本發(fā)明的主要應(yīng)用在農(nóng)業(yè)方面。本發(fā)明的細(xì)菌以及由所述細(xì)菌產(chǎn)生的產(chǎn)物可用作植物生長(zhǎng)刺激劑以及用于控制諸如細(xì)菌、昆蟲(chóng)、真菌和線蟲(chóng)等植物病原體。

背景技術(shù)：

1.植物病原生物體

植物病原生物體是植物的疾病的重要成因；其決定著植物的形狀、功能或完整性的變化并可導(dǎo)致植物死亡。線蟲(chóng)、細(xì)菌、昆蟲(chóng)、真菌和病毒被包括在這類植物病原生物體中。

最重要的一類是植物病原真菌，其特別包括以下屬的物種：葡萄孢屬(Botrytis)、腐霉屬(Pythium)、鏈格孢屬(Alternaria)、鐮孢菌屬(Fusarium)、疫霉屬(Phytophthora)、絲核菌屬(Rhizoctonia)、刺盤(pán)孢屬(Colleotrichium)、彎孢殼屬(Eutypa)、根霉屬(Rhizopus)、青霉屬(Penicillium)、核盤(pán)菌屬(Sclerotinia)和輪枝孢屬(Verticillium)。其會(huì)導(dǎo)致如葉斑、組織增生或黑穗病等局部損傷或者當(dāng)其影響根或維管系統(tǒng)時(shí)導(dǎo)致廣泛損傷，使得植物枯萎和死亡。存在超過(guò)8000種侵襲植物的物種，其中一些極具特異性，而另外一些則具有廣泛的宿主。這些生物體所造成的經(jīng)濟(jì)影響極為重大。舉例而言，當(dāng)灰葡萄孢(Botrytis cinnerea)影響葡萄園時(shí)，在釀酒工業(yè)中會(huì)產(chǎn)生上千噸廢物。

由細(xì)菌所導(dǎo)致的植物疾病比由真菌或病毒所致的植物疾病的發(fā)生率更低(Vidhyasekaran 2002)。植物病原細(xì)菌包括：解淀粉歐文氏菌(Erwinia amylovora)，其導(dǎo)致稱作火疫病的疾病，特別是影響梨樹(shù)、蘋(píng)果樹(shù)、歐楂樹(shù)、柑橘樹(shù)和觀賞薔薇科；胡蘿卜軟腐歐文氏菌(Erwinia carotovora)(Pectobacterium carotovorum)，軟腐病元兇；青枯雷爾氏菌(Ralstonia solanacearum)，其導(dǎo)致種植茄科以及超過(guò)50個(gè)科的植物的腐爛和枯萎；不同的丁香假單胞菌(Pseudomonas syringae)致病變種，其導(dǎo)致斑點(diǎn)、灼傷和潰爛；根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)，一種導(dǎo)致在珠托(collar)、根部和較不常見(jiàn)在莖部的腫瘤的細(xì)菌，并且具有包括超過(guò)700個(gè)物種在內(nèi)的寬客體譜；和野油菜黃單胞菌(Xanthomonas campestris)，其特別是導(dǎo)致植物中的斑點(diǎn)和灼傷。

線蟲(chóng)在農(nóng)業(yè)中也極為重要。其是尺寸為0.2mm至1mm的微型蟲(chóng)，在其上部具有刺用于從植物進(jìn)食。幼蟲(chóng)從植物與潮濕土壤接觸的任何部分進(jìn)入，但主要通過(guò)吸收根毛的尖端進(jìn)入，因其刺不夠有力。一旦其駐留于組織中，其既不移動(dòng)也不改變位置。癥狀表現(xiàn)為出現(xiàn)典型根瘤或根部變粗。這種損傷導(dǎo)致維管阻塞并阻止通過(guò)根的吸收，這轉(zhuǎn)化為植物發(fā)育緩慢以及枯萎、缺綠癥和生長(zhǎng)遏制的癥狀。植物病原線蟲(chóng)包括根結(jié)線蟲(chóng)屬、孢囊線蟲(chóng)屬、穿孔線蟲(chóng)屬和根腐線蟲(chóng)屬的物種。

昆蟲(chóng)害蟲(chóng)也是植物中的重要問(wèn)題。在某些情況下，其是細(xì)菌和/或病毒感染載體。在其它情況下，其可能令植物虛弱，甚至中斷其生長(zhǎng)和發(fā)育，而控制或消除昆蟲(chóng)害蟲(chóng)極為復(fù)雜。在鉆孔甲蟲(chóng)的情形中即是如此，其割透樹(shù)皮而到達(dá)下方以筑成其通道，雌蟲(chóng)在通道內(nèi)產(chǎn)卵；或橄欖薊馬，其通過(guò)食取芽、葉、花、果實(shí)和嫩苗而吸取植物的汁液，同時(shí)將毒素注入植物，阻斷其生長(zhǎng)并使受影響的器官變形。另一個(gè)實(shí)例是粉虱，其吸取汁液直至葉開(kāi)始顯示出黃色斑駁斑點(diǎn)并最終干枯。此外，這種昆蟲(chóng)制造的分泌物有利于真菌增殖。導(dǎo)致植物損傷的主要昆蟲(chóng)的其它實(shí)例有蚜蟲(chóng)、切葉蟻、介殼蟲(chóng)、鋸蠅、天竺葵蛾(geranium bronzes)、花金龜子等。

2.植物病原體控制

為了控制上述植物病原體并增加作物產(chǎn)率，通常使用化學(xué)品，這些化學(xué)品在某些情況中具有高的關(guān)聯(lián)毒性，這對(duì)環(huán)境造成負(fù)面影響。水和土壤均受到污染；如授粉昆蟲(chóng)等作為農(nóng)業(yè)根本的生命體受到毀滅，且動(dòng)物和人類健康受到影響。2009年10月21日的歐洲議會(huì)和理事會(huì)的2009/128/EC指令確立了實(shí)現(xiàn)所述化合物的可持續(xù)利用的行動(dòng)框架并強(qiáng)調(diào)了開(kāi)始增加農(nóng)業(yè)生產(chǎn)力和資源效率的生態(tài)學(xué)可持續(xù)創(chuàng)新行動(dòng)的優(yōu)先區(qū)域。

化學(xué)品在農(nóng)業(yè)中的無(wú)差別使用的替代方案是使用有益微生物，包括真菌和細(xì)菌。這是一種可顯著減少使病原體變得具有抗性的風(fēng)險(xiǎn)的非污染性的環(huán)境友好型方法。

2.1植物促生根際細(xì)菌(PGPR)

