的fc修飾及fc修飾的組合在美國(guó)專(zhuān)利no.5,624,821、no.5,648,260、no.6,528,624、no.6,737,056、no.7,122,637、no.7,183,387、no.7,297,775、no.7,317,091、no.7,332,581、no.7,632,497、no.7,662,925、no.7,695,936、no.8,093,359、no.8,216,805、no.8,218,805、no.8,388,955和no.8,937,158以及美國(guó)專(zhuān)利公布no.2005/0054832、no.2006/0222653、no.2006/0275282、no.2006/0275283、no.2007/0190063、no.2008/0154025、no.2009/0042291、no.2013/0108623和no.2013/0089541中提供，這些專(zhuān)利和專(zhuān)利公布中的每一篇均據(jù)此以引用方式并入。

在一些實(shí)施例中，所述抗體為雙特異性抗體。在一些實(shí)施例中，雙特異性抗體的兩個(gè)抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域具有不同的重鏈可變結(jié)構(gòu)域，但具有相同的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施例中，重鏈的fc結(jié)構(gòu)域包含有利于重鏈異二聚體形成和/或抑制重鏈同二聚體形成的修飾。此類(lèi)修飾例如在美國(guó)專(zhuān)利no.5,731,168、no.5,807,706、no.5,821,333、no.7,642,228和no.8,679,785中以及在美國(guó)專(zhuān)利公布no.2013/0195849中提供，這些專(zhuān)利和專(zhuān)利公布中的每一篇均據(jù)此以引用方式并入。

在一些實(shí)施例中，本文所提供的抗體具有人輕鏈可變結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施例中，輕鏈可變結(jié)構(gòu)域?yàn)棣溯p鏈可變結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施例中，輕鏈可變結(jié)構(gòu)域?yàn)棣瘦p鏈可變結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施例中，所述抗體具有人輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施例中，輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域?yàn)棣溯p鏈恒定結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施例中，輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域?yàn)棣瘦p鏈恒定結(jié)構(gòu)域。人輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域的序列是本領(lǐng)域已知的(參見(jiàn)例如kabat,e.a.,etal.(1991)sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,fifthedition,u.s.departmentofhealthandhumanservices,nihpublicationno.91-3242(kabat,e.a.等人，1991年，《具有免疫學(xué)重要性的蛋白序列》，第五版，美國(guó)衛(wèi)生和公眾服務(wù)部，nih出版物編號(hào)91-3242))。

在一些實(shí)施例中，本文所述抗體為完整抗體。在一些實(shí)施例中，本文所述抗體為保留抗原結(jié)合的抗體片段。在一些實(shí)施例中，所述抗體片段為fab、fab'、f(ab')2、fv、scfv、二硫鍵連接的fv、fd、單鏈抗體、分離的cdrh3或另一個(gè)保留完整抗體的可變結(jié)構(gòu)域的至少一部分的抗體片段。

嵌合抗原受體

在某些方面，本文提供了對(duì)肽/mhc復(fù)合體(例如，肽/i類(lèi)mhc復(fù)合體或肽/ii類(lèi)mhc復(fù)合體)具有結(jié)合特異性的嵌合抗原受體(car)。在一些實(shí)施例中，所述car為全人源的。在一些實(shí)施例中，根據(jù)本文所述方法(例如，使用包含如本文所述的car基因座的非人動(dòng)物)可獲得和/或獲得car。

在一些實(shí)施例中，car以對(duì)應(yīng)于小于10^-7m、10^-8m或10^-9m的kd的親和力結(jié)合至肽/mhc復(fù)合體。在一些實(shí)施例中，car對(duì)肽/mhc復(fù)合體的結(jié)合親和力(如由kd表示)比car對(duì)未由mhc遞呈時(shí)的肽的親和力小至少10倍、小至少100倍或小至少1000倍。在一些實(shí)施例中，car對(duì)肽/mhc復(fù)合體的結(jié)合親和力(如由kd表示)比在相同mhc蛋白遞呈無(wú)關(guān)肽時(shí)car對(duì)肽的親和力小至少10倍、小至少100倍或小至少1000倍。用于評(píng)價(jià)car的結(jié)合能力的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定法是本領(lǐng)域已知的，包括例如elisa、蛋白印跡和ria。也可通過(guò)本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定法，諸如通過(guò)biacore分析，評(píng)估car的結(jié)合動(dòng)力學(xué)(例如，結(jié)合親和力)。

在一些實(shí)施例中，car對(duì)肽/mhci類(lèi)復(fù)合體具有特異性。在一些實(shí)施例中，mhci類(lèi)為hla-a、hla-b、hla-c、hla-e、hla-f或hla-g。在一些實(shí)施例中，肽的長(zhǎng)度為8-10個(gè)氨基酸。

在一些實(shí)施例中，car對(duì)肽/mhci類(lèi)復(fù)合體具有特異性。在一些實(shí)施例中，mhcii類(lèi)為hla-dm、hla-do、hla-dp、hla-dq或hla-dr。在一些實(shí)施例中，該肽的長(zhǎng)度為10-25個(gè)氨基酸。在一些實(shí)施例中，該肽的長(zhǎng)度為13-25個(gè)氨基酸。在一些實(shí)施例中，該肽的長(zhǎng)度為15-18個(gè)氨基酸。

在一些實(shí)施例中，該肽包含癌相關(guān)抗原的表位。癌相關(guān)抗原的例子包括但不限于親脂素、aim-2、aldh1a1、α-輔肌動(dòng)蛋白-4、甲胎蛋白(“afp”)、artc1、b-raf、bage-1、bclx(l)、bcr-abl融合蛋白b3a2、β-聯(lián)蛋白、bing-4、ca-125、calca、癌胚抗原(“cea”)、casp-5、casp-8、cd274、cd45、cdc27、cdk12、cdk4、cdkn2a、cea、clpp、coa-1、cpsf、csnk1a1、ctag1、ctag2、細(xì)胞周期蛋白d1、細(xì)胞周期蛋白-a1、dek-can融合蛋白、dkk1、eftud2、延伸因子2、enah(hmena)、ep-cam、epcam、epha3、上皮腫瘤抗原(“eta”)、etv6-aml1融合蛋白、ezh2、fgf5、flt3-itd、fn1、g250/mn/caix、gage-1,2,8、gage-3,4,5,6,7、gas7、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3、gntv、gp100/pmel17、gpnmb、haus3、hepsin、her-2/neu、herv-k-mel、hla-a11、hla-a2、hla-dob、hsp70-2、ido1、igf2b3、il13rα2、腸羧酸酯酶、k-ras、激肽釋放酶4、kif20a、kk-lc-1、kklc1、km-hn-1、kmhn1(也稱(chēng)為ccdc110)、lage-1、ldlr-巖藻糖轉(zhuǎn)移酶as融合蛋白、lengsin、m-csf、mage-a1、mage-a10、mage-a12、mage-a2、mage-a3、mage-a4、mage-a6、mage-a9、mage-c1、mage-c2、蘋(píng)果酸酶、乳腺球蛋白-a、mart2、matn、mc1r、mcsp、mdm-2、me1、melan-a/mart-1、meloe、midkine、mmp-2、mmp-7、muc1、muc5ac、粘蛋白、mum-1、mum-2、mum-3、肌球蛋白、肌球蛋白i類(lèi)、n-raw、na88-a、neo-pap、nfyc、ny-br-1、ny-eso-1/lage-2、oa1、ogt、os-9、p多肽、p53、pap、pax5、pbf、pml-rarα融合蛋白、多形上皮粘蛋白(“pem”)、ppp1r3b、prame、prdx5、psa、psma、ptprk、rab38/ny-mel-1、rage-1、rbaf600、rgs5、rhoc、rnf43、ru2as、sage、secernin1、sirt2、snrpd1、sox10、sp17、spa17、ssx-2、ssx-4、steap1、生存素、syt-ssx1或-ssx2融合蛋白、tag-1、tag-2、端粒酶、tgf-βrii、tpbg、trag-3、磷酸丙糖異構(gòu)酶、trp-1/gp75、trp-2、trp2-int2、酪氨酸酶、酪氨酸酶(“tyr”)、vegf、wt1、xage-1b/gaged2a。在一些實(shí)施例中，該抗原為新抗原。

在某個(gè)實(shí)施例中，該肽包含由傳染性病原體表達(dá)的抗原的表位。在一些實(shí)施例中，病原體為病毒、細(xì)菌、真菌、蠕蟲(chóng)或原蟲(chóng)。例如，在一些實(shí)施例中，病毒為hpv、hbv、丙型肝炎病毒(hcv)、逆轉(zhuǎn)錄病毒如人類(lèi)免疫缺陷病毒(hiv-1和hiv-2)、皰疹病毒如eb病毒(ebv)、巨細(xì)胞病毒(cmv)、hsv-1和hsv-2，以及流感病毒。在一些實(shí)施例中，寄生蟲(chóng)為瘧原蟲(chóng)。在一些實(shí)施例中，病原體為曲霉、布魯線蟲(chóng)、念珠菌、衣原體、球蟲(chóng)、隱球菌、惡絲蟲(chóng)、淋球菌、組織胞漿菌、利什曼原蟲(chóng)、分枝桿菌、支原體、草履蟲(chóng)、百日咳菌、瘧原蟲(chóng)、肺炎球菌、肺囊蟲(chóng)、立克次氏體、沙門(mén)氏菌、志賀氏菌、葡萄球菌、鏈球菌、弓形蟲(chóng)和霍亂弧菌。示例性物種包括淋病奈瑟氏菌、結(jié)核分枝桿菌、白色念珠菌、熱帶念珠菌、陰道毛滴蟲(chóng)、陰道嗜血桿菌、b族鏈球菌、人型支原體、杜氏嗜血菌、腹股溝肉芽腫、性病性淋巴肉芽腫、梅毒螺旋體、流產(chǎn)布魯氏菌、馬耳他布魯氏菌、豬布魯氏菌、犬布魯氏菌、胎兒彎曲菌、胎兒彎曲菌腸亞種、波蒙納鉤端螺旋體、單核細(xì)胞增多性李斯特菌、綿羊布魯氏菌、鸚鵡熱衣原體、胎兒三毛滴蟲(chóng)、剛地弓形蟲(chóng)、大腸桿菌、馬放線桿菌、綿羊流產(chǎn)沙門(mén)菌、馬流產(chǎn)沙門(mén)菌、銅綠假單胞菌、馬棒狀桿菌、化膿棒狀桿菌、精液放線桿菌、牛生殖道支原體、煙曲霉、分枝犁頭霉、馬媾疫錐蟲(chóng)、駑巴貝斯蟲(chóng)、破傷風(fēng)梭菌、肉毒梭菌；或真菌，例如巴西副球孢子菌；或其他病原體，例如惡性瘧原蟲(chóng)。

在一些實(shí)施例中，所述肽包含這樣的蛋白的表位，該蛋白是炎性疾病、皮膚或器官移植排斥反應(yīng)、移植物抗宿主病(gvhd)或自身免疫疾病中的自身反應(yīng)性t細(xì)胞的靶標(biāo)。自身免疫疾病的例子包括例如腎小球腎炎、關(guān)節(jié)炎、擴(kuò)張性心肌病樣疾病、潰瘍性結(jié)腸炎、干燥綜合征、克羅恩病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、慢性類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化癥、銀屑病、變應(yīng)性接觸性皮炎、多肌炎、厚皮、結(jié)節(jié)性動(dòng)脈周?chē)住L(fēng)濕熱、尋常性白斑、胰島素依賴(lài)性糖尿病、白塞病、橋本病、愛(ài)迪生氏病、皮肌炎、重癥肌無(wú)力、賴(lài)特綜合征、格雷夫斯病、惡性貧血、肺出血腎炎綜合征、不育癥、慢性活動(dòng)性肝炎、天皰瘡、自身免疫性血小板減少性紫癜和自身免疫性溶血性貧血、活動(dòng)性慢性肝炎、愛(ài)迪生氏病、抗磷脂綜合征、特應(yīng)性變態(tài)反應(yīng)、自身免疫性萎縮性胃炎、自身免疫性胃酸缺乏、乳糜瀉、庫(kù)欣綜合征、皮肌炎、盤(pán)狀狼瘡、紅斑狼瘡、肺出血腎炎綜合征、橋本甲狀腺炎、特發(fā)性腎上腺萎縮、特發(fā)性血小板減少癥、胰島素依賴(lài)性糖尿病、蘭伯特-伊頓綜合征、類(lèi)狼瘡肝炎、淋巴細(xì)胞減少癥的一些病例、混合性結(jié)締組織病、類(lèi)天皰瘡、尋常天皰瘡、惡性貧血、晶狀體源性葡萄膜炎、結(jié)節(jié)性多動(dòng)脈炎、自身免疫性多腺體綜合征、原發(fā)性膽汁性肝硬化、原發(fā)性硬化性膽管炎、雷諾氏綜合征、復(fù)發(fā)性多軟骨炎、施密特氏綜合征、局限性硬皮病(或crest綜合征)、交感性眼炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、大動(dòng)脈炎、顳動(dòng)脈炎、甲狀腺毒癥、b型胰島素抵抗、潰瘍性結(jié)腸炎和韋格納氏肉芽腫。自身反應(yīng)性t細(xì)胞所靶向的示例性蛋白質(zhì)包括例如p205、胰島素、促甲狀腺激素、酪氨酸酶、trp1和髓磷脂。

在一些實(shí)施例中，此類(lèi)car包含第一car多肽和第二car多肽，該第一car多肽包含ig重鏈可變結(jié)構(gòu)域和tcrβ恒定結(jié)構(gòu)域，并且該第二car多肽包含ig輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(例如，igκ可變結(jié)構(gòu)域或igλ可變結(jié)構(gòu)域)和tcrα恒定結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施例中，ig重鏈可變結(jié)構(gòu)域和/或ig輕鏈可變結(jié)構(gòu)域?yàn)槿薸g可變結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施例中，tcrβ恒定結(jié)構(gòu)域和/或tcrα恒定結(jié)構(gòu)域?yàn)榉侨撕愣ńY(jié)構(gòu)域(例如，大鼠或小鼠恒定結(jié)構(gòu)域)。在一些實(shí)施例中，tcrβ恒定結(jié)構(gòu)域和/或tcrα恒定結(jié)構(gòu)域?yàn)槿撕愣ńY(jié)構(gòu)域?？墒褂帽疚乃龇椒ɑ蚴褂帽绢I(lǐng)域已知的任何其他方法生成car的ig可變結(jié)構(gòu)域。例如，可使用本領(lǐng)域已知的方法(例如，使用噬菌體展示或酵母展示)生成抗肽/mhc抗體，然后可將編碼該抗體的可變結(jié)構(gòu)域的核酸序列連接至tcr恒定結(jié)構(gòu)域基因。對(duì)肽/mhc復(fù)合體具有結(jié)合特異性的抗體及用于產(chǎn)生此類(lèi)抗體的方法的例子例如在美國(guó)專(zhuān)利no.6,992,176、no.7,718,777和no.8,815,528中以及在stewart-jonesetal.,proc.nat’l.acad.sci.usa106:5784-88(2009)(stewart-jones等人，《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》，第106卷，第5784-5788頁(yè)，2009年)和hulsmeyeretal.,j.biol.chem.280:2972-80(2005)(hulsmeyer等人，《生物化學(xué)雜志》，第280卷，第2972-2980頁(yè)，2005年)中提供，這些專(zhuān)利和文獻(xiàn)中的每一篇均據(jù)此以引用方式并入。

藥物組合物

在某些實(shí)施例中，本文提供了包含與藥學(xué)上可接受的載體一起配制的本文所述至少一種藥劑(例如，本文所述抗體和/或本文所述car)的組合物，例如藥物組合物。

本文所提供的藥物組合物可被專(zhuān)門(mén)配制用于以固體或液體形式施用，包括適于以下施用方式的那些形式：(1)口服施用，例如灌服劑(水性或非水性溶液劑或混懸劑)、片劑(例如那些供頰內(nèi)、舌下和全身吸收的片劑)、大丸劑(bolus)、散劑、顆粒劑、供舌應(yīng)用的糊劑；或(2)胃腸外施用，例如通過(guò)皮下、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)或硬膜外注射，例如無(wú)菌溶液劑或混懸劑或者緩釋制劑。

適用于胃腸外施用的本文所提供的藥物組合物包含本文所述一種或多種藥劑以及與之結(jié)合的一或多種藥學(xué)上可接受的無(wú)菌等滲水性或非水性溶液、分散液、混懸液或乳液，或者可在臨用前才重構(gòu)成無(wú)菌注射溶液或分散液的無(wú)菌粉末，其可包含糖、醇、抗氧化劑、緩沖劑、抑菌劑、使得制劑與預(yù)期接受者的血液等滲的溶質(zhì)或者助懸劑或增稠劑。

本文所提供的藥物組合物中可采用的合適的水性或非水性載體的例子包括水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其合適的混合物、植物油(例如，橄欖油)以及注射用有機(jī)酯(例如，油酸乙酯)。可例如通過(guò)使用包衣材料(諸如卵磷脂)、通過(guò)在分散液的情況下保持所需的粒度以及通過(guò)使用表面活性劑，來(lái)保持適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性。

在某些實(shí)施例中，該組合物包含一定濃度的本文所述抗體和/或car，從而得到適合所需劑量的重量/體積(w/v)。抗體和/或car可以至少1mg/ml、至少5mg/ml、至少10mg/ml、至少15mg/ml、至少20mg/ml、至少25mg/ml、至少30mg/ml、至少35mg/ml、至少40mg/ml、至少45mg/ml、至少50mg/ml、至少55mg/ml、至少60mg/ml、至少65mg/ml、至少70mg/ml、至少75mg/ml、至少80mg/ml、至少85mg/ml、至少90mg/ml、至少95mg/ml、至少100mg/ml、至少105mg/ml、至少110mg/ml、至少115mg/ml、至少120mg/ml、至少125mg/ml、至少130mg/ml、至少135mg/ml、至少140mg/ml、至少150mg/ml、至少200mg/ml、至少250mg/ml或至少300mg/ml的濃度存在于該組合物中。

在一些實(shí)施例中，該組合物包含待治療的特定適應(yīng)癥所需的一種或多種活性化合物，通常為那些具有不會(huì)相互產(chǎn)生不利影響的互補(bǔ)活性的化合物。此類(lèi)附加活性化合物適合以有效用于預(yù)期目的的含量適當(dāng)?shù)亟Y(jié)合存在。