根際細(xì)菌(rhizobacteria)是土壤中生長(zhǎng)于根部附近的微生物，其還廣泛用于生物控制。由于這些細(xì)菌在自然中最常見(jiàn)于根際，其通常不會(huì)損害其它有益生物體，而且在許多情況下其通過(guò)刺激植物生長(zhǎng)并使農(nóng)業(yè)生產(chǎn)更為可持續(xù)而有益于生態(tài)系統(tǒng)。反過(guò)來(lái)，其對(duì)人類健康的影響極小或沒(méi)有影響。這些也稱為植物促生根際細(xì)菌或PGPR的微生物拓殖于植物根部，與植物病原體競(jìng)爭(zhēng)并對(duì)其進(jìn)行控制，并充當(dāng)肥料。

PGPR的特征在于其通過(guò)直接或間接機(jī)制刺激植物生長(zhǎng)的能力。直接刺激包括：固氮(Sessitsch等，2002)；激素生成，例如增加根的伸長(zhǎng)、分生和尺寸的生長(zhǎng)素、赤霉素和細(xì)胞分裂素(Perrine等，2004；García de Salamone等，2001)；磷酸鹽溶解(Rodríguez和Fraga,1999)；和嗜鐵素分泌(Carson等，2000)等。間接植物生長(zhǎng)刺激包括涉及對(duì)植物病原生物體(細(xì)菌、真菌和線蟲(chóng)等)進(jìn)行生物控制的各種機(jī)制，包括：競(jìng)爭(zhēng)生態(tài)位或基質(zhì)；生成水解性酶(蛋白酶、脂酶、幾丁質(zhì)酶、膠原蛋白酶和葡聚糖酶)；生成抗生素(Hassan等，1997；Essalmani和Lahlou,2003)；根部拓殖，將其轉(zhuǎn)化為減慢線蟲(chóng)侵襲的“生物殼罩”(Rodríguez-Kábana 1997；Loeppler 1997)；根滲出物改性，使其更不吸引線蟲(chóng)(Oostendorp和Sikora,1990)；產(chǎn)生嗜鐵素以及由某些PGPR產(chǎn)生揮發(fā)性化合物(例如，乙偶姻和2,3-丁二醇)，這導(dǎo)致植物對(duì)感染的抗性增加(也稱為誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性或ISR)(Choudhary和Johri 2009)；以及產(chǎn)生阻止線蟲(chóng)發(fā)育的H₂S(Mena 2004和2005)。

通過(guò)所有上述機(jī)制，在土壤中給定的濃度(要求至少10⁶個(gè)微生物/ml)下，PGPR不僅充當(dāng)植物生長(zhǎng)刺激劑(植物強(qiáng)化劑或植物肥料)，還充當(dāng)生物控制劑，從而防止植物病原細(xì)菌、真菌和線蟲(chóng)的發(fā)展。

在最廣泛使用的PGPR細(xì)菌中有節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)、固氮螺菌屬(Azospirillum)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、根瘤菌屬(Rhizobium)和沙雷氏菌屬(Serratia)等屬的物種(Kloepper等2004)。其它諸如微變冢村氏菌(Tsukamurelia paurometabola)等也得以使用，例如在生物殺線蟲(chóng)劑中，其可有效控制根結(jié)線蟲(chóng)屬(Meloidogyne)物種、香蕉穿孔線蟲(chóng)(Radopholus similis)和根腐線蟲(chóng)屬(Pratylenchus)物種。其作用模式與釋放硫化氫和幾丁質(zhì)酶有關(guān)(Mena 2004和2005)。

2.1.1芽孢桿菌屬的細(xì)菌

農(nóng)業(yè)中在控制病原體方面或作為PGPR最為廣泛使用的細(xì)菌之一是芽孢桿菌屬的細(xì)菌。

來(lái)自該屬的細(xì)菌具有許多上述特性，且另一方面孢子形成提供了該屬在商業(yè)制備物中的長(zhǎng)期生活力，這不同于如假單胞菌屬、根瘤菌屬或沙雷氏菌屬等其它根際細(xì)菌。

市場(chǎng)上存在芽孢桿菌屬的各種商業(yè)產(chǎn)品。這包括特別是：

描述芽孢桿菌屬的微生物在生物控制中的應(yīng)用的其它專利/專利申請(qǐng)有：

·貝萊斯芽孢桿菌菌株作為生物殺真菌劑(US 2010/0179060A1)

·短小芽孢桿菌菌株作為殺線蟲(chóng)劑(WO 2013/067275)

·短小芽孢桿菌菌株作為殺昆蟲(chóng)劑(WO2010146204)

·蘇云金芽孢桿菌菌株作為殺線蟲(chóng)劑(WO 2010/078708A1,US 6077506)

·蘇云金芽孢桿菌菌株、其基因和毒素作為殺線蟲(chóng)劑(EP 0853671)

·枯草芽孢桿菌、惡臭假單胞菌和玫紅擲孢酵母的三種菌株用于控制植物病原體(WO 2004/024865A2)

·具有殺真菌和殺細(xì)菌效果的芽孢桿菌屬和副短短芽孢桿菌的幾種菌株(WO 2010/142055)

在以下專利/專利申請(qǐng)中描述了用作PGPR或用于生物控制的其它細(xì)菌：

·沙雷氏菌屬菌株用于控制病原體(CA2822178A1).

·蘇云金芽孢桿菌、莫海威芽孢桿菌和固氮螺菌的三種菌株作為植物生長(zhǎng)刺激劑和生物殺線蟲(chóng)劑(WO2011121408A1)

·含有不同假單胞菌屬菌株的制備物作為植物生長(zhǎng)刺激劑及生物控制劑(US6048713A)

·食酸戴爾福特菌的硫氧化性和植物生長(zhǎng)促進(jìn)性培養(yǎng)物(US20080242543A1)

·促進(jìn)植物生長(zhǎng)的根瘤菌(WO2003089640A2)

·Shan等(Crop Protection 44(2013),29-37)描述了甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌(Bacillus methylotrophicus)菌株BC79對(duì)水稻疾病(也稱作稻瘟病，由真菌稻瘟病菌導(dǎo)致)進(jìn)行生物控制方面的應(yīng)用。

·Madhaiyan等(International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology(2010),60,2490-2495)描述了分離自水稻根際的甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌物種。

·Khusro等(Indian Journal of Research(2013)，第2卷，第11期，第243-244頁(yè))描述了用于增加抗微生物代謝物生產(chǎn)的新型甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌菌株的改進(jìn)。

雖然對(duì)發(fā)展植物生長(zhǎng)刺激策略和/或?qū)?xì)菌、真菌和/或植物病原線蟲(chóng)進(jìn)行生物控制的策略有諸多嘗試，迄今仍迫切需要發(fā)展現(xiàn)存的那些策略的替代策略或更好的策略，這些策略能夠刺激植物生長(zhǎng)和/或在生物學(xué)上控制諸如細(xì)菌、真菌和/或線蟲(chóng)等植物病原體的存在。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明涉及微生物作為植物生長(zhǎng)刺激劑和/或用于對(duì)植物病原細(xì)菌、昆蟲(chóng)、真菌和/或線蟲(chóng)進(jìn)行生物控制的應(yīng)用。更具體地，本發(fā)明涉及作為植物生長(zhǎng)刺激劑和/或用于對(duì)如細(xì)菌、昆蟲(chóng)、真菌和/或線蟲(chóng)等植物病原體進(jìn)行生物控制的物種甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌(Bacillus methylotrophicus)的微生物的應(yīng)用、對(duì)于所述微生物的不同培養(yǎng)方法以及包含其的產(chǎn)品。優(yōu)選地，本發(fā)明涉及用于對(duì)如細(xì)菌、昆蟲(chóng)、線蟲(chóng)和植物病原真菌等植物病原體進(jìn)行生物控制的物種甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌的微生物的應(yīng)用、不同培養(yǎng)方法以及包含其的產(chǎn)品。

在特定實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及作為植物生長(zhǎng)刺激劑和用于對(duì)如植物病原細(xì)菌、昆蟲(chóng)、真菌和/或線蟲(chóng)等植物病原體進(jìn)行生物控制的物種甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌的微生物的應(yīng)用、對(duì)于所述微生物的不同培養(yǎng)方法以及包含其的產(chǎn)品。優(yōu)選地，本發(fā)明涉及用于對(duì)如植物病原細(xì)菌、植物病原線蟲(chóng)、植物病原昆蟲(chóng)和植物病原真菌(除屬于物種稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)的真菌以外)進(jìn)行生物控制的物種甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌的微生物的應(yīng)用、不同培養(yǎng)方法以及包含其的產(chǎn)品。

優(yōu)選地，本發(fā)明涉及用于對(duì)以下細(xì)菌、昆蟲(chóng)、真菌和/或線蟲(chóng)進(jìn)行生物控制的物種甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌的微生物的應(yīng)用、不同培養(yǎng)方法和包含其的產(chǎn)品：所述細(xì)菌例如為屬于物種根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)、黑腐果膠桿菌(Pectobacterium atrosepticum)、青枯雷爾氏菌(Ralstonia solanacearum)和野油菜黃單胞菌(Xanthomonas campestris)的那些細(xì)菌；所述真菌例如粉孢子(oidium)、葡萄孢屬(Botrytis)，或?qū)儆谖锓N鏈格孢菌(Alternaria alternata)、黑曲霉(Aspergillus niger)、灰葡萄孢(Botrytis cynerea)、尖孢鐮孢菌(Fusarium oxysporum)、惡疫霉菌(Phytophthora cactorum)、樟疫霉菌(Phytophthora cinnamomi)、米根霉(Rhizopus oryzae)、核盤(pán)菌(Sclerotinia sclerotiorum)、水稻紋枯病菌(Thanatephorus cucumeris)和棉花黃萎病菌(Verticillium dahlia)的那些真菌；所述昆蟲(chóng)例如粉虱和蚜蟲(chóng)；所述線蟲(chóng)例如屬于根結(jié)線蟲(chóng)屬(Meloidogyne)、孢囊線蟲(chóng)屬(Heterodera)、黃金線蟲(chóng)屬(Globodera)、根腐線蟲(chóng)屬(Pratylenchus)、針線蟲(chóng)屬(Paratylenchus)、短體線蟲(chóng)屬(Ratylenchus)、劍線蟲(chóng)屬(Xiphinema)、毛刺線蟲(chóng)屬(Trichodorus)的物種，以及大致所有寄生植物線蟲(chóng)。

本發(fā)明的另一個(gè)目的涉及屬于甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌菌株XT1(保藏號(hào)CECT8661)的微生物，該菌株由格拉納達(dá)大學(xué)于2014年4月23日保藏在西班牙典型培養(yǎng)物保藏中心(CECT—Spanish Type Culture Collection)，和/或與菌株XT1具有高度同源性的微生物，其中基于DNA序列的所有核苷酸的同一性，所述與菌株XT1具有高度同源性的微生物的16S rRNA基因DNA序列與菌株XT1的16S rRNA基因DNA序列具有至少99.6％、99.7％、99.8％或99.9％的同一性；和/或?qū)儆诩谆鶢I(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌菌株XT2(保藏號(hào)CECT8662)的微生物，該菌株由格拉納達(dá)大學(xué)于2014年4月23日保藏在西班牙典型培養(yǎng)物保藏中心(CECT)，和/或與菌株XT2具有高度同源性的微生物，其中基于DNA序列的所有核苷酸的同一性，所述與菌株XT2具有高度同源性的微生物的16S rRNA基因DNA序列與菌株XT2的16S rRNA基因DNA序列具有至少99.6％、99.7％、99.8％或99.9％的同一性。

本發(fā)明的另一個(gè)目的在于包含以下微生物或由其組成的細(xì)菌培養(yǎng)物：屬于甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌菌株XT1的微生物和/或與菌株XT1具有高度同源性的微生物，其中基于DNA序列的所有核苷酸的同一性，所述與菌株XT1具有高度同源性的微生物的16S rRNA基因DNA序列與菌株XT1的16S rRNA基因DNA序列具有至少99.6％、99.7％、99.8％或99.9％的同一性；和/或?qū)儆诩谆鶢I(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌菌株XT2的微生物和/或與菌株XT2具有高度同源性的微生物，其中基于DNA序列的所有核苷酸的同一性，所述與菌株XT2具有高度同源性的微生物的16S rRNA基因DNA序列與菌株XT2的16S rRNA基因DNA序列具有至少99.6％、99.7％、99.8％或99.9％的同一性。

本發(fā)明的另一個(gè)目的涉及包含以下微生物的組合物：屬于甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌菌株XT1的微生物和/或與菌株XT1具有高度同源性的微生物，其中基于DNA序列的所有核苷酸的同一性，所述與菌株XT1具有高度同源性的微生物的16S rRNA基因DNA序列與菌株XT1的16S rRNA基因DNA序列具有至少99.6％、99.7％、99.8％或99.9％的同一性；和/或?qū)儆诩谆鶢I(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌菌株XT2的微生物和/或與菌株XT2具有高度同源性的微生物，其中基于DNA序列的所有核苷酸的同一性，所述與菌株XT2具有高度同源性的微生物的16S rRNA基因DNA序列與菌株XT2的16S rRNA基因DNA序列具有至少99.6％、99.7％、99.8％或99.9％的同一性。