在一些實(shí)施例中，通過(guò)將本文所述抗體和/或car與任選的生理上可接受的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑混合，而以所需的最終濃度制備呈凍干組合物或水溶液形式的組合物，所述載體、賦形劑或穩(wěn)定劑包括但不限于緩沖劑、糖類(lèi)、鹽、表面活性劑、增溶劑、多元醇、稀釋劑、粘結(jié)劑、穩(wěn)定劑、鹽、親脂性溶劑、氨基酸、螯合劑、防腐劑等(goodmanandgilman'sthepharmacologicalbasisoftherapeutics,12thedition,l.brunton,etal.(《古德曼吉爾曼治療學(xué)的藥理學(xué)基礎(chǔ)》，第12版，l.brunton等人)以及remington'spharmaceuticalsciences,16thedition,osol,a.ed.(1999)(《雷明頓藥學(xué)大全》，第16版，osol,a。編輯，1999年))?？山邮艿妮d體、賦形劑或穩(wěn)定劑在所采用的劑量和濃度下對(duì)接受者無(wú)毒性，并且包括：緩沖劑，例如組氨酸、磷酸鹽、檸檬酸鹽、甘氨酸、乙酸鹽和其他有機(jī)酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸和甲硫氨酸；防腐劑(例如十八烷基二甲基芐基氯化銨；氯化六甲雙胺；苯扎氯銨、芐索氯銨；苯酚、丁醇或苯甲醇；對(duì)羥基苯甲酸烷基酯，例如對(duì)羥基苯甲酸甲酯或丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環(huán)己醇；3-戊醇；以及間甲酚)；低分子量(小于約10個(gè)殘基)多肽；蛋白質(zhì)，例如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、組氨酸、精氨酸或賴(lài)氨酸；單糖、二糖和其他碳水化合物，包括海藻糖、葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，例如edta；糖類(lèi)，例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成鹽抗衡離子，例如鈉離子；金屬?gòu)?fù)合物(例如，zn-蛋白復(fù)合物)；和/或非離子表面活性劑，例如tween、聚山梨醇酯80、或聚乙二醇(peg)。

在一些實(shí)施例中，緩沖劑為組氨酸、檸檬酸鹽、磷酸鹽、甘氨酸或乙酸鹽。糖類(lèi)賦形劑可為海藻糖、蔗糖、甘露醇、麥芽糖或棉子糖。表面活性劑可為聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯80或pluronicf68。鹽可為nacl、kcl、mgcl2或cacl2。

在一些實(shí)施例中，該組合物包含緩沖劑或ph調(diào)節(jié)劑以提供改善的ph控制。這種組合物可具有介于約3.0與約9.0之間、介于約4.0與約8.0之間、介于約5.0與約8.0之間、介于約5.0與約7.0之間、介于約5.0與約6.5之間、介于約5.5與約8.0之間、介于約5.5與約7.0之間、或介于約5.5與約6.5之間的ph。在另一個(gè)實(shí)施例中，這種組合物具有約3.0、約3.5、約4.0、約4.5、約5.0、約5.1、約5.2、約5.3、約5.4、約5.5、約5.6、約5.7、約5.8、約5.9、約6.0、約6.1、約6.2、約6.3、約6.4、約6.5、約6.6、約6.7、約6.8、約6.9、約7.0、約7.5、約8.0、約8.5或約9.0的ph。在一個(gè)具體實(shí)施例中，組合物具有約6.0的ph。本領(lǐng)域的技術(shù)人員會(huì)理解，組合物的ph一般不應(yīng)等于要在該組合物中使用的特定抗體或car的等電點(diǎn)。通常，該緩沖劑是由有機(jī)或無(wú)機(jī)酸或堿制備的鹽。代表性緩沖劑包括但不限于有機(jī)酸鹽，例如檸檬酸、抗壞血酸、葡糖酸、碳酸、酒石酸、琥珀酸、乙酸或鄰苯二甲酸的鹽；tris、氨丁三醇鹽酸鹽或磷酸鹽緩沖劑。另外，氨基酸組分也可在緩沖容量方面發(fā)揮作用?？稍谠摻M合物中用作緩沖劑的代表性氨基酸組分包括但不限于甘氨酸和組氨酸。在某些實(shí)施例中，緩沖劑選自組氨酸、檸檬酸鹽、磷酸鹽、甘氨酸和乙酸鹽。在一個(gè)具體實(shí)施例中，緩沖劑為組氨酸。在另一個(gè)具體實(shí)施例中，緩沖劑為檸檬酸鹽。在又一個(gè)具體實(shí)施例中，緩沖劑為甘氨酸。緩沖劑的純度應(yīng)為至少98％、或至少99％、或至少99.5％。如本文所用，在組氨酸和甘氨酸語(yǔ)境中的術(shù)語(yǔ)“純度”是指如本領(lǐng)域所了解的組氨酸或甘氨酸的化學(xué)純度，例如在themerckindex,13thed.,o'neiletal.ed.(merck&co.,2001)(《默克索引》，第13版，o'neil等人編輯，默克公司，2001年)中所述。

在某些實(shí)施例中，該組合物包含作為緩沖劑的組氨酸。在某些實(shí)施例中，組氨酸以至少約1mm、至少約5mm、至少約10mm、至少約20mm、至少約30mm、至少約40mm、至少約50mm、至少約75mm、至少約100mm、至少約150mm或至少約200mm組氨酸的濃度存在于該組合物中。在另一個(gè)實(shí)施例中，組合物包含介于約1mm與約200mm之間、介于約1mm與約150mm之間、介于約1mm與約100mm之間、介于約1mm與約75mm之間、介于約10mm與約200mm之間、介于約10mm與約150mm之間、介于約10mm與約100mm之間、介于約10mm與約75mm之間、介于約10mm與約50mm之間、介于約10mm與約40mm之間、介于約10mm與約30mm之間、介于約20mm與約75mm之間、介于約20mm與約50mm之間、介于約20mm與約40mm之間、或介于約20mm與約30mm之間的組氨酸。在另一個(gè)實(shí)施例中，該組合物包含約1mm、約5mm、約10mm、約20mm、約25mm、約30mm、約35mm、約40mm、約45mm、約50mm、約60mm、約70mm、約80mm、約90mm、約100mm、約150mm或約200mm的組氨酸。在一個(gè)具體實(shí)施例中，組合物可包含約10mm、約25mm的組氨酸或不包含組氨酸。

在一些實(shí)施例中，該組合物包含碳水化合物賦形劑。碳水化合物賦形劑可充當(dāng)例如增粘劑、穩(wěn)定劑、增量劑、增溶劑和/或類(lèi)似物。碳水化合物賦形劑一般的存在量為按重量或體積計(jì)介于約1％至約99％之間，例如，介于約0.1％至約20％之間、介于約0.1％至約15％之間、介于約0.1％至約5％之間、介于約1％至約20％之間、介于約5％至約15％之間、介于約8％至約10％之間、介于約10％與約15％之間、介于約15％與約20％之間、介于0.1％至20％之間、介于5％至15％之間、介于8％至10％之間、介于10％與15％之間、介于15％與20％之間、介于約0.1％至約5％之間、介于約5％至約10％之間、或介于約15％至約20％之間。在另外其他的具體實(shí)施例中，碳水化合物賦形劑以1％、或1.5％、或2％、或2.5％、或3％、或4％、或5％、或10％、或15％、或20％存在。

在一些實(shí)施例中，該組合物包含碳水化合物賦形劑。適用于該組合物的碳水化合物賦形劑包括但不限于單糖，例如果糖、麥芽糖、半乳糖、葡萄糖、d-甘露糖、山梨糖等；二糖，例如乳糖、蔗糖、海藻糖、纖維二糖等；多糖，例如棉子糖、松三糖、麥芽糊精、葡聚糖、淀粉等；以及糖醇，例如甘露醇、木糖醇、麥芽糖醇、乳糖醇、木糖醇、山梨糖醇(葡糖醇)等。在某些實(shí)施例中，用于本文所提供的組合物中的碳水化合物賦形劑選自蔗糖、海藻糖、乳糖、甘露醇和棉子糖。在一個(gè)具體實(shí)施例中，碳水化合物賦形劑為海藻糖。在另一個(gè)具體實(shí)施例中，碳水化合物賦形劑為甘露醇。在又一個(gè)具體實(shí)施例中，碳水化合物賦形劑為蔗糖。在再一個(gè)具體實(shí)施例中，碳水化合物賦形劑為棉子糖。碳水化合物賦形劑的純度應(yīng)為至少98％、或至少99％、或至少99.5％。

在一些實(shí)施例中，該組合物包含海藻糖。在某些實(shí)施例中，組合物包含至少約1％、至少約2％、至少約4％、至少約8％、至少約20％、至少約30％或至少約40％的海藻糖。在另一個(gè)實(shí)施例中，組合物包含介于約1％與約40％之間、介于約1％與約30％之間、介于約1％與約20％之間、介于約2％與約40％之間、介于約2％與約30％之間、介于約2％與約20％之間、介于約4％與約40％之間、介于約4％與約30％之間、或介于約4％與約20％之間的海藻糖。在另一個(gè)實(shí)施例中，組合物包含約1％、約2％、約4％、約6％、約8％、約15％、約20％、約30％或約40％的海藻糖。在一個(gè)具體實(shí)施例中，組合物包含約4％、約6％或約15％的海藻糖。

在某些實(shí)施例中，該組合物包含賦形劑。在一個(gè)具體實(shí)施例中，組合物包含至少一種選自以下的賦形劑：糖、鹽、表面活性劑、氨基酸、多元醇、螯合劑、乳化劑和防腐劑。在某些實(shí)施例中，組合物包含鹽，例如選自以下的鹽：nacl、kcl、cacl2和mgcl2。在一個(gè)具體實(shí)施例中，該組合物包含nacl。

在一些實(shí)施例中，該組合物包含氨基酸如賴(lài)氨酸、精氨酸、甘氨酸、組氨酸，或氨基酸鹽。該組合物可包含至少約1mm、至少約10mm、至少約25mm、至少約50mm、至少約100mm、至少約150mm、至少約200mm、至少約250mm、至少約300mm、至少約350mm或至少約400mm的氨基酸。在另一個(gè)實(shí)施例中，該組合物可包含介于約1mm與約100mm之間、介于約10mm與約150mm之間、介于約25mm與約250mm之間、介于約25mm與約300mm之間、介于約25mm與約350mm之間、介于約25mm與約400mm之間、介于約50mm與約250mm之間、介于約50mm與約300mm之間、介于約50mm與約350mm之間、介于約50mm與約400mm之間、介于約100mm與約250mm之間、介于約100mm與約300mm之間、介于約100mm與約400mm之間、介于約150mm與約250mm之間、介于約150mm與約300mm之間、或介于約150mm與約400mm之間的氨基酸。在另一個(gè)實(shí)施例中，組合物包含約1mm、1.6mm、25mm、約50mm、約100mm、約150mm、約200mm、約250mm、約300mm、約350mm或約400mm的氨基酸。

在一些實(shí)施例中，該組合物包含表面活性劑。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“表面活性劑”是指具有兩親結(jié)構(gòu)的有機(jī)物質(zhì)；即，它們由具有相反溶解傾向的基團(tuán)構(gòu)成，通常由油溶性烴鏈和水溶性離子基團(tuán)構(gòu)成。表面活性劑可根據(jù)表面活性部分的電荷劃分為陰離子型、陽(yáng)離子型和非離子型表面活性劑。表面活性劑通常用作各種藥物組合物和生物材料制品的潤(rùn)濕劑、乳化劑、增溶劑和分散劑。藥學(xué)上可接受的表面活性劑，如聚山梨醇酯(例如，聚山梨醇酯20或80)；泊洛沙姆(例如，泊洛沙姆188)；triton；辛基配糖物鈉鹽；月桂基磺基甜菜堿、肉豆蔻基磺基甜菜堿、亞油基磺基甜菜堿或硬脂基磺基甜菜堿；月桂基肌氨酸、肉豆蔻基肌氨酸、亞油基肌氨酸或硬脂基肌氨酸；亞油基甜菜堿、肉豆蔻基甜菜堿或鯨蠟基甜菜堿；月桂酰胺基丙基甜菜堿、椰油酰胺基丙基甜菜堿、亞油酰胺基丙基甜菜堿、肉豆蔻酰胺基丙基甜菜堿、棕櫚酰胺基丙基甜菜堿或異硬脂酰胺基丙基甜菜堿(例如，月桂酰胺基丙基)；肉豆蔻酰胺基丙基二甲胺、棕櫚酰胺基丙基二甲胺或異硬脂酰胺基丙基二甲胺；甲基椰油酰基?；撬徕c或甲基油基牛磺酸二鈉；以及系列(美國(guó)新澤西州帕特森的摩那工業(yè)公司(monaindustries,inc.,paterson,n.j.))、聚乙二醇、聚丙二醇以及乙二醇和丙二醇的共聚物(例如，pf68等)，可任選地添加到所述組合物中以減少聚集。在某些實(shí)施例中，組合物包含聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60或聚山梨醇酯80。如果使用泵或塑料容器施用該組合物，則表面活性劑特別有用。藥學(xué)上可接受的表面活性劑的存在減輕了蛋白質(zhì)聚集的傾向。所述組合物可包含濃度在約0.001％至約1％、或約0.001％至約0.1％、或約0.01％至約0.1％之間的范圍內(nèi)的聚山梨醇酯。在其他具體實(shí)施例中，所述組合物包含濃度為0.001％、或0.002％、或0.003％、或0.004％、或0.005％、或0.006％、或0.007％、或0.008％、或0.009％、或0.01％、或0.015％、或0.02％的聚山梨醇酯。

在一些實(shí)施例中，該組合物包含其他賦形劑和/或添加劑，包括但不限于稀釋劑、粘結(jié)劑、穩(wěn)定劑、親脂性溶劑、防腐劑、佐劑等?？稍诒疚乃峁┑慕M合物中使用藥學(xué)上可接受的賦形劑和/或添加劑?？扇芜x地將常用賦形劑/添加劑諸如藥學(xué)上可接受的螯合劑(例如但不限于edta、dtpa或egta)添加到所述組合物中以減少聚集。如果使用泵或塑料容器施用該組合物，則這些添加劑特別有用。

在一些實(shí)施例中，該組合物包含防腐劑。可任選地以任何合適的濃度諸如介于約0.001％至約5％之間、或其中的任何范圍或值，向所述組合物添加防腐劑，例如苯酚、間甲酚、對(duì)甲酚、鄰甲酚、氯甲酚、苯甲醇、亞硝酸苯汞、苯氧乙醇、甲醛、氯代丁醇、氯化鎂(例如但不限于六水合物)、對(duì)羥基苯甲酸烷基酯(甲基酯、乙基酯、丙基酯、丁基酯等)、苯扎氯銨、芐索氯銨、脫氫乙酸鈉和硫柳汞，或者它們的混合物。用于所述組合物中的防腐劑的濃度為足夠產(chǎn)生抗微生物效應(yīng)的濃度。這些濃度取決于所選的防腐劑并且可以由技術(shù)人員容易地確定。

在一些實(shí)施例中，該組合物與人血液等滲，其中所述組合物具有與人血液基本上相同的滲透壓。此類(lèi)等滲組合物一般將具有約250mosm至約350mosm的滲透壓?？赏ㄟ^(guò)例如使用蒸汽壓或冰凍型滲壓計(jì)來(lái)測(cè)量等滲性。通過(guò)使用滲漲度調(diào)節(jié)劑來(lái)調(diào)節(jié)組合物的滲漲度。“滲漲度調(diào)節(jié)劑”是那些可添加到該組合物中而使該組合物等滲的藥學(xué)上可接受的惰性物質(zhì)。適用于本文所提供的組合物的滲漲度調(diào)節(jié)劑包括但不限于糖類(lèi)、鹽和氨基酸。

在某些實(shí)施例中，該組合物為不含熱原的組合物，即基本上不含內(nèi)毒素和/或相關(guān)的引起發(fā)熱的物質(zhì)。內(nèi)毒素包括這樣的毒素，這些毒素限制在微生物內(nèi)，只有當(dāng)此微生物被分解或死亡時(shí)才會(huì)釋放。引起發(fā)熱的物質(zhì)包括來(lái)自細(xì)菌和其他微生物的外膜的引起發(fā)燒的熱穩(wěn)定性物質(zhì)。如果給予人類(lèi)，這兩種物質(zhì)會(huì)引起發(fā)燒、低血壓和休克。由于存在潛在的有害效應(yīng)，即使數(shù)量較低的內(nèi)毒素也必須從靜脈內(nèi)施用的藥物溶液中去除。美國(guó)食品藥品管理局(food&drugadministration(“fda”))設(shè)定了用于靜脈內(nèi)藥物應(yīng)用的一個(gè)小時(shí)內(nèi)5個(gè)內(nèi)毒素單位(eu)/劑量/千克體重的上限(theunitedstatespharmacopeialconvention,pharmacopeialforum26(1):223(2000)(美國(guó)藥典委員會(huì)，《藥典論壇》，第26卷，第1期，第223頁(yè)，2000年))。當(dāng)以數(shù)百或數(shù)千毫克/千克體重的量施用治療性蛋白時(shí)(目標(biāo)蛋白(例如，抗體)即是這種情況)，即使有害且危險(xiǎn)的內(nèi)毒素為痕量，也必須去除。在一些實(shí)施例中，該組合物中的內(nèi)毒素和熱原水平小于10eu/mg、或小于5eu/mg、或小于1eu/mg、或小于0.1eu/mg、或小于0.01eu/mg、或小于0.001eu/mg。

當(dāng)用于體內(nèi)施用時(shí)，本文所述組合物應(yīng)為無(wú)菌的?？赏ㄟ^(guò)各種滅菌方法(包括無(wú)菌過(guò)濾、輻射等)對(duì)該組合物進(jìn)行滅菌。在某些實(shí)施例中，用預(yù)先滅菌的0.22微米濾膜對(duì)組合物進(jìn)行過(guò)濾滅菌。注射用無(wú)菌組合物可以按照常規(guī)制藥規(guī)范配制，如“remington:thescience&practiceofpharmacy”，21sted.,lippincottwilliams&wilkins,(2005)(《雷明頓：藥劑學(xué)科學(xué)與實(shí)踐》，第21版，利平科特π威廉斯π威爾金斯出版公司，2005年)中所述。包含目標(biāo)蛋白(例如，抗體或car)的組合物，諸如本文所公開(kāi)的那些組合物，通常將以?xún)龈尚问交蛉芤盒问奖４?。設(shè)想到，將包含目標(biāo)蛋白(例如，抗體或car)的無(wú)菌組合物放入具有無(wú)菌進(jìn)入孔的容器內(nèi)，例如具有允許取出該組合物的適配器(諸如皮下注射針可刺穿的塞子)的靜脈注射溶液袋或小瓶。在某些實(shí)施例中，組合物作為預(yù)裝填注射器提供。