本發(fā)明的另一個(gè)目的涉及如上所述的細(xì)菌、培養(yǎng)物和/或組合物在用于刺激植物生長(zhǎng)的方法和/或用于對(duì)植物病原生物體進(jìn)行生物控制的方法中的應(yīng)用。

更具體地，本發(fā)明的一個(gè)目的在于屬于菌株XT1或XT2的細(xì)菌(或如上所述與這些菌株具有高度同源性的那些微生物)、包含其的培養(yǎng)物或組合物、以及包含其中之一的產(chǎn)品或可以從它們或從其培養(yǎng)物獲得的產(chǎn)品作為植物生長(zhǎng)刺激劑和/或在對(duì)諸如細(xì)菌、昆蟲(chóng)、真菌和/或線蟲(chóng)的植物病原體進(jìn)行生物控制中的應(yīng)用。

更具體地，本發(fā)明的一個(gè)目的在于屬于菌株XT1或XT2的細(xì)菌(或如上所述與這些菌株具有高度同源性的那些微生物)、包含其的培養(yǎng)物或組合物、以及包含其中之一的產(chǎn)品或可以從它們或從其培養(yǎng)物獲得的產(chǎn)品作為植物生長(zhǎng)刺激劑和/或在對(duì)諸如真菌(除屬于物種稻瘟病菌的真菌以外)和/或線蟲(chóng)等植物病原體進(jìn)行生物控制中的應(yīng)用。

優(yōu)選地，屬于菌株XT1或XT2的細(xì)菌(或與這些菌株具有高度同源性的那些微生物)、包含其的培養(yǎng)物或組合物、以及包含其中之一的產(chǎn)品或可以從它們或從其培養(yǎng)物獲得的產(chǎn)品被用作植物生長(zhǎng)刺激劑和/或用于對(duì)植物病原體進(jìn)行生物控制，所述植物病原體選自包括以下物種或由其組成的列表：

屬于物種根癌農(nóng)桿菌、黑腐果膠桿菌、青枯雷爾氏菌和野油菜黃單胞菌的細(xì)菌；屬于物種鏈格孢菌、黑曲霉、灰葡萄孢、尖孢鐮孢菌、惡疫霉菌、樟疫霉菌、米根霉、核盤(pán)菌、水稻紋枯病菌和棉花黃萎病菌的真菌；屬于蚜科的昆蟲(chóng)，以及屬于通常稱為粉虱的物種的昆蟲(chóng)；和/或線蟲(chóng)，例如屬于根結(jié)線蟲(chóng)屬、孢囊線蟲(chóng)屬、黃金線蟲(chóng)屬、根腐線蟲(chóng)屬、針線蟲(chóng)屬、短體線蟲(chóng)屬、劍線蟲(chóng)屬和/或毛刺線蟲(chóng)屬的那些。

優(yōu)選地，屬于菌株XT1或XT2的細(xì)菌(或如上所述與這些菌株具有高度同源性的那些微生物)、包含其的培養(yǎng)物或組合物、以及包含其中之一的產(chǎn)品或可以從它們或從其培養(yǎng)物獲得的產(chǎn)品被用作植物生長(zhǎng)刺激劑和/或用于對(duì)線蟲(chóng)進(jìn)行生物控制，所述線蟲(chóng)優(yōu)選為屬于以下屬之一的線蟲(chóng)：根結(jié)線蟲(chóng)屬、孢囊線蟲(chóng)屬、黃金線蟲(chóng)屬、根腐線蟲(chóng)屬、針線蟲(chóng)屬、短體線蟲(chóng)屬、劍線蟲(chóng)屬和/或毛刺線蟲(chóng)屬。

優(yōu)選地，屬于菌株XT1或XT2的細(xì)菌(或如上所述與這些菌株具有高度同源性的那些微生物)、包含其的培養(yǎng)物或組合物、以及包含其中之一的產(chǎn)品或可以從它們或從其培養(yǎng)物獲得的產(chǎn)品被用作植物生長(zhǎng)刺激劑和/或用于對(duì)根癌農(nóng)桿菌、黑腐果膠桿菌、青枯雷爾氏菌和野油菜黃單胞菌進(jìn)行生物控制。

優(yōu)選地，屬于菌株XT1或XT2的細(xì)菌(或如上所述與這些菌株具有高度同源性的那些微生物)、包含其的培養(yǎng)物或組合物、以及包含其中之一的產(chǎn)品或可以從它們或從其培養(yǎng)物獲得的產(chǎn)品被用作植物生長(zhǎng)刺激劑和/或用于對(duì)真菌進(jìn)行生物控制，所述真菌屬于以下物種：鏈格孢菌、黑曲霉、灰葡萄孢、尖孢鐮孢菌、惡疫霉菌、樟疫霉菌、米根霉、核盤(pán)菌、水稻紋枯病菌和棉花黃萎病菌；進(jìn)而更優(yōu)選對(duì)灰葡萄孢進(jìn)行生物控制。

優(yōu)選地，屬于菌株XT1或XT2的細(xì)菌(或如上所述與這些菌株具有高度同源性的那些微生物)、包含其的培養(yǎng)物或組合物、以及包含其中之一的產(chǎn)品或可以從它們或從其培養(yǎng)物獲得的產(chǎn)品被用作植物生長(zhǎng)刺激劑和/或用于對(duì)以下物種進(jìn)行生物控制：屬于蚜科的昆蟲(chóng)以及屬于通常稱為“粉虱”的物種的昆蟲(chóng)，更具體地為主要存在于溫室中的物種溫室粉虱(Trialeurodes vaporariorum)。

本發(fā)明的另一個(gè)目的涉及用于刺激植物生長(zhǎng)的方法，其包括以下步驟：

a.獲得如前文所述的細(xì)菌、細(xì)菌培養(yǎng)物或組合物；和

b.將植物與步驟a中所獲得的細(xì)菌、細(xì)菌培養(yǎng)物或組合物接觸。

本發(fā)明的另一個(gè)目的涉及用于刺激植物生長(zhǎng)的方法，其包括以下步驟：

a.獲得如前文所述的細(xì)菌、細(xì)菌培養(yǎng)物或組合物；和

b.將受植物病原體影響的植物與步驟a中所獲得的細(xì)菌、細(xì)菌培養(yǎng)物或組合物接觸。

本發(fā)明的另一個(gè)目的涉及用于對(duì)植物病原生物體進(jìn)行生物控制的方法，其包括以下步驟：

a.獲得如前文所述的細(xì)菌、細(xì)菌培養(yǎng)物或組合物；和

b.將受植物病原體影響的植物與步驟a中所獲得的細(xì)菌、細(xì)菌培養(yǎng)物或組合物接觸。

本發(fā)明的另一個(gè)目的涉及用于對(duì)植物病原真菌進(jìn)行生物控制的方法，所述植物病原真菌屬于物種鏈格孢菌、黑曲霉、灰葡萄孢、尖孢鐮孢菌、惡疫霉菌、樟疫霉菌、米根霉、核盤(pán)菌、水稻紋枯病菌和棉花黃萎病菌，優(yōu)選屬于物種灰葡萄孢，所述方法包括以下步驟：

a.獲得如前文所述的細(xì)菌、細(xì)菌培養(yǎng)物或組合物；和

b.將受植物病原體影響的植物與步驟a中所獲得的細(xì)菌、細(xì)菌培養(yǎng)物或組合物接觸。

本發(fā)明的另一個(gè)目的涉及用于對(duì)植物病原細(xì)菌進(jìn)行生物控制的方法，所述植物病原細(xì)菌屬于物種根癌農(nóng)桿菌、黑腐果膠桿菌、青枯雷爾氏菌和野油菜黃單胞菌，所述方法包括以下步驟：

a.獲得如前文所述的細(xì)菌、細(xì)菌培養(yǎng)物或組合物；和

b.將受植物病原體影響的植物與步驟a中所獲得的細(xì)菌、細(xì)菌培養(yǎng)物或組合物接觸。

本發(fā)明的一個(gè)目的涉及用于對(duì)植物病原線蟲(chóng)(例如，根結(jié)線蟲(chóng)屬、孢囊線蟲(chóng)屬、黃金線蟲(chóng)屬、根腐線蟲(chóng)屬、針線蟲(chóng)屬、短體線蟲(chóng)屬、劍線蟲(chóng)屬和/或毛刺線蟲(chóng)屬物種)進(jìn)行生物控制的方法，所述方法包括以下步驟：

a.獲得如前文所述的細(xì)菌、細(xì)菌培養(yǎng)物或組合物；和

b.將受植物病原體影響的植物與步驟a中所獲得的細(xì)菌、細(xì)菌培養(yǎng)物或組合物接觸。

本發(fā)明的另一個(gè)目的涉及用于對(duì)屬于蚜科的植物病原昆蟲(chóng)以及屬于通常稱之為粉虱的物種的昆蟲(chóng)進(jìn)行生物控制的方法，所述方法包括以下步驟：

a.獲得如前文所述的細(xì)菌、細(xì)菌培養(yǎng)物或組合物；和

b.將受植物病原體影響的植物與步驟a中所獲得的細(xì)菌、細(xì)菌培養(yǎng)物或組合物接觸。

本發(fā)明所述的方法還可以包括使用分配本發(fā)明的細(xì)菌、培養(yǎng)物或組合物的系統(tǒng)。例如，本發(fā)明的方法可以包括使用分配本發(fā)明的細(xì)菌、培養(yǎng)物或組合物的滴頭。例如，本發(fā)明的方法可以包括使用分配本發(fā)明的細(xì)菌、培養(yǎng)物或組合物的自補(bǔ)償型滴頭。例如，本發(fā)明的方法可以包括使用分配本發(fā)明的細(xì)菌、培養(yǎng)物或組合物的局部灌溉系統(tǒng)(例如，具有例如旋轉(zhuǎn)或擴(kuò)散元件的微型噴灑器)。例如，本發(fā)明的方法可以包括使用分配本發(fā)明的細(xì)菌、培養(yǎng)物或組合物的噴灑器。

在優(yōu)選實(shí)施方式中，前述方法使用包含甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌菌株XT1和/或XT2的細(xì)菌、細(xì)菌培養(yǎng)物或組合物，所述菌株XT1和XT2分別以保藏號(hào)CECT8661和CECT8662保藏在西班牙典型培養(yǎng)物保藏中心(CECT)。

附圖說(shuō)明

為了對(duì)所進(jìn)行的描述進(jìn)行補(bǔ)充和有助于改善對(duì)根據(jù)幾個(gè)實(shí)施方式的本發(fā)明的特征和特性的理解，本文以說(shuō)明性而非限制性的方式展示了以下附圖：

圖1.XT1和XT2針對(duì)葡萄孢菌的抑制區(qū)和XT1針對(duì)鐮孢菌的抑制區(qū)。

圖2.菌株XT1針對(duì)根癌農(nóng)桿菌的活性。

圖3.爪哇根結(jié)線蟲(chóng)(M.javanica)在經(jīng)菌株XT1、XT2和模式菌株處理的番茄植株中的增殖系數(shù)。

圖4.在經(jīng)菌株XT1、XT2和模式菌株處理的每個(gè)植株中所見(jiàn)的平均線蟲(chóng)數(shù)量。

圖5.在經(jīng)菌株XT1、XT2和模式菌株處理的植株中所見(jiàn)的平均線蟲(chóng)數(shù)量/g根。

圖6.在經(jīng)菌株XT1處理前受蚜蟲(chóng)影響的油桃樹(shù)。

圖7.于室溫在盆中培育50天之后的南瓜植株生長(zhǎng)。盆B1和B2接種有菌株XT1，而B(niǎo)3和B4未進(jìn)行接種因此可以用作對(duì)照。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明涉及微生物作為植物生長(zhǎng)刺激劑和用于對(duì)植物病原細(xì)菌、昆蟲(chóng)、真菌和線蟲(chóng)進(jìn)行生物控制的應(yīng)用。更具體地，本發(fā)明涉及芽孢桿菌屬、特別是物種甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌的微生物作為植物生長(zhǎng)刺激劑和用于對(duì)植物病原細(xì)菌、昆蟲(chóng)、真菌和線蟲(chóng)進(jìn)行生物控制的應(yīng)用、其培養(yǎng)物、包含這些細(xì)菌的組合物、不同的培養(yǎng)方法以及包含這些的產(chǎn)品。優(yōu)選地，本發(fā)明涉及物種甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌的微生物用于對(duì)細(xì)菌、昆蟲(chóng)、植物病原線蟲(chóng)和真菌進(jìn)行生物控制的應(yīng)用、其培養(yǎng)物、包含這些細(xì)菌的組合物、不同的培養(yǎng)方法以及包含這些的產(chǎn)品。