在某些實(shí)施例中，該組合物為凍干制劑。術(shù)語(yǔ)“凍干的”或“冷凍干燥的”包括經(jīng)受了干燥程序(例如，凍干)的物質(zhì)的狀態(tài)，其中已去除至少50％的水分。

不論所選的施用途徑如何，都可通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法將本文所提供的藥劑(可按合適的水合形式使用)和/或本文所提供的藥物組合物配制成藥學(xué)上可接受的劑型。

治療方法

在某些方面，本文提供了治療疾病或障礙的方法，所述方法包括給受試者施用本文所述抗體或car(例如，對(duì)肽/mhc復(fù)合體具有結(jié)合特異性的全人源抗體，或?qū)﹄?mhc具有結(jié)合特異性的全人源car)。在一些實(shí)施例中，抗體和/或car是使用本文所述方法(例如，使用包含如本文所述的car基因座的非人動(dòng)物)獲得或可獲得的抗體和/或car。

在某些實(shí)施例中，本文提供了治療受試者中的癌的方法，所述方法包括給受試者施用本文所述藥物組合物(例如，包含本文所述抗體(例如對(duì)肽/mhc具有結(jié)合特異性的全人源抗體)的藥物組合物)。在一些實(shí)施例中，本文所述方法可用于治療任何癌性或癌前期腫瘤?？赏ㄟ^(guò)本文所述方法和組合物治療的癌包括但不限于來(lái)自膀胱、血液、骨、骨髓、腦、乳腺、結(jié)腸、食管、胃腸道、牙齦、頭部、腎、肝、肺、鼻咽、頸部、卵巢、前列腺、皮膚、胃、睪丸、舌頭或子宮的癌細(xì)胞。此外，所述癌具體而言可以是以下組織學(xué)類(lèi)型，但不限于此：瘤，惡性；癌；癌，未分化；巨細(xì)胞和梭形細(xì)胞癌；小細(xì)胞癌；乳頭狀癌；鱗狀細(xì)胞癌；淋巴上皮癌；基底細(xì)胞癌；毛母質(zhì)癌；移行細(xì)胞癌；乳頭狀移行細(xì)胞癌；腺癌；胃泌素瘤，惡性；膽管癌；肝細(xì)胞癌；混合型肝細(xì)胞癌和膽管癌；小梁性腺癌；腺樣囊性癌；腺瘤性息肉內(nèi)腺癌；腺癌，家族性結(jié)腸息肉??；實(shí)體癌；類(lèi)癌瘤，惡性；細(xì)支氣管肺泡腺癌；乳頭狀腺癌；嫌色細(xì)胞癌；嗜酸細(xì)胞癌；嗜酸性腺癌；嗜堿細(xì)胞癌；透明細(xì)胞腺癌；顆粒細(xì)胞癌；濾泡腺癌；乳頭狀和濾泡腺癌；非包囊性硬化性癌；腎上腺皮質(zhì)癌；卵巢內(nèi)膜樣癌；皮膚附屬器癌；大汗腺腺癌；皮脂腺癌；耵聹腺癌；粘液表皮樣癌；囊腺癌；乳頭狀囊腺癌；乳頭狀漿液性囊腺癌；粘液性囊腺癌；粘液性腺癌；印戒細(xì)胞癌；浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌；髓樣癌；小葉癌；炎性癌；佩吉特氏病，乳房；腺泡細(xì)胞癌；腺鱗癌；腺癌伴鱗狀上皮化生；胸腺瘤，惡性；卵巢間質(zhì)腫瘤，惡性；泡膜細(xì)胞瘤，惡性；顆粒細(xì)胞瘤，惡性；男性母細(xì)胞瘤，惡性；塞爾托利細(xì)胞癌；間質(zhì)細(xì)胞瘤，惡性；脂質(zhì)細(xì)胞瘤，惡性；副神經(jīng)節(jié)瘤，惡性；乳房外副神經(jīng)節(jié)瘤，惡性；嗜鉻細(xì)胞瘤；皮膚絲球肉瘤；惡性黑素瘤；無(wú)黑色素性黑素瘤；淺表擴(kuò)散性黑素瘤；巨大色素痣內(nèi)惡性黑素瘤；上皮樣細(xì)胞黑素瘤；藍(lán)痣，惡性；肉瘤；纖維肉瘤；纖維組織細(xì)胞瘤，惡性；粘液肉瘤；脂肪肉瘤；平滑肌肉瘤；橫紋肌肉瘤；胚胎性橫紋肌肉瘤；腺泡型橫紋肌肉瘤；間質(zhì)肉瘤；混合瘤，惡性；苗勒氏管混合瘤；腎母細(xì)胞瘤；肝母細(xì)胞瘤；癌肉瘤；間葉瘤，惡性；布倫納瘤，惡性；葉狀腫瘤，惡性；滑膜肉瘤；間皮瘤，惡性；無(wú)性細(xì)胞瘤；胚胎性癌；畸胎瘤，惡性；卵巢甲狀腺腫，惡性；絨毛膜癌；中腎瘤，惡性；血管肉瘤；血管內(nèi)皮瘤，惡性；卡波氏肉瘤；血管外皮細(xì)胞瘤，惡性；淋巴管肉瘤；骨肉瘤；皮質(zhì)旁成骨肉瘤；軟骨肉瘤；軟骨母細(xì)胞瘤，惡性；間葉性軟骨肉瘤；骨巨細(xì)胞瘤；尤文氏肉瘤；牙源性腫瘤，惡性；成釉細(xì)胞牙肉瘤；成釉細(xì)胞瘤，惡性；成釉細(xì)胞纖維肉瘤；松果體瘤，惡性；脊索瘤；神經(jīng)膠質(zhì)瘤，惡性；室管膜瘤；星形細(xì)胞瘤；原漿性星形細(xì)胞瘤；纖維性星形細(xì)胞瘤；星形母細(xì)胞瘤；膠質(zhì)母細(xì)胞瘤；少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤；成少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤；原始神經(jīng)外胚層瘤；小腦肉瘤；神經(jīng)節(jié)神經(jīng)母細(xì)胞瘤；神經(jīng)母細(xì)胞瘤；視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤；嗅神經(jīng)源性腫瘤；腦膜瘤，惡性；神經(jīng)纖維肉瘤；神經(jīng)鞘瘤，惡性；顆粒細(xì)胞瘤，惡性；惡性淋巴瘤；霍奇金??；霍奇金淋巴瘤；副肉芽腫；惡性淋巴瘤，小淋巴細(xì)胞性；惡性淋巴瘤，大細(xì)胞，彌漫性；惡性淋巴瘤，濾泡性；蕈樣肉芽腫；其他指定的非霍奇金淋巴瘤；惡性組織細(xì)胞增生癥；多發(fā)性骨髓瘤；肥大細(xì)胞肉瘤；免疫增殖性小腸??；白血??；淋巴性白血??；漿細(xì)胞白血?。患t白血??；淋巴肉瘤細(xì)胞白血??；骨髓性白血病；嗜堿性粒細(xì)胞白血病；嗜酸性粒細(xì)胞白血??；單核細(xì)胞白血??；肥大細(xì)胞白血病；巨核細(xì)胞白血??；骨髓性肉瘤；以及毛細(xì)胞白血病。

在某些實(shí)施例中，給受試者施用的藥物組合物中的抗體和/或car對(duì)肽/mhc復(fù)合體具有結(jié)合特異性，其中該肽包含癌相關(guān)抗原的表位(例如，由所治療的癌表達(dá)的表位)。癌相關(guān)抗原的例子包括但不限于親脂素、aim-2、aldh1a1、α-輔肌動(dòng)蛋白-4、甲胎蛋白(“afp”)、artc1、b-raf、bage-1、bclx(l)、bcr-abl融合蛋白b3a2、β-聯(lián)蛋白、bing-4、ca-125、calca、癌胚抗原(“cea”)、casp-5、casp-8、cd274、cd45、cdc27、cdk12、cdk4、cdkn2a、cea、clpp、coa-1、cpsf、csnk1a1、ctag1、ctag2、細(xì)胞周期蛋白d1、細(xì)胞周期蛋白-a1、dek-can融合蛋白、dkk1、eftud2、延伸因子2、enah(hmena)、ep-cam、epcam、epha3、上皮腫瘤抗原(“eta”)、etv6-aml1融合蛋白、ezh2、fgf5、flt3-itd、fn1、g250/mn/caix、gage-1,2,8、gage-3,4,5,6,7、gas7、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3、gntv、gp100/pmel17、gpnmb、haus3、hepsin、her-2/neu、herv-k-mel、hla-a11、hla-a2、hla-dob、hsp70-2、ido1、igf2b3、il13rα2、腸羧酸酯酶、k-ras、激肽釋放酶4、kif20a、kk-lc-1、kklc1、km-hn-1、kmhn1(也稱(chēng)為ccdc110)、lage-1、ldlr-巖藻糖轉(zhuǎn)移酶as融合蛋白、lengsin、m-csf、mage-a1、mage-a10、mage-a12、mage-a2、mage-a3、mage-a4、mage-a6、mage-a9、mage-c1、mage-c2、蘋(píng)果酸酶、乳腺球蛋白-a、mart2、matn、mc1r、mcsp、mdm-2、me1、melan-a/mart-1、meloe、midkine、mmp-2、mmp-7、muc1、muc5ac、粘蛋白、mum-1、mum-2、mum-3、肌球蛋白、肌球蛋白i類(lèi)、n-raw、na88-a、neo-pap、nfyc、ny-br-1、ny-eso-1/lage-2、oa1、ogt、os-9、p多肽、p53、pap、pax5、pbf、pml-rarα融合蛋白、多形上皮粘蛋白(“pem”)、ppp1r3b、prame、prdx5、psa、psma、ptprk、rab38/ny-mel-1、rage-1、rbaf600、rgs5、rhoc、rnf43、ru2as、sage、secernin1、sirt2、snrpd1、sox10、sp17、spa17、ssx-2、ssx-4、steap1、生存素、syt-ssx1或-ssx2融合蛋白、tag-1、tag-2、端粒酶、tgf-βrii、tpbg、trag-3、磷酸丙糖異構(gòu)酶、trp-1/gp75、trp-2、trp2-int2、酪氨酸酶、酪氨酸酶(“tyr”)、vegf、wt1、xage-1b/gaged2a。在一些實(shí)施例中，該抗原為新抗原。

在某些實(shí)施例中，本文提供了治療患有感染(包括病毒感染、真菌感染、細(xì)菌感染、蠕蟲(chóng)感染或原蟲(chóng)感染)的受試者的方法，所述方法包括給受試者施用本文所述藥物組合物(例如，包含本文所述抗體(例如對(duì)肽/mhc具有結(jié)合特異性的全人源抗體)的藥物組合物)。在一些實(shí)施例中，該方法包括對(duì)病毒傳染性疾病的治療，所述病毒傳染性疾病包括hpv、hbv、丙型肝炎病毒(hcv)、逆轉(zhuǎn)錄病毒如人類(lèi)免疫缺陷病毒(hiv-1和hiv-2)、皰疹病毒如eb病毒(ebv)、巨細(xì)胞病毒(cmv)、hsv-1和hsv-2，以及流感病毒。在一些實(shí)施例中，該方法包括對(duì)寄生蟲(chóng)(例如，瘧原蟲(chóng))的治療。在一些實(shí)施例中，該方法包括對(duì)細(xì)菌性、真菌性和其他病原性疾病的治療，例如曲霉、布魯線蟲(chóng)、念珠菌、衣原體、球蟲(chóng)、隱球菌、惡絲蟲(chóng)、淋球菌、組織胞漿菌、利什曼原蟲(chóng)、分枝桿菌、支原體、草履蟲(chóng)、百日咳菌、瘧原蟲(chóng)、肺炎球菌、肺囊蟲(chóng)、立克次氏體、沙門(mén)氏菌、志賀氏菌、葡萄球菌、鏈球菌、弓形蟲(chóng)和霍亂弧菌。示例性物種包括淋病奈瑟氏菌、結(jié)核分枝桿菌、白色念珠菌、熱帶念珠菌、陰道毛滴蟲(chóng)、陰道嗜血桿菌、b族鏈球菌、人型支原體、杜氏嗜血菌、腹股溝肉芽腫、性病性淋巴肉芽腫、梅毒螺旋體、流產(chǎn)布魯氏菌、馬耳他布魯氏菌、豬布魯氏菌、犬布魯氏菌、胎兒彎曲菌、胎兒彎曲菌腸亞種、波蒙納鉤端螺旋體、單核細(xì)胞增多性李斯特菌、綿羊布魯氏菌、鸚鵡熱衣原體、胎兒三毛滴蟲(chóng)、剛地弓形蟲(chóng)、大腸桿菌、馬放線桿菌、綿羊流產(chǎn)沙門(mén)菌、馬流產(chǎn)沙門(mén)菌、銅綠假單胞菌、馬棒狀桿菌、化膿棒狀桿菌、精液放線桿菌、牛生殖道支原體、煙曲霉、分枝犁頭霉、馬媾疫錐蟲(chóng)、駑巴貝斯蟲(chóng)、破傷風(fēng)梭菌、肉毒梭菌；或真菌，例如巴西副球孢子菌；或其他病原體，例如惡性瘧原蟲(chóng)。

在某些實(shí)施例中，給受試者施用的藥物組合物中的抗體和/或car對(duì)肽/mhc復(fù)合體具有結(jié)合特異性，其中該肽包含由傳染性病原體表達(dá)的抗原的表位(例如，由所治療的傳染性病原體表達(dá)的表位)。

在一些實(shí)施例中，本文提供了治療炎性疾病、皮膚或器官移植排斥反應(yīng)、移植物抗宿主病(gvhd)或自身免疫疾病的方法，該方法包括給受試者施用本文所述藥物組合物(例如，包含本文所述抗體(例如對(duì)肽/mhc具有結(jié)合特異性的全人源抗體)的藥物組合物)。自身免疫疾病的例子包括例如腎小球腎炎、關(guān)節(jié)炎、擴(kuò)張性心肌病樣疾病、潰瘍性結(jié)腸炎、干燥綜合征、克羅恩病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、慢性類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化癥、銀屑病、變應(yīng)性接觸性皮炎、多肌炎、厚皮、結(jié)節(jié)性動(dòng)脈周?chē)?、風(fēng)濕熱、尋常性白斑、胰島素依賴(lài)性糖尿病、白塞病、橋本病、愛(ài)迪生氏病、皮肌炎、重癥肌無(wú)力、賴(lài)特綜合征、格雷夫斯病、惡性貧血、肺出血腎炎綜合征、不育癥、慢性活動(dòng)性肝炎、天皰瘡、自身免疫性血小板減少性紫癜和自身免疫性溶血性貧血、活動(dòng)性慢性肝炎、愛(ài)迪生氏病、抗磷脂綜合征、特應(yīng)性變態(tài)反應(yīng)、自身免疫性萎縮性胃炎、自身免疫性胃酸缺乏、乳糜瀉、庫(kù)欣綜合征、皮肌炎、盤(pán)狀狼瘡、紅斑狼瘡、肺出血腎炎綜合征、橋本甲狀腺炎、特發(fā)性腎上腺萎縮、特發(fā)性血小板減少癥、胰島素依賴(lài)性糖尿病、蘭伯特-伊頓綜合征、類(lèi)狼瘡肝炎、淋巴細(xì)胞減少癥的一些病例、混合性結(jié)締組織病、類(lèi)天皰瘡、尋常天皰瘡、惡性貧血、晶狀體源性葡萄膜炎、結(jié)節(jié)性多動(dòng)脈炎、自身免疫性多腺體綜合征、原發(fā)性膽汁性肝硬化、原發(fā)性硬化性膽管炎、雷諾氏綜合征、復(fù)發(fā)性多軟骨炎、施密特氏綜合征、局限性硬皮病(或crest綜合征)、交感性眼炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、大動(dòng)脈炎、顳動(dòng)脈炎、甲狀腺毒癥、b型胰島素抵抗、潰瘍性結(jié)腸炎和韋格納氏肉芽腫。

在某些實(shí)施例中，給受試者施用的藥物組合物中的抗體和/或car對(duì)肽/mhc復(fù)合體具有結(jié)合特異性，其中該肽包含作為所治療疾病中自身反應(yīng)性t細(xì)胞的靶標(biāo)的蛋白質(zhì)的表位(例如，由自身免疫疾病中的自身反應(yīng)性t細(xì)胞所靶向的表位)。自身反應(yīng)性t細(xì)胞所靶向的示例性蛋白質(zhì)包括例如p205、胰島素、促甲狀腺激素、酪氨酸酶、trp1和髓磷脂。

本文所述藥物組合物可通過(guò)任何合適的施用途徑遞送，包括經(jīng)口、經(jīng)鼻(如以例如氣霧劑的形式)、經(jīng)直腸、陰道內(nèi)、胃腸外、腦池內(nèi)和局部施用(如以散劑、軟膏劑或滴劑的形式)，包括口頰和舌下施用。在某些實(shí)施例中，藥物組合物以通常的方式遞送(例如，經(jīng)口或胃腸外施用)。

本文所述藥物組合物中的活性成分的實(shí)際劑量水平可以變化，以獲得能有效達(dá)到特定患者、組合物和施用方式所需的治療響應(yīng)且對(duì)患者無(wú)毒的活性成分的量。

所選的劑量水平將取決于多種因素，包括所采用的特定藥劑的活性、施用途徑、施用時(shí)間、所采用的特定化合物的排泄或代謝速率、療程、與所采用的特定化合物聯(lián)合使用的其他藥物、化合物和/或材料、所治療的患者的年齡、性別、體重、病癥、一般健康狀況和既往用藥史、以及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域熟知的類(lèi)似因素。