優(yōu)選地，本發(fā)明涉及物種甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌的微生物用于對(duì)細(xì)菌、昆蟲(chóng)、植物病原線蟲(chóng)和真菌(除屬于物種稻瘟病菌的真菌以外)進(jìn)行生物控制的應(yīng)用、其培養(yǎng)物、包含這些細(xì)菌的組合物、不同的培養(yǎng)方法以及包含這些的產(chǎn)品。

優(yōu)選地，本發(fā)明涉及物種甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌的微生物用于對(duì)以下物種進(jìn)行生物控制的應(yīng)用、其培養(yǎng)物、包含這些細(xì)菌的組合物、不同的培養(yǎng)方法以及包含這些的產(chǎn)品：屬于物種根癌農(nóng)桿菌、黑腐果膠桿菌、青枯雷爾氏菌和野油菜黃單胞菌的細(xì)菌；屬于物種鏈格孢菌、黑曲霉、灰葡萄孢、尖孢鐮孢菌、惡疫霉菌、樟疫霉菌、米根霉、核盤(pán)菌、水稻紋枯病菌和棉花黃萎病菌的真菌；屬于蚜科的昆蟲(chóng)，以及屬于通常稱為粉虱的物種的昆蟲(chóng)；和/或線蟲(chóng)，例如，根結(jié)線蟲(chóng)屬、孢囊線蟲(chóng)屬、黃金線蟲(chóng)屬、根腐線蟲(chóng)屬、針線蟲(chóng)屬、短體線蟲(chóng)屬、劍線蟲(chóng)屬、毛刺線蟲(chóng)屬的物種，以及大致所有的寄生植物線蟲(chóng)。

生物控制(biological control或biocontrol)在本發(fā)明中定義為控制害蟲(chóng)、疾病和生長(zhǎng)不良的方法，其包括使用活生物體以控制另一種生物(植物病原生物體)群體。

在特定實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及屬于保藏號(hào)為CECT8661的菌株的細(xì)菌，該菌株由格拉納達(dá)大學(xué)于2014年4月23日保藏在西班牙典型培養(yǎng)物保藏中心(CECT)。在整個(gè)說(shuō)明書(shū)中，可以使用術(shù)語(yǔ)“菌株XT1”來(lái)指代該菌株。

在另一特定實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及屬于保藏號(hào)為CECT8662的菌株的細(xì)菌，該菌株由格拉納達(dá)大學(xué)于2014年4月23日保藏在西班牙典型培養(yǎng)物保藏中心(CECT)。在整個(gè)說(shuō)明書(shū)中，可以使用術(shù)語(yǔ)“菌株XT2”來(lái)指代該菌株。

本發(fā)明的一個(gè)目的涉及屬于菌株XT1和/或XT2的細(xì)菌在用于對(duì)植物病原生物體進(jìn)行生物控制的方法和/或在刺激植物生長(zhǎng)的方法中的應(yīng)用。

菌株XT1和XT2屬于物種甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌。該物種由Madhaiyan等在2010年進(jìn)行過(guò)描述。其分離自水稻植株(水稻(Oryza sativa))的根際。從系統(tǒng)發(fā)育學(xué)角度而言，物種甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌與枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌緊密相關(guān)，它們均為在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域具有各種應(yīng)用的微生物。這些物種的同一性百分比為98.2％至99.2％。菌株XT1和XT2與甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌的模式種的同一性分別為99.5％和99.3％。該結(jié)論是在對(duì)整個(gè)RNA r16S基因(1500pb)測(cè)序后得出的。

本發(fā)明的菌株XT1和XT2的科學(xué)分類如下：界：細(xì)菌界/門(mén)：厚壁菌門(mén)/綱：桿菌綱/目：芽孢桿菌目/科：芽孢桿菌科/屬：芽孢桿菌屬。

兩種菌株均為產(chǎn)孢子的革蘭氏陽(yáng)性桿菌。其尺寸為1.5μm至3.5μm長(zhǎng)，0.5μm寬。它們產(chǎn)生具有不規(guī)則邊界的象牙色菌落。它們是氧化酶陰性且過(guò)氧化氫酶陽(yáng)性。

菌株XT1和XT2具有周生鞭毛，這賦予其高移動(dòng)性。它們產(chǎn)生生物膜或膜，這使其能夠附著于有生命和無(wú)生命的基底并充當(dāng)針對(duì)環(huán)境中存在的捕食者的保護(hù)因素。形成生物膜使得微生物的附著更容易；如果通過(guò)滴灌施用，其會(huì)附著于根部。如果通過(guò)葉面應(yīng)用來(lái)施用，其將保留在葉際。此外，在根部和在葉和莖的生物膜形成均保護(hù)植物免受其它生命體的攻擊。

因此，鞭毛的存在和生物膜形成為這些細(xì)菌(XT1和XT2)帶來(lái)了在棲所定殖的優(yōu)勢(shì)。

菌株XT1和XT2產(chǎn)生橢圓形非變形孢子。在2xSG培養(yǎng)基中，這些細(xì)菌在3至5天中產(chǎn)生大于5x 10⁸個(gè)孢子/ml。它們耐鹽并且可在寬范圍的鹽濃度(0至12％(w/v))下最優(yōu)生長(zhǎng)。其在20℃至45℃和在pH為5-10時(shí)最優(yōu)生長(zhǎng)。它們具有極低養(yǎng)分要求：這些細(xì)菌能夠以寬范圍的有機(jī)化合物(例如，檸檬酸鹽或蔗糖)作為唯一碳源生長(zhǎng)。它們能以硝酸銨作為唯一氮源生長(zhǎng)，而不需要存在酵母提取物或復(fù)雜氮源。

孢子形成(這使得細(xì)菌在不利條件下維持在棲所中)和極低養(yǎng)分要求(這允許制備低成本的培養(yǎng)基)使菌株XT1和XT2從工業(yè)角度而言極具吸引力。

菌株XT1和XT2是兼性厭氧生物。它們?cè)谘鯕獯嬖跁r(shí)有氧呼吸，而在不存在氧氣時(shí)(例如在根部中或根部附近)進(jìn)行丁二醇發(fā)酵而產(chǎn)生2,3-丁二醇和乙偶姻。它們使用多種糖作為碳源和能量，從所述糖產(chǎn)生酸。這些菌株所用的糖包括甘油、葡萄糖、果糖、甘露糖醇、山梨糖醇、纖維二塘、乳糖和蔗糖。它們還能進(jìn)行固氮，即在不存在氮源時(shí)它們攝取氣態(tài)氮并將其轉(zhuǎn)化為氨，氨是植物能使用的氮源。它們產(chǎn)生二羥基丙酮和H₂S。

菌株XT1和XT2能夠合成螯合化合物，例如，攝取Fe³⁺而將其轉(zhuǎn)化為Fe²⁺的嗜鐵素化合物。鐵離子Fe³⁺在中性pH具有極低溶解性，因此不能為生物體所用。嗜鐵素將這些離子溶解為Fe²⁺絡(luò)合物，這可以通過(guò)主動(dòng)運(yùn)輸機(jī)制而吸收。

菌株XT1和XT2能夠產(chǎn)生許多具有高水解能力的胞外酶，其有助于植株對(duì)于基質(zhì)的可及性。在其它效果中，菌株XT1和XT2能夠產(chǎn)生水解淀粉的淀粉酶、水解脲而產(chǎn)生銨的脲酶、水解明膠和酪蛋白的蛋白酶、水解Tween 80和卵磷脂的脂酶、水解DNA的DNA酶、水解有機(jī)磷酸鹽和無(wú)機(jī)磷酸鹽的磷酸酶以及ACC脫氨酶。

菌株XT1和XT2在用于檢測(cè)嗜鐵素的CAS培養(yǎng)基中產(chǎn)生比Botrybel的貝萊斯芽孢桿菌菌株(其用作對(duì)照并生成3mm)更大的清除區(qū)(分別為7mm和5mm)。兩種菌株在無(wú)氮固體培養(yǎng)基中均比對(duì)照菌株生長(zhǎng)得更好(在固體培養(yǎng)基表面觀察到更大量的細(xì)菌團(tuán))，這指示了更高的固氮活性。因此，其作為肥料微生物的活性更高。

菌株XT1和XT2能夠形成生物膜。該活性尚未在此前的商業(yè)制備物中得以確定。這一能力使得所述細(xì)菌更易于附著至植株的根或葉以發(fā)揮其植物保護(hù)或生長(zhǎng)刺激作用。

更具體地，已發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的菌株XT1和/或XT2目標(biāo)物比Botrybel制備物的菌株具有更高的酶活性，產(chǎn)生更大的淀粉水解(淀粉酶活性，參見(jiàn)圖3)、明膠和酪蛋白(蛋白酶活性)、Tween 80和卵磷脂(脂酶活性)的暈圈(halo)以及更高的ACC脫氨酶和磷酸酶活性(利用磷酸酚酞和磷酸鈣測(cè)定)。在淀粉、酪蛋白和卵磷脂水解的情形中，觀察到作為透明區(qū)域出現(xiàn)的水解圈；對(duì)于明膠，可以觀察其液化的出現(xiàn)，即從固態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)橐簯B(tài)；在Tween 80的情形中，存在更不透明的沉淀區(qū)域；對(duì)于ACC脫氨酶活性，對(duì)在具有氨基環(huán)丙烷甲酸作為唯一氮源的培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)進(jìn)行了研究；最后，在向具有磷酸酚酞的板添加氨時(shí)通過(guò)出現(xiàn)的粉紅色而觀察磷酸酶活性，并且在看到具有該化合物的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的細(xì)菌團(tuán)周?chē)a(chǎn)生的透明區(qū)域時(shí)分析磷酸鈣溶解。上述活性在使用Botrybel制備物的貝萊斯芽孢桿菌作為對(duì)照時(shí)進(jìn)行分析。

作為針對(duì)真菌的生物控制劑的活性，確定了菌株XT1和XT2以及模式株甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌針對(duì)鏈格孢菌、黑曲霉、灰葡萄孢、尖孢鐮孢菌、惡疫霉菌、樟疫霉菌、米根霉、核盤(pán)菌、水稻紋枯病菌和棉花黃萎病菌的抑制值。在灰葡萄孢的情形中，生長(zhǎng)抑制值極為顯著。針對(duì)尖孢鐮孢菌的活性較低。一般而言，Botrybel的芽孢桿菌菌株具有相對(duì)于菌株XT1和XT2以及模式株更低的活性(在某些情形中具有類似的活性)(參見(jiàn)下文實(shí)施例2中表1)。

菌株XT1和甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌模式株也顯示出針對(duì)例如根癌農(nóng)桿菌、黑腐果膠桿菌、青枯雷爾氏菌和野油菜黃單胞菌等植物病原細(xì)菌的活性，而菌株XT2顯示出針對(duì)黑腐果膠桿菌和野油菜黃單胞菌的活性(參見(jiàn)下文實(shí)施例3中表2)。

菌株XT1、XT2和甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌模式株顯示出針對(duì)禾谷縊管蚜的活性(參見(jiàn)表3)，且菌株XT1顯示出針對(duì)粉虱的活性(參見(jiàn)下文實(shí)施例6，b1)。

菌株XT1、XT2和甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌模式株顯著降低了爪哇根結(jié)線蟲(chóng)的增殖系數(shù)以及每棵番茄植株的線蟲(chóng)數(shù)和每克根的線蟲(chóng)數(shù)(參見(jiàn)圖3、4和5)；類似地，使用菌株XT1的處理恢復(fù)了在溫室中培育且受線蟲(chóng)高度感染的荷蘭黃瓜植株(參見(jiàn)下文實(shí)施例4b)。

菌株XT1和XT2的另一優(yōu)點(diǎn)在于其對(duì)治療中通常使用的抗微生物劑的高度敏感性。在固體培養(yǎng)基技術(shù)中經(jīng)擴(kuò)散后，其對(duì)萘啶酸(30μg)、阿莫西林(2μg)、阿莫西林-克拉維酸(30μg)、頭孢噻吩(30μg)、粘菌素(10μg)、多西環(huán)素30μg、紅霉素(15μg)、卡那霉素(30μg)、呋喃妥英(300μg)、諾氟沙星(5μg)、新生霉素(30μg)、利福平(30μg)、甲氧芐啶磺胺甲噁唑(1.25μg-23.75μg)和萬(wàn)古霉素(30μg)敏感。因此，它們不會(huì)將抗性基因傳遞給根際的其它微生物群。

菌株XT1、XT2和甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌模式株具有用于針對(duì)真菌進(jìn)行生物控制和用作植物生長(zhǎng)刺激劑的額外優(yōu)點(diǎn)，其在于它們易于培養(yǎng)且因此易于達(dá)到工業(yè)水平。針對(duì)出于相同目的描述的其它屬的其它細(xì)菌菌株的優(yōu)點(diǎn)在于菌株XT1和XT2的部分上存在孢子，這帶來(lái)在儲(chǔ)存期間和在條件不適于操作所述微生物時(shí)的環(huán)境中的總產(chǎn)品穩(wěn)定性。