具有本領(lǐng)域普通技術(shù)的醫(yī)師或獸醫(yī)可以容易地確定所需藥物組合物的有效量并開(kāi)具處方。例如，醫(yī)師或獸醫(yī)可以比達(dá)到所需療效而要求的水平低的水平開(kāi)具和/或施用藥物組合物中所采用的抗體和/或car的劑量，然后逐漸增加劑量，直至達(dá)到所需的療效。

在一些實(shí)施例中，本文所述car受體用于基于t細(xì)胞的療法。例如，在某些實(shí)施例中，給受試者施用表達(dá)本文所述car的t細(xì)胞，以在受試者中誘導(dǎo)基于t細(xì)胞的免疫應(yīng)答。可用于基于t細(xì)胞的療法的方法例如在schumachernat.rev.immunol.2:512-519(2002)(schumacher，《自然評(píng)論：免疫學(xué)》，第2卷，第512-519頁(yè)，2002年)和bittonetal.,frontiersinbioscience4:d386-393(1999)(bitton等人，《生物科學(xué)前沿》，第4卷，第d386-393頁(yè)，1999年)中有描述，這些文獻(xiàn)中的每一篇均以引用方式并入本文。

在一些方面，本文提供了在受試者中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答(例如，基于t細(xì)胞的免疫應(yīng)答)的方法。在一些實(shí)施例中，該方法包括給受試者施用表達(dá)car的細(xì)胞(例如，人t細(xì)胞，如cd4t細(xì)胞或cd8t細(xì)胞)，該car包含具有人ig重鏈可變結(jié)構(gòu)域和人tcrβ恒定結(jié)構(gòu)域的第一car多肽，以及具有人ig輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(例如，igκ可變結(jié)構(gòu)域或igλ可變結(jié)構(gòu)域)和人tcrα恒定結(jié)構(gòu)域的第二car多肽，其中該car對(duì)肽/mhc復(fù)合體具有結(jié)合特異性。在一些實(shí)施例中，肽/mhc復(fù)合體為肽/i類(lèi)mhc復(fù)合體。在一些實(shí)施例中，肽/mhc復(fù)合體為肽/ii類(lèi)mhc復(fù)合體。

在一些實(shí)施例中，受試者為有需要的受試者。在一些實(shí)施例中，受試者為患有癌的受試者。在此類(lèi)實(shí)施例中，car所識(shí)別的肽/mhc復(fù)合體中的肽為癌抗原的肽。

在某些實(shí)施例中，本文提供了治療癌的方法，所述方法包括給受試者施用表達(dá)本文所述car的t細(xì)胞。在一些實(shí)施例中，本文所述方法可用于治療任何癌性或癌前期腫瘤?？赏ㄟ^(guò)本文所述方法和組合物治療的癌包括但不限于來(lái)自膀胱、血液、骨、骨髓、腦、乳腺、結(jié)腸、食管、胃腸道、牙齦、頭部、腎、肝、肺、鼻咽、頸部、卵巢、前列腺、皮膚、胃、睪丸、舌頭或子宮的癌細(xì)胞。此外，所述癌具體而言可以是以下組織學(xué)類(lèi)型，但不限于此：瘤，惡性；癌；癌，未分化；巨細(xì)胞和梭形細(xì)胞癌；小細(xì)胞癌；乳頭狀癌；鱗狀細(xì)胞癌；淋巴上皮癌；基底細(xì)胞癌；毛母質(zhì)癌；移行細(xì)胞癌；乳頭狀移行細(xì)胞癌；腺癌；胃泌素瘤，惡性；膽管癌；肝細(xì)胞癌；混合型肝細(xì)胞癌和膽管癌；小梁性腺癌；腺樣囊性癌；腺瘤性息肉內(nèi)腺癌；腺癌，家族性結(jié)腸息肉?。粚?shí)體癌；類(lèi)癌瘤，惡性；細(xì)支氣管肺泡腺癌；乳頭狀腺癌；嫌色細(xì)胞癌；嗜酸細(xì)胞癌；嗜酸性腺癌；嗜堿細(xì)胞癌；透明細(xì)胞腺癌；顆粒細(xì)胞癌；濾泡腺癌；乳頭狀和濾泡腺癌；非包囊性硬化性癌；腎上腺皮質(zhì)癌；卵巢內(nèi)膜樣癌；皮膚附屬器癌；大汗腺腺癌；皮脂腺癌；耵聹腺癌；粘液表皮樣癌；囊腺癌；乳頭狀囊腺癌；乳頭狀漿液性囊腺癌；粘液性囊腺癌；粘液性腺癌；印戒細(xì)胞癌；浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌；髓樣癌；小葉癌；炎性癌；佩吉特氏病，乳房；腺泡細(xì)胞癌；腺鱗癌；腺癌伴鱗狀上皮化生；胸腺瘤，惡性；卵巢間質(zhì)腫瘤，惡性；泡膜細(xì)胞瘤，惡性；顆粒細(xì)胞瘤，惡性；男性母細(xì)胞瘤，惡性；塞爾托利細(xì)胞癌；間質(zhì)細(xì)胞瘤，惡性；脂質(zhì)細(xì)胞瘤，惡性；副神經(jīng)節(jié)瘤，惡性；乳房外副神經(jīng)節(jié)瘤，惡性；嗜鉻細(xì)胞瘤；皮膚絲球肉瘤；惡性黑素瘤；無(wú)黑色素性黑素瘤；淺表擴(kuò)散性黑素瘤；巨大色素痣內(nèi)惡性黑素瘤；上皮樣細(xì)胞黑素瘤；藍(lán)痣，惡性；肉瘤；纖維肉瘤；纖維組織細(xì)胞瘤，惡性；粘液肉瘤；脂肪肉瘤；平滑肌肉瘤；橫紋肌肉瘤；胚胎性橫紋肌肉瘤；腺泡型橫紋肌肉瘤；間質(zhì)肉瘤；混合瘤，惡性；苗勒氏管混合瘤；腎母細(xì)胞瘤；肝母細(xì)胞瘤；癌肉瘤；間葉瘤，惡性；布倫納瘤，惡性；葉狀腫瘤，惡性；滑膜肉瘤；間皮瘤，惡性；無(wú)性細(xì)胞瘤；胚胎性癌；畸胎瘤，惡性；卵巢甲狀腺腫，惡性；絨毛膜癌；中腎瘤，惡性；血管肉瘤；血管內(nèi)皮瘤，惡性；卡波氏肉瘤；血管外皮細(xì)胞瘤，惡性；淋巴管肉瘤；骨肉瘤；皮質(zhì)旁成骨肉瘤；軟骨肉瘤；軟骨母細(xì)胞瘤，惡性；間葉性軟骨肉瘤；骨巨細(xì)胞瘤；尤文氏肉瘤；牙源性腫瘤，惡性；成釉細(xì)胞牙肉瘤；成釉細(xì)胞瘤，惡性；成釉細(xì)胞纖維肉瘤；松果體瘤，惡性；脊索瘤；神經(jīng)膠質(zhì)瘤，惡性；室管膜瘤；星形細(xì)胞瘤；原漿性星形細(xì)胞瘤；纖維性星形細(xì)胞瘤；星形母細(xì)胞瘤；膠質(zhì)母細(xì)胞瘤；少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤；成少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤；原始神經(jīng)外胚層瘤；小腦肉瘤；神經(jīng)節(jié)神經(jīng)母細(xì)胞瘤；神經(jīng)母細(xì)胞瘤；視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤；嗅神經(jīng)源性腫瘤；腦膜瘤，惡性；神經(jīng)纖維肉瘤；神經(jīng)鞘瘤，惡性；顆粒細(xì)胞瘤，惡性；惡性淋巴瘤；霍奇金?。换羝娼鹆馨土?；副肉芽腫；惡性淋巴瘤，小淋巴細(xì)胞性；惡性淋巴瘤，大細(xì)胞，彌漫性；惡性淋巴瘤，濾泡性；蕈樣肉芽腫；其他指定的非霍奇金淋巴瘤；惡性組織細(xì)胞增生癥；多發(fā)性骨髓瘤；肥大細(xì)胞肉瘤；免疫增殖性小腸?。话籽。涣馨托园籽?；漿細(xì)胞白血病；紅白血??；淋巴肉瘤細(xì)胞白血病；骨髓性白血病；嗜堿性粒細(xì)胞白血??；嗜酸性粒細(xì)胞白血??；單核細(xì)胞白血??；肥大細(xì)胞白血??；巨核細(xì)胞白血病；骨髓性肉瘤；以及毛細(xì)胞白血病。

在某些實(shí)施例中，給受試者施用的t細(xì)胞所表達(dá)的car對(duì)肽/mhc復(fù)合體具有結(jié)合特異性，其中該肽包含癌相關(guān)抗原的表位(例如，由所治療的癌表達(dá)的表位)。癌相關(guān)抗原的例子包括但不限于親脂素、aim-2、aldh1a1、α-輔肌動(dòng)蛋白-4、甲胎蛋白(“afp”)、artc1、b-raf、bage-1、bclx(l)、bcr-abl融合蛋白b3a2、β-聯(lián)蛋白、bing-4、ca-125、calca、癌胚抗原(“cea”)、casp-5、casp-8、cd274、cd45、cdc27、cdk12、cdk4、cdkn2a、cea、clpp、coa-1、cpsf、csnk1a1、ctag1、ctag2、細(xì)胞周期蛋白d1、細(xì)胞周期蛋白-a1、dek-can融合蛋白、dkk1、eftud2、延伸因子2、enah(hmena)、ep-cam、epcam、epha3、上皮腫瘤抗原(“eta”)、etv6-aml1融合蛋白、ezh2、fgf5、flt3-itd、fn1、g250/mn/caix、gage-1,2,8、gage-3,4,5,6,7、gas7、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3、gntv、gp100/pmel17、gpnmb、haus3、hepsin、her-2/neu、herv-k-mel、hla-a11、hla-a2、hla-dob、hsp70-2、ido1、igf2b3、il13rα2、腸羧酸酯酶、k-ras、激肽釋放酶4、kif20a、kk-lc-1、kklc1、km-hn-1、kmhn1(也稱(chēng)為ccdc110)、lage-1、ldlr-巖藻糖轉(zhuǎn)移酶as融合蛋白、lengsin、m-csf、mage-a1、mage-a10、mage-a12、mage-a2、mage-a3、mage-a4、mage-a6、mage-a9、mage-c1、mage-c2、蘋(píng)果酸酶、乳腺球蛋白-a、mart2、matn、mc1r、mcsp、mdm-2、me1、melan-a/mart-1、meloe、midkine、mmp-2、mmp-7、muc1、muc5ac、粘蛋白、mum-1、mum-2、mum-3、肌球蛋白、肌球蛋白i類(lèi)、n-raw、na88-a、neo-pap、nfyc、ny-br-1、ny-eso-1/lage-2、oa1、ogt、os-9、p多肽、p53、pap、pax5、pbf、pml-rarα融合蛋白、多形上皮粘蛋白(“pem”)、ppp1r3b、prame、prdx5、psa、psma、ptprk、rab38/ny-mel-1、rage-1、rbaf600、rgs5、rhoc、rnf43、ru2as、sage、secernin1、sirt2、snrpd1、sox10、sp17、spa17、ssx-2、ssx-4、steap1、生存素、syt-ssx1或-ssx2融合蛋白、tag-1、tag-2、端粒酶、tgf-βrii、tpbg、trag-3、磷酸丙糖異構(gòu)酶、trp-1/gp75、trp-2、trp2-int2、酪氨酸酶、酪氨酸酶(“tyr”)、vegf、wt1、xage-1b/gaged2a。在一些實(shí)施例中，該抗原為新抗原。

在一些實(shí)施例中，受試者為已感染病原體的受試者。在此類(lèi)實(shí)施例中，car所識(shí)別的肽/mhc復(fù)合體中的肽為病原性抗原的肽。

因此，在某些實(shí)施例中，本文提供了治療患有感染(包括病毒感染、細(xì)菌感染、蠕蟲(chóng)感染或原蟲(chóng)感染)的受試者的方法，所述方法包括給受試者施用表達(dá)本文所述car的t細(xì)胞。例如，在一些實(shí)施例中，本文提供了治療病毒感染性疾病的方法，所述病毒感染性疾病包括hpv、hbv、丙型肝炎病毒(hcv)、逆轉(zhuǎn)錄病毒如人類(lèi)免疫缺陷病毒(hiv-1和hiv-2)、皰疹病毒如eb病毒(ebv)、巨細(xì)胞病毒(cmv)、hsv-1和hsv-2，以及流感病毒。在一些實(shí)施例中，所治療的病原體是寄生蟲(chóng)，例如瘧原蟲(chóng)。在一些實(shí)施例中，本文提供了對(duì)細(xì)菌性、真菌性和其他病原性疾病的治療，例如曲霉、布魯線蟲(chóng)、念珠菌、衣原體、球蟲(chóng)、隱球菌、惡絲蟲(chóng)、淋球菌、組織胞漿菌、利什曼原蟲(chóng)、分枝桿菌、支原體、草履蟲(chóng)、百日咳菌、瘧原蟲(chóng)、肺炎球菌、肺囊蟲(chóng)、立克次氏體、沙門(mén)氏菌、志賀氏菌、葡萄球菌、鏈球菌、弓形蟲(chóng)以及霍亂弧菌。示例性物種包括淋病奈瑟氏菌、結(jié)核分枝桿菌、白色念珠菌、熱帶念珠菌、陰道毛滴蟲(chóng)、陰道嗜血桿菌、b族鏈球菌、人型支原體、杜氏嗜血菌、腹股溝肉芽腫、性病性淋巴肉芽腫、梅毒螺旋體、流產(chǎn)布魯氏菌、馬耳他布魯氏菌、豬布魯氏菌、犬布魯氏菌、胎兒彎曲菌、胎兒彎曲菌腸亞種、波蒙納鉤端螺旋體、單核細(xì)胞增多性李斯特菌、綿羊布魯氏菌、鸚鵡熱衣原體、胎兒三毛滴蟲(chóng)、剛地弓形蟲(chóng)、大腸桿菌、馬放線桿菌、綿羊流產(chǎn)沙門(mén)菌、馬流產(chǎn)沙門(mén)菌、銅綠假單胞菌、馬棒狀桿菌、化膿棒狀桿菌、精液放線桿菌、牛生殖道支原體、煙曲霉、分枝犁頭霉、馬媾疫錐蟲(chóng)、駑巴貝斯蟲(chóng)、破傷風(fēng)梭菌、肉毒梭菌；或真菌，例如巴西副球孢子菌；或其他病原體，例如惡性瘧原蟲(chóng)。

在某些實(shí)施例中，給受試者施用的t細(xì)胞所表達(dá)的car對(duì)肽/mhc復(fù)合體具有結(jié)合特異性，其中該肽包含由傳染性病原體表達(dá)的抗原的表位(例如，由所治療的傳染性病原體表達(dá)的表位)。

在某些方面，本文提供了在受試者(例如，人受試者)中誘導(dǎo)對(duì)肽/mhc復(fù)合體的免疫應(yīng)答的方法。在一些實(shí)施例中，該方法包括從該受試者分離t細(xì)胞(例如，cd4t細(xì)胞或cd8t細(xì)胞)。在一些實(shí)施例中，該方法包括誘導(dǎo)t細(xì)胞表達(dá)對(duì)肽/mhc復(fù)合體具有結(jié)合特異性的car。在一些實(shí)施例中，該方法包括給受試者施用t細(xì)胞。在一些實(shí)施例中，該方法包括用包含編碼第一car多肽的核酸序列的第一載體以及包含編碼第二car多肽的核酸序列的第二載體轉(zhuǎn)染t細(xì)胞。在一些實(shí)施例中，該方法包括用包含編碼第一car多肽的核酸序列以及編碼第二car多肽的核酸序列的載體轉(zhuǎn)染t細(xì)胞。在一些實(shí)施例中，該方法包括抑制t細(xì)胞表達(dá)內(nèi)源tcrα和/或tcrβ的步驟。

在一些實(shí)施例中，該受試者為患有自身免疫疾病的受試者。在此類(lèi)實(shí)施例中，t細(xì)胞為調(diào)節(jié)性t細(xì)胞(即，抑制性t細(xì)胞)，并且car所識(shí)別的肽/mhc復(fù)合體中的肽為受試者對(duì)其產(chǎn)生自身免疫應(yīng)答的自體抗原。

在一些方面，本文提供了在受試者中抑制免疫應(yīng)答的方法。在一些實(shí)施例中，該方法包括給受試者施用表達(dá)car的調(diào)節(jié)性t細(xì)胞(例如，cd4⁺、cd-25⁺和foxp3⁺調(diào)節(jié)性t細(xì)胞或treg17t細(xì)胞)，該car包含具有人ig重鏈可變結(jié)構(gòu)域和人tcrβ恒定結(jié)構(gòu)域的第一car多肽，以及具有人ig輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(例如，igκ可變結(jié)構(gòu)域或igλ可變結(jié)構(gòu)域)和人tcrα恒定結(jié)構(gòu)域的第二car多肽，其中該car對(duì)肽/mhc復(fù)合體具有結(jié)合特異性。在一些實(shí)施例中，肽/mhc復(fù)合體為肽/i類(lèi)mhc復(fù)合體。在一些實(shí)施例中，肽/mhc復(fù)合體為肽/ii類(lèi)mhc復(fù)合體。

在某些方面，本文提供了在受試者(例如，人受試者)中抑制對(duì)肽/mhc復(fù)合體的免疫應(yīng)答的方法。在一些實(shí)施例中，該方法包括從該受試者分離調(diào)節(jié)性t細(xì)胞(例如，cd4⁺、cd-25⁺和foxp3⁺調(diào)節(jié)性t細(xì)胞或treg17t細(xì)胞)。在一些實(shí)施例中，該方法包括誘導(dǎo)t細(xì)胞表達(dá)對(duì)肽/mhc復(fù)合體具有結(jié)合特異性的car。在一些實(shí)施例中，該方法包括給受試者施用t細(xì)胞。在一些實(shí)施例中，該方法包括用包含編碼第一car多肽的核酸序列的第一載體以及包含編碼第二car多肽的核酸序列的第二載體轉(zhuǎn)染t細(xì)胞。在一些實(shí)施例中，該方法包括用包含編碼第一car多肽的核酸序列以及編碼第二car多肽的核酸序列的載體轉(zhuǎn)染t細(xì)胞。在一些實(shí)施例中，該方法包括抑制t細(xì)胞表達(dá)內(nèi)源tcrα和/或tcrβ的步驟。

在一些實(shí)施例中，該受試者為患有自身免疫疾病的受試者。在此類(lèi)實(shí)施例中，t細(xì)胞為調(diào)節(jié)性t細(xì)胞(即，抑制性t細(xì)胞)，并且car所識(shí)別的肽/mhc復(fù)合體中的肽為受試者對(duì)其產(chǎn)生自身免疫應(yīng)答的自體抗原。

因此，在一些實(shí)施例中，本文所述方法可用于治療與有害免疫應(yīng)答相關(guān)的疾病或障礙，例如哮喘、炎性疾病、皮膚或器官移植、移植物抗宿主病(gvhd)或自身免疫疾病。自身免疫疾病的例子包括例如腎小球腎炎、關(guān)節(jié)炎、擴(kuò)張性心肌病樣疾病、潰瘍性結(jié)腸炎、干燥綜合征、克羅恩病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、慢性類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化癥、銀屑病、變應(yīng)性接觸性皮炎、多肌炎、厚皮、結(jié)節(jié)性動(dòng)脈周?chē)?、風(fēng)濕熱、尋常性白斑、胰島素依賴(lài)性糖尿病、白塞病、橋本病、愛(ài)迪生氏病、皮肌炎、重癥肌無(wú)力、賴(lài)特綜合征、格雷夫斯病、惡性貧血、肺出血腎炎綜合征、不育癥、慢性活動(dòng)性肝炎、天皰瘡、自身免疫性血小板減少性紫癜和自身免疫性溶血性貧血、活動(dòng)性慢性肝炎、愛(ài)迪生氏病、抗磷脂綜合征、特應(yīng)性變態(tài)反應(yīng)、自身免疫性萎縮性胃炎、自身免疫性胃酸缺乏、乳糜瀉、庫(kù)欣綜合征、皮肌炎、盤(pán)狀狼瘡、紅斑狼瘡、肺出血腎炎綜合征、橋本甲狀腺炎、特發(fā)性腎上腺萎縮、特發(fā)性血小板減少癥、胰島素依賴(lài)性糖尿病、蘭伯特-伊頓綜合征、類(lèi)狼瘡肝炎、淋巴細(xì)胞減少癥的一些病例、混合性結(jié)締組織病、類(lèi)天皰瘡、尋常天皰瘡、惡性貧血、晶狀體源性葡萄膜炎、結(jié)節(jié)性多動(dòng)脈炎、自身免疫性多腺體綜合征、原發(fā)性膽汁性肝硬化、原發(fā)性硬化性膽管炎、雷諾氏綜合征、復(fù)發(fā)性多軟骨炎、施密特氏綜合征、局限性硬皮病(或crest綜合征)、交感性眼炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、大動(dòng)脈炎、顳動(dòng)脈炎、甲狀腺毒癥、b型胰島素抵抗、潰瘍性結(jié)腸炎和韋格納氏肉芽腫。

在某些實(shí)施例中，給受試者施用的t細(xì)胞所表達(dá)的car對(duì)肽/mhc復(fù)合體具有結(jié)合特異性，其中該肽包含作為所治療疾病中自身反應(yīng)性t細(xì)胞的靶標(biāo)的蛋白質(zhì)的表位(例如，由自身免疫疾病中的自身反應(yīng)性t細(xì)胞所靶向的表位)。自身反應(yīng)性t細(xì)胞所靶向的示例性蛋白質(zhì)包括例如p205、胰島素、促甲狀腺激素、酪氨酸酶、trp1和髓磷脂。

核酸分子

本文提供了編碼本文所述抗體、car及抗體和car的部分的核酸分子。在一些實(shí)施例中，該核酸編碼本文所述抗體或car的可變結(jié)構(gòu)域(例如，重鏈和/或輕鏈可變結(jié)構(gòu)域)。所述核酸可存在于例如完整細(xì)胞中、細(xì)胞裂解液中或以部分純化或基本上純的形式存在。

在某些方面，本文提供了編碼本文所述抗體和/或car多肽或其一部分的核酸。所述核酸可存在于例如完整細(xì)胞中、細(xì)胞裂解液中或以部分純化或基本上純的形式存在。本文所述核酸可使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物技術(shù)獲得。例如，本文所述核酸分子可使用標(biāo)準(zhǔn)pcr技術(shù)克隆或以化學(xué)方式合成。對(duì)于編碼雜交瘤所表達(dá)的car或抗體的核酸而言，編碼雜交瘤所制得的抗體或car的每條鏈的cdna可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)pcr擴(kuò)增或cdna克隆技術(shù)獲得。

在某些方面，本文提供了一種核酸組合物，該核酸組合物包含編碼具有ig重鏈可變結(jié)構(gòu)域和tcrβ恒定結(jié)構(gòu)域的第一car多肽的第一核酸序列，以及編碼具有ig輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(例如，igκ可變結(jié)構(gòu)域或igλ可變結(jié)構(gòu)域)和tcrα恒定結(jié)構(gòu)域的第二car多肽的第二核酸序列，其中包含第一car多肽和第二car多肽的car對(duì)肽/mhc復(fù)合體具有結(jié)合特異性。在某些實(shí)施例中，ig重鏈可變結(jié)構(gòu)域和/或ig輕鏈可變結(jié)構(gòu)域?yàn)槿薸g可變結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施例中，tcrβ恒定結(jié)構(gòu)域和/或tcrα恒定結(jié)構(gòu)域?yàn)閲X動(dòng)物恒定結(jié)構(gòu)域(例如，大鼠恒定結(jié)構(gòu)域或小鼠恒定結(jié)構(gòu)域)。在一些實(shí)施例中，tcrβ恒定結(jié)構(gòu)域和/或tcrα恒定結(jié)構(gòu)域?yàn)槿撕愣ńY(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施例中，第一核酸序列和第二核酸序列位于單一核酸分子上。在一些實(shí)施例中，第一核酸序列和第二核酸序列位于分別的核酸分子上。

在某些方面，本文提供了一種核酸組合物，該核酸組合物包含編碼本文所述抗體的重鏈的第一核酸序列以及編碼本文所述抗體的輕鏈(例如，igκ輕鏈或igλ輕鏈)的第二核酸序列，其中包含所述重鏈和輕鏈的抗體對(duì)肽/mhc復(fù)合體具有結(jié)合特異性。在某些實(shí)施例中，ig重鏈可變結(jié)構(gòu)域和/或ig輕鏈可變結(jié)構(gòu)域?yàn)槿薸g可變結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施例中，ig重鏈恒定結(jié)構(gòu)域和/或ig輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域?yàn)閲X動(dòng)物恒定結(jié)構(gòu)域(例如，大鼠恒定結(jié)構(gòu)域或小鼠恒定結(jié)構(gòu)域)。在一些實(shí)施例中，ig重鏈恒定結(jié)構(gòu)域和/或ig輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域?yàn)槿撕愣ńY(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施例中，第一核酸序列和第二核酸序列位于單一核酸分子上。在一些實(shí)施例中，第一核酸序列和第二核酸序列位于分別的核酸分子上。

在某些實(shí)施例中，本文提供了包含本文所述核酸分子的載體。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“載體”是指能夠轉(zhuǎn)運(yùn)與之相連的另一核酸的核酸分子。一種類(lèi)型的載體是“質(zhì)粒”，它是指可在其中連接另外的dna區(qū)段的環(huán)狀雙鏈dna環(huán)。另一種類(lèi)型的載體是病毒載體，其中另外的dna區(qū)段可被連接到病毒基因組中。某些載體能夠在其被引入的宿主細(xì)胞中自主復(fù)制(例如，具有細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)的細(xì)菌載體以及附加型哺乳動(dòng)物載體)。其他載體(例如，非附加型哺乳動(dòng)物載體)在引入宿主細(xì)胞中后可整合到宿主細(xì)胞的基因組中，從而與宿主基因組一起復(fù)制。此外，某些載體能夠指導(dǎo)基因的表達(dá)。此類(lèi)載體在本文中稱(chēng)為“重組表達(dá)載體”(或簡(jiǎn)稱(chēng)“表達(dá)載體”)。

在某些實(shí)施例中，本文提供了包含本文所述核酸(例如，編碼本文所述抗體或car或其一部分的核酸)的細(xì)胞。該細(xì)胞可為例如原核細(xì)胞、真核細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、鳥(niǎo)類(lèi)細(xì)胞、鼠細(xì)胞和/或人細(xì)胞。在某些實(shí)施例中，本文所述核酸有效連接至轉(zhuǎn)錄控制元件，例如啟動(dòng)子。在一些實(shí)施例中，所述細(xì)胞轉(zhuǎn)錄本文所述核酸，從而表達(dá)本文所述抗體、其抗原結(jié)合片段或多肽。該核酸分子可整合到細(xì)胞的基因組中，或其可在染色體外。

本文所提供的核酸分子可使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物技術(shù)獲得。例如，本文所述核酸分子可使用標(biāo)準(zhǔn)pcr技術(shù)克隆或以化學(xué)方式合成。

一旦獲得編碼vh和vl區(qū)段的dna片段，就可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)重組dna技術(shù)進(jìn)一步對(duì)這些dna片段進(jìn)行操縱，例如以將可變區(qū)基因轉(zhuǎn)變?yōu)槿L(zhǎng)抗體鏈基因、轉(zhuǎn)變?yōu)閒ab片段基因或轉(zhuǎn)變?yōu)閟cfv基因。在這些操縱中，編碼vl或vh的dna片段有效連接至編碼另一種蛋白質(zhì)(例如，抗體恒定區(qū)或柔性接頭)的另一dna片段。如該語(yǔ)境中所用，術(shù)語(yǔ)“有效連接”旨在意指這兩個(gè)dna片段接合在一起，使得由這兩個(gè)dna片段編碼的氨基酸序列保持同框。

可通過(guò)將編碼重鏈可變區(qū)的分離dna有效連接至編碼重鏈恒定區(qū)(例如，ch1、ch2和ch3)的另一dna分子，而將該重鏈可變區(qū)dna轉(zhuǎn)變?yōu)槿L(zhǎng)重鏈基因。人重鏈恒定區(qū)基因的序列是本領(lǐng)域已知的(參見(jiàn)例如kabat,e.a.,etal.(1991)sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,fifthedition,u.s.departmentofhealthandhumanservices,nihpublicationno.91-3242(kabat,e.a。等人，1991年，《具有免疫學(xué)重要性的蛋白序列》，第五版，美國(guó)衛(wèi)生和公眾服務(wù)部，nih出版物編號(hào)91-3242))，并且可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)pcr擴(kuò)增來(lái)獲得涵蓋這些區(qū)域的dna片段。重鏈恒定區(qū)可為igg1、igg2、igg3、igg4、iga、ige、igm或igd恒定區(qū)，但最優(yōu)選地為igg1或igg4恒定區(qū)。對(duì)于fab片段重鏈基因而言，編碼vh的dna可有效連接至僅編碼重鏈ch1恒定區(qū)的另一dna分子。

可通過(guò)將編碼輕鏈可變區(qū)的分離dna有效連接至編碼輕鏈恒定區(qū)的另一dna分子，而將該輕鏈可變區(qū)編碼dna轉(zhuǎn)變?yōu)槿L(zhǎng)輕鏈基因(以及fab輕鏈基因)。人輕鏈恒定區(qū)基因的序列是本領(lǐng)域已知的(參見(jiàn)例如kabat,e.a.,etal.(1991)sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,fifthedition,u.s.departmentofhealthandhumanservices,nihpublicationno.91-3242(kabat,e.a。等人，1991年，《具有免疫學(xué)重要性的蛋白序列》，第五版，美國(guó)衛(wèi)生和公眾服務(wù)部，nih出版物編號(hào)91-3242))，并且可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)pcr擴(kuò)增來(lái)獲得涵蓋這些區(qū)域的dna片段。該輕鏈恒定區(qū)可為κ或λ恒定區(qū)，但最優(yōu)選地為κ恒定區(qū)。

實(shí)例

實(shí)例1：攜帶嵌合抗原受體的t細(xì)胞的活化

將編碼識(shí)別肽-mhc復(fù)合體(ny-eso-1和mage-1肽，參見(jiàn)stewart-jonesetal.(2009)rationaldevelopmentofhigh-affinityt-cellreceptor-likeantibodies,proc.nat’l.acad.sci.usa106:5784-88(stewart-jones等人，2009年，高親和力t細(xì)胞受體樣抗體的合理開(kāi)發(fā)，《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》，第106卷，第5784-5788頁(yè))以及hülsmeyeretal.(2005)amajorhistocompatibilitycomplexpeptide-restrictedantibodyandtcellreceptormoleculesrecognizetheirtargetbydistinctbindingmodes,j.biol.chem.280:2972-80(hülsmeyer等人，2005年，主要組織相容性復(fù)合體肽限制性抗體和t細(xì)胞受體分子以不同結(jié)合模式識(shí)別它們的靶標(biāo)，《生物化學(xué)雜志》，第280卷，第2972-2980頁(yè))，這兩篇文獻(xiàn)分別以引用方式并入本文)的抗體的vh和vl結(jié)構(gòu)域的序列并入合成法產(chǎn)生的1.9kb核苷酸序列中，其中免疫球蛋白vκ和vh結(jié)構(gòu)域序列分別布置在tcrac和tcrbc序列的上游(圖3)。stewart-jones等人描述了識(shí)別與hla-a2復(fù)合的ny-eso-1肽(sllmwitqvny，seqidno:1)的抗體；hülsmeyer等人描述了識(shí)別與hla-a1復(fù)合的mage-1肽(eadptghsy，seqidno:2)的抗體。

包含抗ny-eso-1/a2和抗mage-1/a1vh和vl的合成序列還包含vκ和vh兩者上游的ror前導(dǎo)位點(diǎn)(美國(guó)專(zhuān)利no.7,534,604，該專(zhuān)利以引用方式并入本文)，且具有用于雙順?lè)醋颖磉_(dá)的弗林蛋白酶切割位點(diǎn)和自我切割f2a肽(以引用方式并入的yangetal.(2008)developmentofoptimalbicistroniclentiviralvectorsfacilitateshigh-leveltcrgeneexpressionandtumorcellrecognition,genether.15:1411-1423(yang等人，2008年，最佳雙順?lè)醋勇《据d體的開(kāi)發(fā)有利于高水平tcr基因表達(dá)和腫瘤細(xì)胞識(shí)別，《基因療法》，第15卷，第1411-1423頁(yè)))。合成的dna得自藍(lán)鷺公司(blueheron)。作為陰性對(duì)照，將生殖系vκ1-39jκ5[ulc1-39]或vκ3-20jκ1[ulc3-20]和vh3-23jh4[uhc]分別并入慢病毒載體中tcrac和tcrab的上游(對(duì)于ulc1-39和ulc3-20而言，參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公布no.us2011/0195454，并且對(duì)于uhc而言，參見(jiàn)no.us2014/0245468，這兩份專(zhuān)利申請(qǐng)公布均以引用方式并入本文)。

將每個(gè)合成的1.9kbdna序列(即，編碼mage-1car、ny-eso-1car、ulc1-39uhc和ulc3-20uhccar的序列)連接到plvxef1aires-puro慢病毒載體(clontech)的多克隆位點(diǎn)中。通過(guò)293t細(xì)胞的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，用delta8.9和pmdg包裝構(gòu)建體，并且制備病毒上清液，隨后用于轉(zhuǎn)導(dǎo)j.rt3-t3.5(t3)細(xì)胞，這些細(xì)胞來(lái)源于jurkatt細(xì)胞，但無(wú)法產(chǎn)生tcrαβ異二聚體或在其細(xì)胞質(zhì)膜上表達(dá)cd3。jurkat(cd4+cd8-t)細(xì)胞用作對(duì)照。在轉(zhuǎn)導(dǎo)之后，采用facs分選方法，針對(duì)其表達(dá)細(xì)胞表面cd3的能力來(lái)篩選t3細(xì)胞，所有經(jīng)car轉(zhuǎn)導(dǎo)的t3細(xì)胞都表現(xiàn)出cd3的表達(dá)，表明細(xì)胞表面上表達(dá)了car分子。

通過(guò)檢測(cè)人il-2分泌的elispot測(cè)定法，來(lái)確定用包含ny-eso-1的vl和vh或者mage-1的vl和vh的car轉(zhuǎn)導(dǎo)的t3細(xì)胞的t細(xì)胞活化(czerkinskyetal.(1983)asolid-phaseenzyme-linkedimmunospot(elispot)assayforenumerationofspecificantibody-secretingcells,j.immunol.methods65:109-121(czerkinsky等人，1983年，用于對(duì)分泌特異性抗體的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)的固相酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)(elispot)測(cè)定法，《免疫學(xué)方法雜志》，第65卷，第109-121頁(yè))以及miyahiraetal.(1995)quantificationofantigenspecificcd8+tcellsusinganelispotassay.j.immunol.methods,181:45-54(miyahira等人，1995年，使用elispot測(cè)定法對(duì)抗原特異性cd8+t細(xì)胞進(jìn)行定量，《免疫學(xué)方法雜志》，第181卷，第45-54頁(yè))，這兩篇文獻(xiàn)以引用方式并入本文)。人il-2elispot試劑盒購(gòu)自bd生物科學(xué)公司(bdbiosciences)(目錄號(hào)551282)。

具體地講，將單獨(dú)的或表達(dá)mage-1car(a1magecar)、ny-eso-1car(a1nyesocar)或ulc1-39uhccar的t3細(xì)胞以5×10⁵個(gè)細(xì)胞/孔的濃度添加到elispot板的孔中。以1×10⁵個(gè)細(xì)胞/孔(效應(yīng)子與靶細(xì)胞之比為5:1)的濃度添加單獨(dú)的或表達(dá)人hla-a1(k562_a1)或人hla-a2(k562_a2)的靶k562細(xì)胞(不含mhc的細(xì)胞系)。將適當(dāng)?shù)碾?mage-1、hla-a1限制性或ny-eso-1、hla-a2限制性)以10μg/ml的濃度添加到孔中，將板在37℃下溫育16至20小時(shí)，并根據(jù)制造商說(shuō)明使之顯色。

通過(guò)在細(xì)胞因子定位的位點(diǎn)處形成的藍(lán)黑色沉淀物來(lái)檢測(cè)分泌細(xì)胞因子的細(xì)胞的數(shù)量，以此為基礎(chǔ)評(píng)估t細(xì)胞的活化。如圖4所示，僅在存在表達(dá)hla-a1的效應(yīng)細(xì)胞(k562_a1)的情況下用mage-1hla-a1限制性肽處理的表達(dá)a1magecar的細(xì)胞(mage-a1)中出現(xiàn)活化，而在表達(dá)hla-a2的效應(yīng)細(xì)胞(k562_a2)或野生型k562細(xì)胞(k562wt)中未出現(xiàn)活化。此外，在存在無(wú)關(guān)肽的情況下，表達(dá)hla-a1的k562細(xì)胞不會(huì)活化表達(dá)a1magecar的t3細(xì)胞。類(lèi)似地，只有在存在表達(dá)hla-a2的效應(yīng)細(xì)胞(k562_a2)的情況下用ny-eso-1hla-a2限制性肽(eso-1)處理的表達(dá)a2nyesocar的t3細(xì)胞才被活化，如il-2分泌所證實(shí)。任何肽-mhc復(fù)合體都不活化表達(dá)ulc1-39uhccar的t3細(xì)胞(陰性對(duì)照)。

實(shí)例2：表達(dá)嵌合抗原受體的經(jīng)遺傳修飾的小鼠的生成

實(shí)例2.1：嵌合人igκ可變區(qū)–小鼠tcra恒定區(qū)基因座的構(gòu)建

通過(guò)細(xì)菌同源重組(bhr)來(lái)修飾包含所有人jκ區(qū)段和4個(gè)功能性人vκ區(qū)段的igκ大靶向載體(ltvec)(“vi-1”，參見(jiàn)macdonaldetal.(2014)preciseandinsitugenetichumanizationof6mbofmouseimmunoglobulingenes,proc.natlacad.sciusa111:5147-52(macdonald等人，2014年，6mb小鼠免疫球蛋白基因的精確原位遺傳人源化，《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》，第111卷，第5147-5152頁(yè))及補(bǔ)充信息)，以將5'小鼠κ臂和neo-tk-loxp盒替換為側(cè)接獨(dú)特i-ceui和asisi位點(diǎn)的氯霉素(cm)抗性盒(圖5，步驟1)。在步驟2中，通過(guò)bhr來(lái)進(jìn)一步修飾步驟1中生成的構(gòu)建體，以將3'小鼠κ臂和spec盒替換為側(cè)接獨(dú)特noti和pi-scei位點(diǎn)的loxp-neo-loxp盒。隨后(步驟3)，將包含16kb遠(yuǎn)側(cè)小鼠tcra臂和frt-hyg-frt盒的i-ceui-asisi核酸片段連接到步驟2的構(gòu)建體中以替換cm盒。最后(步驟4)，將包含24kb近側(cè)小鼠tcra臂和spec盒的noti-pi-scei核酸片段連接到步驟3的構(gòu)建體的noti和pi-scei位點(diǎn)中，從而替換loxp-neo-loxp盒，形成被稱(chēng)為maid6548的最終的ltvec。

最終的ltvec從5'到3'包含：(1)用于在es細(xì)胞中同源重組的16kb5'小鼠tcra臂(基因組位置14:52411629-52427793，所有坐標(biāo)基于小鼠組裝grcm38)，(2)用于在大腸桿菌(e.coli)或es細(xì)胞中選擇的frt-hyg-frt盒，(3)包含4個(gè)最近側(cè)vκ區(qū)段和所有5個(gè)jκ區(qū)段(j1-j5)的111kb人κ基因座dna，(4)用于在es細(xì)胞中同源重組的24kb3'小鼠tcra臂，其包含tcra恒定區(qū)基因(基因組位置14:54218920-54243117)，以及(5)用于在大腸桿菌中選擇的spec盒。

ltvec(maid6548)具有下列接合序列，其中小鼠序列位于括號(hào)中，人序列采用正常字體，多克隆位點(diǎn)采用粗體，并且frt序列采用斜體(表1)。

表1：igκv-tcrac大靶向載體的接合序列(5'到3')

maid6548用于以電穿孔方式導(dǎo)入maid1540hetes細(xì)胞中(參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利no.9,113,616的圖4a，該專(zhuān)利以引用方式并入本文)，其中所有小鼠tcrav和j區(qū)段已被缺失并替換為neo盒(圖6)。所得基因座的接合序列與上表1中所述相同。使用測(cè)定法篩選hyg抗性es細(xì)胞，以鑒別正確靶向的克隆(參見(jiàn)例如lieandpetropoulos,1998.curr.opin.biotechnology9:43-48(lie和petropoulos，1998年，《生物技術(shù)當(dāng)前述評(píng)》，第9卷，第43-48頁(yè))，該文獻(xiàn)以引用方式并入本文)(表2；loa＝等位基因丟失；goa＝等位基因獲得，所識(shí)別的區(qū)域在圖6中示出)。

表2：taqman引物和探針

如果需要，可使用ltvec將另外的人vκ區(qū)段添加到tcr可變區(qū)基因座，這些ltvec具有連接到與初始插入片段重疊的人igκ序列的上述相同16kb5'小鼠tcra同源臂。

可利用不同策略來(lái)生成此類(lèi)es細(xì)胞。圖7中總結(jié)的一種方法涉及兩種不同大靶向載體向es細(xì)胞中的雙重靶向或共同電穿孔。在該方法中，第一大靶向載體(標(biāo)記為maid1710，來(lái)源于如美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公布no.2012/0096512a1(以引用方式并入本文)中所述構(gòu)建的載體的限制性酶切)包含具有人vκ1-5和vκ1-6基因區(qū)段序列的3'30kb同源臂、具有人vκ3-7至vκ3-15基因區(qū)段的120kb序列、以及具有人vκ1-16基因區(qū)段的5'20kb區(qū)域(“重疊區(qū)”)。第二大靶向載體(標(biāo)記為maid6600，也來(lái)源于如美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公布no.2012/0096512a1中所述構(gòu)建的載體)包含3'20kb重疊區(qū)(與第一載體中一樣，具有人vκ1-16基因區(qū)段的區(qū)域)、具有人vκ1-17至vκ2-30基因區(qū)段的140kb序列、frt-ub-neo-frt選擇盒以及15.5kb3'小鼠tcra同源臂。圖6中所生成的es細(xì)胞(maid6548，對(duì)于所有人jκ區(qū)段和四個(gè)功能性人vκ基因區(qū)段為雜合的)使用上述兩個(gè)大靶向載體以及編碼經(jīng)修飾的鋅指核酸酶(zfn)的核酸進(jìn)行電穿孔，該經(jīng)修飾的鋅指核酸酶靶向潮霉素基因的核苷酸序列tgcgatcgctgcggccgatcttagccagacgagcgggttcgg(其中切割位點(diǎn)采用小寫(xiě)字母；seqidno:24)并促進(jìn)hyg序列處的雙鏈斷裂。通過(guò)同源重組將這兩個(gè)共同電穿孔的大靶向載體插入dna序列中，從而替換包含和圍繞hyg選擇盒的區(qū)域。所得的es細(xì)胞在內(nèi)源tcrα基因座處包含具有人jκ1至jκ5和vκ4-1至vκ2-30基因區(qū)段的人免疫球蛋白可變區(qū)。使用上述測(cè)定法(lie和petropoulos，出處同上)，利用圖7中指示并在下表3中列出的探針和引物，確認(rèn)這兩個(gè)大靶向載體的成功并入(goa＝等位基因獲得；loa＝等位基因丟失；拷貝數(shù)＝檢查序列的拷貝數(shù)以跟蹤轉(zhuǎn)基因整合與靶向整合；harm1＝第一大靶向載體(maid1710)的30kb3'同源臂；harm2＝第一大靶向載體(maid1710)與第二大靶向載體(maid6600)的20kb重疊區(qū)，marm＝第二靶向載體(maid6600)的15.5kb5'同源臂，野生型小鼠對(duì)照–小鼠tcrα基因座處存在的序列)。

表3：taqman引物和探針

es細(xì)胞中的所得被靶向基因座具有下列接合序列，其中小鼠序列位于括號(hào)中，人序列采用正常字體，多克隆位點(diǎn)采用粗體，并且frt序列采用斜體(表4)。

表4：由雙重es細(xì)胞靶向得到的基因座的接合序列(5'到3')

用于生成包含另外的免疫球蛋白可變區(qū)基因區(qū)段的tcrα基因座的替代策略涉及使用包含另外的可變基因區(qū)段的大靶向載體進(jìn)行連續(xù)靶向(參見(jiàn)例如圖8)。使用大靶向載體對(duì)所有人jκ基因區(qū)段和四個(gè)功能性人vκ基因區(qū)段雜合的es細(xì)胞(maid6548；參見(jiàn)圖6)進(jìn)行電穿孔，該大靶向載體從5'到3'包含：15.5kb5'小鼠同源臂、frt-ub-neo-frt選擇盒、具有vκ3-7至vκ3-15基因區(qū)段的120kb片段、以及具有vκ1-5和vκ1-6基因區(qū)段的30kb3'人同源臂(也存在于maid6548序列中)。使用上述taqman測(cè)定法，利用上表3中列出并在圖8中指示的引物和探針確認(rèn)成功并入：hyg、higk5、higk6、higk12、neo、親本1540m3、親本1540m1。還使用另外一組引物和探針higk10確認(rèn)成功并入：正向引物–cgattatgactggttaggtagaaaggtg(seqidno:71)；探針–gccactggtttctccaaatgttttcaatccat(seqidno:72)；反向引物–gggagtacttggagatccctaagc(seqidno:73)。

es細(xì)胞中的所得被靶向基因座具有下列接合序列，其中小鼠序列位于括號(hào)中，人序列采用正常字體，多克隆位點(diǎn)采用粗體，并且frt序列采用斜體(表5)。

表5：由單es細(xì)胞靶向得到的基因座的接合序列(5'到3')

在完成圖8中所示的單靶向或圖7中所示的雙重靶向后，可使用包含另外的vκ基因區(qū)段的大靶向載體相繼地靶向es細(xì)胞，以并入功能性人免疫球蛋白vκ基因區(qū)段的完整組庫(kù)(repertoire)，例如，近側(cè)v聚簇(cluster)中的所有功能性人vκ基因區(qū)段。作為圖8和圖7中所示的雙重或相繼單靶向方法的替代形式，可使用三重靶向方法生成es細(xì)胞，這些es細(xì)胞最多包含功能性人免疫球蛋白vκ基因區(qū)段的整個(gè)組庫(kù)，例如近側(cè)v聚簇中的所有功能性人vκ基因區(qū)段。在圖9所示的該方法中，第一大靶向載體(用asci和noti限制性酶修剪的maid1710，參見(jiàn)上文)包含具有人vκ1-5和vκ1-6基因區(qū)段序列的3'30kb同源臂、具有人vκ3-7至vκ3-15基因區(qū)段序列的120kb序列、以及具有人vκ1-16基因區(qū)段的5'20kb區(qū)域(“重疊區(qū)”)。第二大靶向載體(用asci和noti限制性酶修剪的maid6600，參見(jiàn)上文)包含3'20kb重疊區(qū)(與第一載體中一樣，具有人vκ1-16基因區(qū)段的區(qū)域)、具有人vκ1-17至vκ2-24基因區(qū)段的80kb序列、以及具有人vκ3-25至vκ2-30基因區(qū)段的5'60kb區(qū)域(“重疊區(qū)”)。最后，第三大靶向載體(maid6647，其也來(lái)源于如美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公布no.2012/0096512a1(以引用方式并入)中所述構(gòu)建的載體)包含具有人vκ3-25至vκ2-30的5'60kb重疊區(qū)、具有vκ3-31至vκ2-40的90kb序列、和frt-ub-neo-frt選擇盒、以及15.5kb3'小鼠tcra同源臂。圖6中所生成的es細(xì)胞(maid6548，對(duì)于所有人jκ區(qū)段和四個(gè)功能性人vκ基因區(qū)段為雜合的)使用上述三個(gè)大靶向載體以及編碼經(jīng)修飾的鋅指核酸酶(zfn)的核酸進(jìn)行電穿孔，該經(jīng)修飾的鋅指核酸酶靶向潮霉素基因的核苷酸序列tgcgatcgctgcggccgatcttagccagacgagcgggttcgg(其中切割位點(diǎn)采用小寫(xiě)字母；seqidno:76)并促進(jìn)hyg序列處的雙鏈斷裂。通過(guò)同源重組將這三個(gè)共同電穿孔的大靶向載體插入dna序列中，從而替換包含和圍繞hyg選擇盒的區(qū)域。所得的es細(xì)胞在內(nèi)源tcrα基因座處包含具有人jκ1至jκ5和vκ4-1至vκ2-40基因區(qū)段(即，近側(cè)vκ聚簇的所有功能性人vκ基因區(qū)段)的人免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域。使用上述測(cè)定法(lie和petropoulos，出處同上)，利用圖9中指示并在下表6中列出的探針和引物，確認(rèn)這三個(gè)大靶向載體的成功并入(goa＝等位基因獲得；loa＝等位基因丟失；拷貝數(shù)＝檢查序列的拷貝數(shù)以跟蹤轉(zhuǎn)基因整合與靶向整合；harm1＝第一大靶向載體(maid1710)的30kb3'同源臂；harm2＝第一大靶向載體(maid1710)與第二大靶向載體(maid6600)的20kb重疊區(qū)，marm＝第二靶向載體(maid6600)的15.5kb5'同源臂，harm3＝第二靶向載體(maid6600)與第三靶向載體(maid6647)的60kb重疊區(qū)，野生型小鼠對(duì)照–小鼠tcrα基因座處存在的序列)。

表6：taqman引物和探針

es細(xì)胞中的所得被靶向基因座具有下列接合序列，其中小鼠序列位于括號(hào)中，人序列采用正常字體，多克隆位點(diǎn)采用粗體，并且frt序列采用斜體(表7)。

表7：由三重es細(xì)胞靶向得到的基因座的接合序列(5'到3')

在另外其他替代策略中，相繼的另外人igvκ基因區(qū)段向圖6中所示的基因座中的三重靶向、雙重靶向或單靶向可使用三重靶向方案(三個(gè)大靶向載體)、雙重靶向方案(兩個(gè)大靶向載體)或單靶向方案(一個(gè)大靶向載體)來(lái)完成，這些方案涉及鋅指核酸酶或crispr介導(dǎo)的選擇(例如，潮霉素)盒破壞。

上述的被靶向es細(xì)胞用作供體es細(xì)胞，并通過(guò)方法引入8細(xì)胞期的小鼠胚胎中(參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利no.7,294,754以及poueymirouetal.(2007)f0generationmicethatareessentiallyfullyderivedfromthedonorgene-targetedescellsallowingimmediatephenotypicanalysesnaturebiotech.25(1):91-99(poueymirou等人，2007年，基本完全來(lái)源于供體基因靶向的es細(xì)胞并允許立即表型分析的f0代小鼠，《自然生物技術(shù)》，第25卷，第1期，第91-99頁(yè)))。使用檢測(cè)獨(dú)特基因序列存在與否的改編的等位基因測(cè)定法，通過(guò)基因分型鑒別獨(dú)立地?cái)y帶嵌合人igκv–小鼠tcrac基因的(完全來(lái)源于供體es細(xì)胞的f0小鼠)。

實(shí)例2.2：嵌合人igh可變區(qū)–小鼠tcrb恒定區(qū)基因座的構(gòu)建

通過(guò)若干不同策略之一來(lái)構(gòu)建嵌合人igh可變區(qū)–小鼠tcrb恒定區(qū)基因座。

策略1示于圖11中。為了獲得用于該策略的大靶向載體(ltveca)，在如圖10中所示的若干bhr和限制性酶切/連接步驟中修飾包含所有人免疫球蛋白重鏈jh和dh區(qū)段及一個(gè)近側(cè)vh區(qū)段的免疫球蛋白重鏈ltvec(“vi-2”)，從而生成包含所有人免疫球蛋白jh和dh區(qū)段的構(gòu)建體(ltvecb[maid6555])。ltvecb的5'小鼠臂包含胰蛋白酶原基因(try15-try20)，而3'臂包含小鼠tcrbc2和vβ31基因。ltvecb還包含用于增強(qiáng)car基因座處的免疫球蛋白重鏈可變區(qū)重組的小鼠igm增強(qiáng)子(eμ)。

在下一步中，通過(guò)bhr、限制性酶切/連接以及crispr/cas9介導(dǎo)的等溫bac組裝(2015年6月23日提交的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)no.14/747,461，以引用方式并入本文)的若干步驟進(jìn)一步修飾ltvecb，以生成大靶向載體(ltveca)，該大靶向載體從5'到3'包含：(1)用于在大腸桿菌中選擇的em7-hyg盒；(2)用于在es細(xì)胞中同源重組的包含胰蛋白酶原基因(try20，基因組位置6:41504907-41525442)的20kb5'小鼠臂；(3)用于在大腸桿菌或es細(xì)胞中選擇的frt-neo-loxp-frt盒；(4)包含3最近側(cè)vh區(qū)段及所有dh和jh區(qū)段的145kb人igh基因座；(5)包含igm增強(qiáng)子(eμ)(基因組位置12:113427167-113428462)的1296bp小鼠igh基因座(作為另一種選擇，不包含該序列)；以及(6)用于在es細(xì)胞中同源重組的包含trbc2恒定區(qū)基因(基因組位置6:41543957-41584559)的40kb3'小鼠臂(參見(jiàn)圖10)。

ltveca具有下列接合序列，其中小鼠序列位于括號(hào)中，人序列采用正常字體，多克隆位點(diǎn)采用粗體，并且frt序列采用斜體(表8)：

表8：ighv-tcrbc大靶向載體(ltveca)的接合序列(5'到3')

在策略1中，在生成ltveca的克隆步驟后，在單靶向步驟中將嵌合基因座引入es細(xì)胞中。如圖11所示，將人ighv、d和j區(qū)段插入在攜帶tcrb基因座的es細(xì)胞中小鼠3'胰蛋白酶原(try)基因下游(小鼠try基因未按比例示出；tcrb基因座包含多個(gè)try基因)和小鼠tcrbc2上游，該tcrb基因座包含這兩個(gè)胰蛋白酶原重復(fù)序列之間所有小鼠tcrbv區(qū)段的缺失(maid1545，參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利no.9,113,616的圖8a，該專(zhuān)利以引用方式并入本文)。因此，小鼠tcrbd1-j1-c1和d2-j2被替換為人v、d和j區(qū)段，而大部分小鼠v區(qū)段缺失。小鼠igm增強(qiáng)子(eμ)也插入在tcrbc2的5'，但其也可使用本領(lǐng)域已知的方法缺失(例如在用于電穿孔的靶向載體中)。任選地，小鼠tcrvβ31基因也可缺失。

為了進(jìn)行人ighvh區(qū)段的另外的插入，使maid1545中的hyg基因失活(也參見(jiàn)圖11)。這可在靶向之前或之后通過(guò)以下方式進(jìn)行：(1)使用crispr/cas9或鋅指核酸酶(zfh)向hyg編碼序列中引入小indel突變，使得無(wú)法再制得功能性hyg蛋白(參見(jiàn)2015年6月5日提交的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)no.14/731,914，該專(zhuān)利申請(qǐng)以引用方式并入本文)；或(2)通過(guò)同源重組替換為loxp-neo-loxp盒，隨后用cre去除該盒。

所得car基因座的接合序列與上表8中所列相同。通過(guò)測(cè)定法篩選neo抗性es細(xì)胞，以鑒別正確靶向的克隆。由于1545等位基因包含上游hyg-loxp盒，ltveca中的loxp位點(diǎn)允許確定哪個(gè)tcrb等位基因在1545hetes細(xì)胞中被靶向；因此，這兩個(gè)loxp位點(diǎn)之間的區(qū)域的cre缺失用于確定與野生型tcrb等位基因相比哪些克隆被靶向至1545等位基因。

在策略2中，保留tcrb基因座的基本組織(5'與3'try基因簇之間的v區(qū)段，以及3'try基因簇與tcrb2恒定區(qū)之間的d和j區(qū)段)。具體地講，通過(guò)以下方式修飾包含14個(gè)人tcrbv區(qū)段及所有人tcrbd和j區(qū)段的es細(xì)胞(參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利no.9,113,616(以引用方式并入本文)的圖7)：首先利用大靶向載體(ltvecb，參見(jiàn)圖12)，將包含人tcrbd和j區(qū)段的區(qū)域替換為免疫球蛋白重鏈d和j區(qū)段，該大靶向載體從5’到3’包含：(1)包含小鼠try基因的5’同源臂(小鼠try基因未按比例示出；tcrb基因座包含多種try基因)，(2)hyg選擇盒和(3)所有人免疫球蛋白重鏈d和j區(qū)段，(4)小鼠eμ基因序列，以及(5)包含小鼠tcrb恒定區(qū)、小鼠eβ基因和小鼠tcrvβ31基因區(qū)段的3’同源臂(圖13的步驟1)。

在該修飾及該選擇盒去除后，利用大靶向載體(ltvecd，參見(jiàn)圖12)，通過(guò)電穿孔對(duì)es細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步修飾，該大靶向載體從5’到3’包含：(1)包含小鼠try基因(try7)的5’同源臂，(2)neo選擇盒，(3)三個(gè)人免疫球蛋白重鏈可變基因區(qū)段，以及(4)包含小鼠try基因(try4)的3’同源臂(參見(jiàn)圖13的步驟3)。

所得的es細(xì)胞包含人免疫球蛋白重鏈v基因區(qū)段vh1-3、vh1-2和vh6-1、所有人免疫球蛋白重鏈d和j基因區(qū)段、以及小鼠免疫球蛋白eμ增強(qiáng)子、小鼠tcrb恒定區(qū)、小鼠tcrb增強(qiáng)子和遠(yuǎn)側(cè)3’小鼠tcrvβ31基因區(qū)段。在該策略中的每一步，使用如上所述測(cè)定法確認(rèn)特定ltvec的成功引入。

es細(xì)胞中的最終tcrb基因座包含下列接合序列，其中小鼠序列位于括號(hào)中，人序列采用正常字體，多克隆位點(diǎn)采用粗體，并且frt序列采用斜體：

表9：策略2的tcrbcar基因座的接合序列(5'到3')

作為上述策略2的替代形式，并不引入ltvecb，而是引入ltvecc(參見(jiàn)圖12)，后者不包含小鼠eμ。用于生成嵌合tcrbcar基因座的另外的策略在臨時(shí)申請(qǐng)、美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)no.62/052,947、no.62/076,836、no.62/094,603、no.62/167,650(以引用方式并入本文)中有描述。最后，如圖13所示，可使用各種策略(包括使用crispr/cas9技術(shù))，使遠(yuǎn)側(cè)3’tcrvβ31缺失。

可使用cre或flpo酶去除留下的任何選擇盒(參見(jiàn)例如圖13)。如果策略1或策略2需要的話，使用ltvec將另外的人vh區(qū)段添加到tcr可變區(qū)基因座，這些ltvec具有連接到與初始插入片段重疊的人igh序列的上述5'小鼠tcrb同源臂。

上述的被靶向es細(xì)胞用作供體es細(xì)胞，并通過(guò)方法引入8細(xì)胞期的小鼠胚胎中。使用檢測(cè)獨(dú)特基因序列存在與否的改編的等位基因測(cè)定法，通過(guò)基因分型鑒別獨(dú)立地?cái)y帶嵌合人ighv–小鼠tcrbc基因的(完全來(lái)源于供體es細(xì)胞的f0小鼠)。

實(shí)例2.3：嵌合抗原受體小鼠的構(gòu)建

使攜帶嵌合人igκv–小鼠tcrac基因和嵌合人ighv–小鼠tcrbc基因的小鼠一起交配，從而生成包含這兩個(gè)嵌合基因座的小鼠。包含這兩個(gè)嵌合基因座的小鼠在其t細(xì)胞表面上表達(dá)嵌合抗原受體(car)，該嵌合抗原受體包含t細(xì)胞受體恒定結(jié)構(gòu)域和免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域(小鼠t細(xì)胞受體恒定結(jié)構(gòu)域和人免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域)。使子代交配至對(duì)于每個(gè)嵌合基因呈純合性。

作為另一種選擇，使用包含嵌合人igκ–小鼠tcrac基因或嵌合人ighv–小鼠tcrbc基因的es細(xì)胞來(lái)引入包含另一嵌合基因(分別為嵌合人ighv–小鼠tcrbc基因或嵌合人igκ–小鼠tcrac基因)的靶向載體，并且通過(guò)如上所述的方法，由這些es細(xì)胞生成攜帶這兩種嵌合基因的小鼠。

在細(xì)胞表面上檢測(cè)嵌合人igκ–小鼠tcrac/嵌合人ighv–小鼠tcrbc抗原受體的表達(dá)。一種用于檢測(cè)的方法將以下(1)、(2)和(3)進(jìn)行組合：(1)使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)檢測(cè)tcr恒定區(qū)表達(dá)的facs分析(抗tcrα抗體f1(3a8)#tcr1145，thermo-pierce；抗tcrβ抗體f1(8a3)#tcr1151，thermo-pierce；抗tcrα-β異二聚體抗體克隆t10b9.1a-31，bd-pharmigen；抗tcrα-β異二聚體抗體克隆ip26；ebioscience)，(2)使用相同抗體確認(rèn)嵌合蛋白大小的蛋白印跡，(3)rt-pct，其使用與免疫球蛋白可變區(qū)段序列退火的正向引物組合和與tcr恒定區(qū)序列退火的引物來(lái)確認(rèn)嵌合轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)。另外，可使用抗cd3和抗tcrα-β抗體的組合來(lái)確認(rèn)tcr/cd3復(fù)合體在細(xì)胞表面上的形成。還使用如上所述的下一代測(cè)序來(lái)確認(rèn)嵌合轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)。

實(shí)例3：人igκ可變區(qū)區(qū)段在攜帶igκ/tcrα嵌合抗原受體基因座的小鼠的t細(xì)胞中的應(yīng)用

從三只小鼠收集胸腺細(xì)胞和脾細(xì)胞，這些細(xì)胞在其基因組中包含car基因座，其中tcrα可變區(qū)被替換為部分人igκ可變區(qū)(圖14和圖15中的4個(gè)功能性vκ和5個(gè)功能性jκ–參見(jiàn)如圖6所示生成的小鼠；圖16和圖17中的16個(gè)功能性vκ和5個(gè)功能性jκ–參見(jiàn)如圖7所示生成的小鼠)。使用抗cd90.2磁珠和管柱(美天旎生物技術(shù)公司(miltenyibiotech))，通過(guò)磁性細(xì)胞分選從總脾細(xì)胞中正向富集t細(xì)胞。使用rneasyplusrna分離試劑盒(凱杰公司(qiagen))，根據(jù)制造商的說(shuō)明從純化的脾t細(xì)胞和胸腺細(xì)胞中分離總rna。

使用smarter^tmracecdna擴(kuò)增試劑盒(clontech)和tcrα特異性引物(5'–tcaaagtcggtgaacaggcagag-3'；seqidno:143)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，以生成包含tcrα恒定區(qū)序列的cdna。在該過(guò)程中，dna序列(piia：5'–cccatgtactctgcgttgataccactgctt-3'；seqidno:144)被附接到新合成的cdna的3'端。使用凝膠和pcr純化試劑盒(clontech)純化cdna。

然后使用piia特異性引物(5'-gtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatctaagcagtggtatcaacgcagagt-3'；seqidno:145)和tcrα特異性引物(5'–acactctttccctacacgacgctcttccgatctacagcaggttctgggttctggatg-3'；seqidno:146)，通過(guò)pcr擴(kuò)增純化的cdna。在2％瓊脂糖凝膠上分離pcr產(chǎn)物，并且使用凝膠提取試劑盒(凱杰公司(qiagen))分離和純化長(zhǎng)度在400至700bp之間的片段。使用下列引物，通過(guò)pcr進(jìn)一步擴(kuò)增這些片段：5'–aatgatacggcgaccaccgagatctacacxxxxxxacactctttccctacacgacgctcttccgatc-3'和5'-caagcagaagacggcatacgagatxxxxxgtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatct-3'(分別為seqidno:147和seqidno:148；“xxxxxx”表示能實(shí)現(xiàn)多重樣品測(cè)序的6bp索引序列)。在上樣于miseq測(cè)序儀(億明達(dá)公司(illumina))進(jìn)行測(cè)序之前，使用kapa文庫(kù)定量試劑盒(卡帕生物系統(tǒng)公司(kapabiosystems))，通過(guò)qpcr對(duì)400bp至600bp之間的pcr產(chǎn)物進(jìn)行分離、純化和定量。

對(duì)于生物信息學(xué)分析而言，基于樣品索引完全匹配來(lái)分選所得的illumina序列，并為了質(zhì)量而進(jìn)行修剪。然后使用igblast(ncbi,v2.2.25+)的本地安裝，基于重排igκ序列與人生殖系v和j區(qū)段數(shù)據(jù)庫(kù)及重排tcrα序列與小鼠生殖系v和j區(qū)段數(shù)據(jù)庫(kù)的比對(duì)，對(duì)重疊配偶對(duì)進(jìn)行組裝和注釋。當(dāng)檢測(cè)到得分相同的多個(gè)最佳匹配時(shí)，將序列標(biāo)記為不明確并從分析中移除。開(kāi)發(fā)了一組perl腳本，以分析結(jié)果并將數(shù)據(jù)存儲(chǔ)在mysql數(shù)據(jù)庫(kù)中。

對(duì)于包含4個(gè)功能性vκ和5個(gè)功能性jκ的小鼠而言，如圖14所示，序列分析表明，car基因座中的igκ可變結(jié)構(gòu)域在car轉(zhuǎn)基因小鼠的t細(xì)胞和胸腺細(xì)胞中經(jīng)歷了vj重組，其中約80％讀段包含最近側(cè)vκ基因區(qū)段(igvk4-1)，該基因區(qū)段在脾和胸腺兩者中與不同jκ基因區(qū)段重排。如圖15所示，從脾t細(xì)胞擴(kuò)增的大部分重排人igκvj序列是有效的。

對(duì)于包含16個(gè)功能性vκ和5個(gè)功能性jκ的小鼠而言，如圖16所示，序列分析表明，car基因座中的igκ可變結(jié)構(gòu)域在car轉(zhuǎn)基因小鼠的脾t細(xì)胞和胸腺細(xì)胞中經(jīng)歷了vj重組。這些重排涉及所有功能性人vκ和jκ區(qū)段，其中約40％讀段包含最近側(cè)vκ基因區(qū)段(igvk4-1)。如圖17所示，從脾t細(xì)胞和胸腺擴(kuò)增的約2/3重排人igκvj序列是有效的。

實(shí)例4：人igh可變區(qū)區(qū)段在攜帶igh/tcrβ嵌合抗原受體基因座的小鼠的t細(xì)胞中的應(yīng)用

收集來(lái)自四只小鼠的胸腺細(xì)胞及來(lái)自三只小鼠的脾細(xì)胞，所述胸腺細(xì)胞在其基因組中包含car基因座，其中tcrβ可變區(qū)被替換為部分人igh可變區(qū)(3個(gè)功能性人vh及所有功能性人d和jh基因區(qū)段，參見(jiàn)圖13)，并且所述脾細(xì)胞在其基因組中包含相同car(igh+tcrcβ)基因座。使用抗cd90.2磁珠和管柱(美天旎生物技術(shù)公司(miltenyibiotech))，通過(guò)磁性細(xì)胞分選從總脾細(xì)胞中正向富集t細(xì)胞。使用rneasyplusrna分離試劑盒(凱杰公司(qiagen))，根據(jù)制造商的說(shuō)明從純化的脾t細(xì)胞和胸腺細(xì)胞中分離總rna。

使用smarter^tmracecdna擴(kuò)增試劑盒(clontech)和tcrβ特異性引物(5'–cgagggtagccttttgtttgtttgc-3'；seqidno:149)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，以生成包含tcrβ恒定區(qū)序列的cdna。在該過(guò)程中，dna序列(5'–cccatgtactctgcgttgataccactgctt-3'；seqidno:150)被附接到新合成的cdna的3'端。使用凝膠和pcr純化試劑盒(clontech)純化cdna。

然后使用引物5’-acactctttccctacacgacgctcttccgatctgaccttgggtggagtcacatttctc-3’和5’-gtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatctaagcagtggtatcaacgcagagt-3’(分別為seqidno:151和152)通過(guò)pcr擴(kuò)增純化的cdna。使用下列引物，通過(guò)pcr進(jìn)一步擴(kuò)增這些片段：5’–aatgatacggcgaccaccgagatctacacxxxxxxacactctttccctacacgacgctcttccgatct-3’和5’-caagcagaagacggcatacgagatxxxxxxgtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatct-3’(“xxxxxx”為六核苷酸條形碼序列；(分別為seqidno:153和154))。在上樣于miseq測(cè)序儀(億明達(dá)公司(illumina))進(jìn)行測(cè)序之前，使用kapa文庫(kù)定量試劑盒(卡帕生物系統(tǒng)公司(kapabiosystems))，通過(guò)qpcr對(duì)490至710個(gè)堿基對(duì)之間的pcr產(chǎn)物進(jìn)行分離、純化和定量。

對(duì)于生物信息學(xué)分析而言，對(duì)所得的illumina序列進(jìn)行多重分解并為了質(zhì)量而進(jìn)行修剪。然后使用igblast(ncbi,v2.2.25+)的本地安裝，基于重排igh序列與人生殖系v、d和j區(qū)段數(shù)據(jù)庫(kù)的比對(duì)，對(duì)重疊配對(duì)末端讀段進(jìn)行組裝和注釋。當(dāng)檢測(cè)到得分相同的多個(gè)最佳匹配時(shí)，將序列標(biāo)記為不明確并從分析中移除。開(kāi)發(fā)了一組perl腳本，以分析結(jié)果并將數(shù)據(jù)存儲(chǔ)在mysql數(shù)據(jù)庫(kù)中。

對(duì)于包含3個(gè)功能性人vh及所有功能性人d和jh的小鼠而言，如圖18所示，序列分析表明，car基因座中的igh可變區(qū)在car轉(zhuǎn)基因小鼠的脾和胸腺中經(jīng)歷了vdj重組。示出了vh和jh區(qū)段的分析。如圖19所示，從脾或胸腺擴(kuò)增的大部分重排人ighvdj序列是有效的。

實(shí)例5：由攜帶嵌合抗原受體基因座的小鼠生成抗原結(jié)合蛋白

在使如上文在實(shí)例2中所述包含經(jīng)改造的嵌合抗原受體基因座人igκ–小鼠tcrac和人ighv–小鼠tcrbc的小鼠交配之后，用目標(biāo)抗原(例如，將在mhc上遞呈的抗原，如病毒肽-mhc抗原、腫瘤肽-mhc抗原、自身免疫肽-mhc抗原)對(duì)所選擇的小鼠進(jìn)行免疫接種。在抗原激發(fā)后，使用經(jīng)標(biāo)記的四聚化形式免疫原進(jìn)行分選，從而從動(dòng)物回收抗原特異性t細(xì)胞。確定所分選的cart細(xì)胞的igκ和igh可變區(qū)的序列，并且以分別在人tcrα和tcrβ恒定區(qū)上游有效連接的方式克隆這些可變區(qū)序列。將嵌合核酸序列引入報(bào)告t細(xì)胞系中。在表達(dá)用于免疫接種的肽-mhc復(fù)合體的靶細(xì)胞上篩選報(bào)告t細(xì)胞系，并且選擇對(duì)目標(biāo)抗原具有所需特性(例如，親和力、選擇性、表位等)的car。確定所選擇的car的igκ和igh可變區(qū)的序列，并且以分別在人igκ和igh恒定區(qū)上游有效連接的方式克隆這些可變區(qū)序列，以生成對(duì)所靶向的肽-mhc復(fù)合體具有特異性的人抗體。這些抗體可用于靶向表達(dá)目標(biāo)肽-mhc的被感染細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞，使之破壞。作為另一種選擇，如果肽-mhc靶標(biāo)參與誘導(dǎo)自身免疫性，則這些抗體可用于阻斷自身免疫t細(xì)胞的激活，從而緩解疾病的癥狀。另外，從本文所述car小鼠的免疫接種獲得的嵌合人car克隆可用于例如引入到從人患者獲得的t細(xì)胞中，從而實(shí)現(xiàn)適應(yīng)性t細(xì)胞轉(zhuǎn)移。

參考引用

特此將本文提及的所有出版物、專(zhuān)利和專(zhuān)利申請(qǐng)以引用的方式全文并入，就如同明確且獨(dú)立地指明將每篇單獨(dú)的出版物、專(zhuān)利或?qū)＠暾?qǐng)以引用的方式并入。在發(fā)生沖突的情況下，以本專(zhuān)利申請(qǐng)(包括本文中的任何定義)為準(zhǔn)。

等同方案

本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到或者僅僅利用常規(guī)實(shí)驗(yàn)就能夠確定本文所述的本發(fā)明的具體實(shí)施例的許多等同方案。這些等同方案旨在包括在以下權(quán)利要求中。

序列表

<110>雷杰納榮制藥公司(regeneronpharmaceuticals,inc.)

<120>嵌合抗原受體

<130>rpb-010.25

<140>

<141>

<150>62/167,650

<151>2015-05-28

<150>62/094,603

<151>2014-12-19

<150>62/076,836

<151>2014-11-07

<150>62/052,947

<151>2014-09-19

<150>62/052,901

<151>2014-09-19

<160>155

<170>patentin版本3.5

<210>1

<211>11

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成肽”

<400>1

serleuleumettrpilethrglnvalasntyr

1510

<210>2

<211>9

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成肽”

<400>2

glualaaspprothrglyhissertyr

15

<210>3

<211>100

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成多核苷酸”

<400>3

atggagtagtcagaacacactcttcagaagggactcctgatttcaaaggggggtaccggg60

ccccccctcgagaagttcctattccgaagttcctattctc100

<210>4

<211>100

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成多核苷酸”

<400>4

tccgaagttcctattctctagaaagtataggaacttcctagggcgatcgcgtgcatggca60

ctgacataggccattgttaacagggtcccagcagctggtc100

<210>5

<211>124

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成多核苷酸”

<400>5

gataaattattttgtcagacaacaataaaaatcaatagcacgccctaagagcggccgcca60

ccgcggtggagctcaggtttccggtacttaacaacagagcacagatttagtggtgaggga120

ctct124

<210>6

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成引物”

<400>6

ggtggagaggctattcggc19

<210>7

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成探針”

<400>7

tgggcacaacagacaatcggctg23

<210>8

<211>17

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成引物”

<400>8

gaacacggcggcatcag17

<210>9

<211>17

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成引物”

<400>9

tgcggccgatcttagcc17

<210>10

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成探針”

<400>10

acgagcgggttcggcccattc21

<210>11

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成引物”

<400>11

ttgaccgattccttgcgg18

<210>12

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成引物”

<400>12

gtcaagcactgctggcacac20

<210>13

<211>33

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成探針”

<400>13

aacccttgtgctattgaattgctatgctgtcag33

<210>14

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成引物”

<400>14

tgttgtagaccctccgccac20

<210>15

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成引物”

<400>15

ccccgtcctcctcctttttc20

<210>16

<211>32

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成探針”

<400>16

tcatgtccattaacccatttaccttttgccca32

<210>17

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成引物”

<400>17

tgcaagtgctgccagcaag19

<210>18

<211>27

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成引物”

<400>18

cagtaagggaagagactacaacagcat27

<210>19

<211>27

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成探針”

<400>19

tgcacactgctcaccactgcaagctat27

<210>20

<211>17

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成引物”

<400>20

tgctggtggccccatct17

<210>21

<211>28

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成引物”

<400>21

gaactcagctatgatagtgtcgaatgta28

<210>22

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成探針”

<400>22

cagcccagcagctgtgggttctc23

<210>23

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成引物”

<400>23

gctcagggagaacacagaacttaga25

<210>24

<211>42

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成寡核苷酸”

<400>24

tgcgatcgctgcggccgatcttagccagacgagcgggttcgg42

<210>25

<211>17

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成引物”

<400>25

tgcggccgatcttagcc17

<210>26

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成探針”

<400>26

acgagcgggttcggcccattc21

<210>27

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成引物”

<400>27

ttgaccgattccttgcgg18

<210>28

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成引物”

<400>28

cgacgtctgtcgagaagtttctg23

<210>29

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成探針”

<400>29

agttcgacagcgtgtccgacctga24

<210>30

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成引物”

<400>30

cacgccctcctacatcgaa19

<210>31

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成引物”

<400>31

tgtcgggcgtacacaaatcg20

<210>32

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成探針”

<400>32

ccgtctggaccgatggctgtgt22

<210>33

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成引物”

<400>33

gggcgtcggtttccactatc20

<210>34

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成引物”

<400>34

caaatggaagtagcacgtctcact24

<210>35

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成探針”

<400>35

ctcgtgcagatggacagcaccgc23

<210>36

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成引物”

<400>36

ccgctgccccaaagg15

<210>37

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成引物”

<400>37

gtcaagcactgctggcacac20

<210>38

<211>33

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成探針”

<400>38

aacccttgtgctattgaattgctatgctgtcag33

<210>39

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成引物”

<400>39

tgttgtagaccctccgccac20

<210>40

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成引物”

<400>40

ttgcctttctcacacctgcag21

<210>41

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成探針”

<400>41

cagcccatcctgtcacttcgctgga25

<210>42

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成引物”

<400>42

tggcccaacagtacagctcag21

<210>43

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成引物”

<400>43

tcagtcaatcacctttcccagc22

<210>44

<211>28

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成探針”

<400>44

tccccaggtagcctcatgaaccaatgtt28

<210>45

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成引物”

<400>45

cacattactgagtccccacaggg23

<210>46

<211>32

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成探針”

<400>46

accattgcagtttacccacggttaggattttt32

<210>47

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成引物”

<400>47

tcttgcaatgggatcatcagatg23

<210>48

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成引物”

<400>48

ggtggagaggctattcggc19

<210>49

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成探針”

<400>49

tgggcacaacagacaatcggctg23

<210>50

<211>17

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成引物”

<400>50

gaacacggcggcatcag17

<210>51

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成引物”

<400>51

gttcaggccccacagactctc21

<210>52

<211>29

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成探針”

<400>52

tcctctctggagcaaccatgaagttccct29

<210>53

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成引物”

<400>53

cctgaagccatgagggcag19

<210>54

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成引物”

<400>54

agggtaggctctcctgaatcg21

<210>55

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成探針”

<400>55

acaggcgccggacctctggt20

<210>56

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成引物”

<400>56

ccaaagaaactgacgcctcac21

<210>57

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成引物”

<400>57

gcgccacatgaatttgaccag21

<210>58

<211>28

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成探針”

<400>58

tgtacccaatcttccaaagaaagagctg28

<210>59

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成引物”

<400>59

ggcatcctgtcctcccttc19

<210>60

<211>27

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成引物”

<400>60

cagtaagggaagagactacaacagcat27

<210>61

<211>27

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成探針”

<400>61

tgcacactgctcaccactgcaagctat27

<210>62

<211>17

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成引物”

<400>62

tgctggtggccccatct17

<210>63

<211>28

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成引物”

<400>63

gaactcagctatgatagtgtcgaatgta28

<210>64

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成探針”

<400>64

cagcccagcagctgtgggttctc23

<210>65

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成引物”

<400>65

gctcagggagaacacagaacttaga25

<210>66

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成引物”

<400>66

ccccgtcctcctcctttttc20

<210>67

<211>32

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成探針”

<400>67

tcatgtccattaacccatttaccttttgccca32

<210>68

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成引物”

<400>68

tgcaagtgctgccagcaag19

<210>69

<211>156

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成多核苷酸”

<400>69

gtcttttttgttcttcacagttgagcttcatcaaagtcacatgggttaaactctatggag60

tagtcagaacacactcttcagaagggactcctgatttcaaagggtaccgaagttcctatt120

ccgaagttcctattctctagaaagtataggaacttc156

<210>70

<211>132

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成多核苷酸”

<400>70

gaagttcctattccgaagttcctattctctagaaagtataggaacttcctagggtttcac60

cggtggcgcgcctaacagagaggaaagtcaaattataaagaatatgagattcagaattct120

gattaactgtgg132

<210>71

<211>28

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成引物”

<400>71

cgattatgactggttaggtagaaaggtg28

<210>72

<211>32

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成探針”

<400>72

gccactggtttctccaaatgttttcaatccat32

<210>73

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成引物”

<400>73

gggagtacttggagatccctaagc24

<210>74

<211>136

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成多核苷酸”

<400>74

ttgagcttcatcaaagtcacatgggttaaactctatggagtagtcagaacacactcttca60

gaagggactcctgatttcaaagggtaccgaagttcctattccgaagttcctattctctag120

aaagtataggaacttc136

<210>75

<211>132

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成多核苷酸”

<400>75

gaagttcctattccgaagttcctattctctagaaagtataggaacttcctagggtttcac60

cggtggcgcgccaggacccaggctctgacactcaggctgccaatacaattgccatgaaga120

cagatgttgatg132

<210>76

<211>42

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成寡核苷酸”

<400>76

tgcgatcgctgcggccgatcttagccagacgagcgggttcgg42

<210>77

<211>17

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成引物”

<400>77

tgcggccgatcttagcc17

<210>78

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成探針”

<400>78

acgagcgggttcggcccattc21

<210>79

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成引物”

<400>79

ttgaccgattccttgcgg18

<210>80

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成引物”

<400>80

cgacgtctgtcgagaagtttctg23

<210>81

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成探針”

<400>81

agttcgacagcgtgtccgacctga24

<210>82

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成引物”

<400>82

cacgccctcctacatcgaa19

<210>83

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成引物”

<400>83

tgtcgggcgtacacaaatcg20

<210>84

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成探針”

<400>84

ccgtctggaccgatggctgtgt22

<210>85

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成引物”

<400>85

gggcgtcggtttccactatc20

<210>86

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成引物”

<400>86

gtcaagcactgctggcacac20

<210>87

<211>33

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成探針”

<400>87

aacccttgtgctattgaattgctatgctgtcag33

<210>88

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成引物”

<400>88

tgttgtagaccctccgccac20

<210>89

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成引物”

<400>89

ttgcctttctcacacctgcag21

<210>90

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成探針”

<400>90

cagcccatcctgtcacttcgctgga25

<210>91

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成引物”

<400>91

tggcccaacagtacagctcag21

<210>92

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成引物”

<400>92

tcagtcaatcacctttcccagc22

<210>93

<211>28

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成探針”

<400>93

tccccaggtagcctcatgaaccaatgtt28

<210>94

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成引物”

<400>94

cacattactgagtccccacaggg23

<210>95

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成引物”

<400>95

cattgtcaaagaagcactggaaatg25

<210>96

<211>32

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成探針”

<400>96

accattgcagtttacccacggttaggattttt32

<210>97

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成引物”

<400>97

tcttgcaatgggatcatcagatg23

<210>98

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成引物”

<400>98

ggtggagaggctattcggc19

<210>99

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成探針”

<400>99

tgggcacaacagacaatcggctg23

<210>100

<211>17

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成引物”

<400>100

gaacacggcggcatcag17

<210>101

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成引物”

<400>101

caggtgcaaaggtgaccacag21

<210>102

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成探針”

<400>102

tgggtcctgcccatccatgca21

<210>103

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成引物”

<400>103

ggcagcctgagtgtcagagc20

<210>104

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成引物”

<400>104

gttcaggccccacagactctc21

<210>105

<211>29

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成探針”

<400>105

tcctctctggagcaaccatgaagttccct29

<210>106

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成引物”

<400>106

cctgaagccatgagggcag19

<210>107

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成引物”

<400>107

gcgccacatgaatttgaccag21

<210>108

<211>28

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成探針”

<400>108

tgtacccaatcttccaaagaaagagctg28

<210>109

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成引物”

<400>109

ggcatcctgtcctcccttc19

<210>110

<211>27

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成引物”

<400>110

cagtaagggaagagactacaacagcat27

<210>111

<211>27

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成探針”

<400>111

tgcacactgctcaccactgcaagctat27

<210>112

<211>17

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成引物”

<400>112

tgctggtggccccatct17

<210>113

<211>28

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成引物”

<400>113

gaactcagctatgatagtgtcgaatgta28

<210>114

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成探針”

<400>114

cagcccagcagctgtgggttctc23

<210>115

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成引物”

<400>115

gctcagggagaacacagaacttaga25

<210>116

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成引物”

<400>116

ccccgtcctcctcctttttc20

<210>117

<211>32

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成探針”

<400>117

tcatgtccattaacccatttaccttttgccca32

<210>118

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成引物”

<400>118

tgcaagtgctgccagcaag19

<210>119

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成引物”

<400>119

tggctccaagaacagtttgcc21

<210>120

<211>28

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成探針”

<400>120

ccctgactttgctgctcaactcacagcc28

<210>121

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成引物”

<400>121

ggtccagtggaatctgccatg21

<210>122

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成引物”

<400>122

catttggctacatatcaaagccg23

<210>123

<211>27

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成探針”

<400>123

cctgagccagggaacagcccactgata27

<210>124

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成引物”

<400>124

acatggctgaggcagacacc20

<210>125

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成引物”

<400>125

tgggccgttatgctagtacca21

<210>126

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成探針”

<400>126

tggctttaccccttttgaagggccc25

<210>127

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成引物”

<400>127

cacagctgaagcaggatgagc21

<210>128

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成引物”

<400>128

tctctgagcagccatcccc19

<210>129

<211>27

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成探針”

<400>129

ttctcctttggtgtagagggcaccagc27

<210>130

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成引物”

<400>130

accaggcatggcagaaagg19

<210>131

<211>156

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成多核苷酸”

<400>131

gtcttttttgttcttcacagttgagcttcatcaaagtcacatgggttaaactctatggag60

tagtcagaacacactcttcagaagggactcctgatttcaaagggtaccgaagttcctatt120

ccgaagttcctattctctagaaagtataggaacttc156

<210>132

<211>130

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成多核苷酸”

<400>132

gaagttcctattccgaagttcctattctctagaaagtataggaacttcctagggtttcac60

cggtggcgcgcctgagtagtgctttaggtgtgtaatcaccaaagatttagtgaagtccct120

gtgcaaggag130

<210>133

<211>119

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成多核苷酸”

<400>133

ataataattaataataataaatagtaaatttctgtagaatcataatgaggtctagacccc60

cgggctcgataactataacggtcctaaggtagcggtaccgaagttcctattccgaagtt119

<210>134

<211>100

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成多核苷酸”

<400>134

tctagaaagtataggaacttcctagggtttcaccggtggcgcgccgagctttctggttca60

gccagggacacagaaccaggaagacatcgtggcttttcta100

<210>135

<211>106

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成多核苷酸”

<400>135

ctttggaaaatgggactcaggttgggtgcgtctgatggagtaactgagcctctagactga60

gcattgcagactaatcttggatatttgtccctgagggagccggctg106

<210>136

<211>152

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成多核苷酸”

<400>136

aaacttcttaaaattactctattattcttccctctgattattggtctccactcgagtgcc60

atttcattacctctttctccgcacccgacatagataaagcttggagacagctctcaactt120

caccctttctgggggagcgggatgaaaaggga152

<210>137

<211>100

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成多核苷酸”

<400>137

gggggggtggggtggaggaggagggtacagcatctcctctccttcctctctggtaccgaa60

gttcctattccgaagttcctattctctagaaagtatagga100

<210>138

<211>100

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成多核苷酸”

<400>138

tattctctagaaagtataggaacttcctagggtttcaccggtgcgatcgcatatccatgt60

gtgtccattctggttcagccagggacacagaaccaggaag100

<210>139

<211>108

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成多核苷酸”

<400>139

caggcttgcagtcctgggcagactccgtcacctctctatgcctcagccttggcgcgcctt60

tcaaattgttgttgagttcaaagtgggcaacagaaaagggggtgtgag108

<210>140

<211>200

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成多核苷酸”

<400>140

aataattaataataataaatagtaaatttctgtagaatcataatgaggtctagacccccg60

ggctcgataactataacggtcctaaggtagcgaaccggtataacttcgtataaggtatcc120

tatacgaagttatctcgagggggggcccggtaccgattcaatgtccacacccggggctgg180

agcgtagccatgagccacgc200

<210>141

<211>106

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成多核苷酸”

<400>141

ctttggaaaatgggactcaggttgggtgcgtctgatggagtaactgagcctctagactga60

gcattgcagactaatcttggatatttgtccctgagggagccggctg106

<210>142

<211>152

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成多核苷酸”

<400>142

aaacttcttaaaattactctattattcttccctctgattattggtctccactcgagtgcc60

atttcattacctctttctccgcacccgacatagataaagcttggagacagctctcaactt120

caccctttctgggggagcgggatgaaaaggga152

<210>143

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成引物”

<400>143

tcaaagtcggtgaacaggcagag23

<210>144

<211>30

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成寡核苷酸”

<400>144

cccatgtactctgcgttgataccactgctt30

<210>145

<211>57

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成引物”

<400>145

gtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatctaagcagtggtatcaacgcagagt57

<210>146

<211>57

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成引物”

<400>146

acactctttccctacacgacgctcttccgatctacagcaggttctgggttctggatg57

<210>147

<211>67

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成引物”

<220>

<221>修飾的堿基

<222>(30)..(35)

<223>a、c、t、g、未知或其他

<400>147

aatgatacggcgaccaccgagatctacacnnnnnnacactctttccctacacgacgctct60

tccgatc67

<210>148

<211>63

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成引物”

<220>

<221>修飾的堿基

<222>(25)..(29)

<223>a、c、t、g、未知或其他

<400>148

caagcagaagacggcatacgagatnnnnngtgactggagttcagacgtgtgctcttccga60

tct63

<210>149

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成引物”

<400>149

cgagggtagccttttgtttgtttgc25

<210>150

<211>30

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成寡核苷酸”

<400>150

cccatgtactctgcgttgataccactgctt30

<210>151

<211>58

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成引物”

<400>151

acactctttccctacacgacgctcttccgatctgaccttgggtggagtcacatttctc58

<210>152

<211>57

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成引物”

<400>152

gtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatctaagcagtggtatcaacgcagagt57

<210>153

<211>68

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成引物”

<220>

<221>修飾的堿基

<222>(30)..(35)

<223>a、c、t、g、未知或其他

<400>153

aatgatacggcgaccaccgagatctacacnnnnnnacactctttccctacacgacgctct60

tccgatct68

<210>154

<211>64

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成引物”

<220>

<221>修飾的堿基

<222>(25)..(30)

<223>a、c、t、g、未知或其他

<400>154

caagcagaagacggcatacgagatnnnnnngtgactggagttcagacgtgtgctcttccg60

atct64

<210>155

<211>4

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<221>來(lái)源

<223>/注釋“人工序列的說(shuō)明：合

成肽”

<400>155

serglysergly

1