菌株XT1、XT2和甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌模式株產(chǎn)生降低pH的化合物，例如當(dāng)其在厭氧條件下發(fā)酵糖時(shí)的2,3-丁二醇和乙偶姻。此外，它們能夠固氮，從而產(chǎn)生嗜鐵素和水解酶。所有這些特性都是直接植物生長(zhǎng)刺激的機(jī)制(Sessitsch等，2002；Perrine等，2004；Rodríguez和Fraga,1999；Carson等2000；Essalmani和Lahlou,2003；Choudhary和Johri,2009)。

菌株XT1、XT2和模式株產(chǎn)生不同的脂肽、表面活性劑。這些表面活性劑脂肽中包括表面活性素，這與枯草芽孢桿菌所產(chǎn)生的相似。更具體地，菌株XT1產(chǎn)生的表面活性素在其脂鏈中不具有12碳(12C)脂肪酸。

在遵循Cooper等1981的方法提取脂肽后，對(duì)于菌株XT1和XT2分別獲得了0.12g/l和0.10g/l培養(yǎng)物的產(chǎn)率。模式株產(chǎn)生0.6g/l。脂肽生產(chǎn)在商業(yè)制備物Botrybel的芽孢桿菌屬菌株的情形中未有描述。更具體地，除表面活性素外，本發(fā)明的菌株XT1目標(biāo)物還產(chǎn)生其它表面活性劑脂肽，例如，芬薺素(fengycin)和地衣素。

菌株XT1、XT2和模式株的細(xì)胞干重(CDW)分別為2.7g/l、2.5g/l和2.9g/l。在菌株XT1的情形中，臨界膠束濃度(CMC)為0.0025％(0.025mg/ml)；采用該值得到的表面張力為29.7mN/m。在由枯草芽孢桿菌產(chǎn)生且由販?zhǔn)鄣谋砻婊钚运氐那樾沃?，在相同CMC下獲得的值為26.7mN/m。換言之，菌株XT1產(chǎn)生極為活躍的脂酶表面活性劑，其顯示出與市場(chǎng)上可獲取的表面活性素相似的活性。

芽孢桿菌屬物種產(chǎn)生的許多脂肽顯示出抗生素活性，其在細(xì)胞膜水平作用于真菌和革蘭氏陰性菌，例如，芬薺素、分支桿菌素、伊枯草菌素、芽孢桿菌素(bacillomycin)、表面活性素、抗霉枯草菌素、制真菌素(Volpon等，2000；Yilmaz等2006)。

更具體地，菌株XT1所產(chǎn)生的脂肽是通過(guò)亮氨酸或異亮氨酸與環(huán)肽結(jié)合的13、14和15碳原子脂肪酸的混合物。這些脂肪酸的相對(duì)比例分別為1、6.5和5.7。

根據(jù)文獻(xiàn)(參見(jiàn)現(xiàn)有技術(shù))，酶(葡聚糖酶、蛋白酶、脂酶、磷酸酶和脲酶)以及不同脂肽的產(chǎn)生和SH₂的釋放是所述菌株在對(duì)真菌、細(xì)菌、昆蟲(chóng)和線蟲(chóng)進(jìn)行生物控制方面的作用的原因。

本發(fā)明的另一個(gè)目的涉及對(duì)植物病原生物體進(jìn)行生物控制的方法，所述方法包括以下步驟：

a.獲得本發(fā)明所述的細(xì)菌、細(xì)菌培養(yǎng)物或組合物；和

b.將植物與步驟a中所獲得的細(xì)菌、細(xì)菌培養(yǎng)物或組合物接觸。

本發(fā)明的另一個(gè)目的涉及刺激植物生長(zhǎng)和/或?qū)χ参锊≡€蟲(chóng)(例如根結(jié)線蟲(chóng)屬、孢囊線蟲(chóng)屬、黃金線蟲(chóng)屬、根腐線蟲(chóng)屬、針線蟲(chóng)屬、短體線蟲(chóng)屬、劍線蟲(chóng)屬、毛刺線蟲(chóng)屬的物種，和大致所有寄生植物線蟲(chóng))進(jìn)行生物控制的方法，所述方法包括以下步驟：

a.獲得本發(fā)明所述的細(xì)菌、細(xì)菌培養(yǎng)物或組合物；和

b.將受植物病原體影響的植物與步驟a中所獲得的細(xì)菌、細(xì)菌培養(yǎng)物或組合物接觸。

本發(fā)明的另一個(gè)目的涉及刺激植物(優(yōu)選未受植物病原生物體影響的植物)生長(zhǎng)的方法，所述方法包括以下步驟：

a.獲得本發(fā)明所述的細(xì)菌、細(xì)菌培養(yǎng)物或組合物；和

b.將優(yōu)選未受植物病原體影響的植物與步驟a中所獲得的細(xì)菌、細(xì)菌培養(yǎng)物或組合物接觸。

本發(fā)明的另一個(gè)目的涉及刺激植物生長(zhǎng)的方法，所述方法包括以下步驟：

a.獲得本發(fā)明所述的細(xì)菌、細(xì)菌培養(yǎng)物或組合物；和

b.將受植物病原體影響的植物與步驟a中所獲得的細(xì)菌、細(xì)菌培養(yǎng)物或組合物接觸。

本發(fā)明的一個(gè)目的涉及對(duì)屬于蚜科的植物病原昆蟲(chóng)以及屬于通常稱為粉虱的物種的昆蟲(chóng)進(jìn)行生物控制的方法，所述方法包括以下步驟：

a.獲得如前文所述的細(xì)菌、細(xì)菌培養(yǎng)物或組合物；和

b.將受植物病原體影響的植物與步驟a中所獲得的細(xì)菌、細(xì)菌培養(yǎng)物或組合物接觸。

在本發(fā)明的方法中，本發(fā)明的細(xì)菌、細(xì)菌培養(yǎng)物或組合物可以通過(guò)葉面應(yīng)用(例如，借助噴霧和/或滴注)或者通過(guò)常規(guī)灌溉或通過(guò)漫灌等來(lái)與植物(受影響的)接觸。

本發(fā)明所述的方法可以進(jìn)一步包括使用分配本發(fā)明的細(xì)菌、培養(yǎng)物或組合物的分配系統(tǒng)。例如，本發(fā)明的方法可以包括使用分配本發(fā)明的細(xì)菌、培養(yǎng)物或組合物的滴頭。例如，本發(fā)明的方法可以包括使用分配本發(fā)明的細(xì)菌、培養(yǎng)物或組合物的自補(bǔ)償型滴頭。例如，本發(fā)明的方法可以包括使用分配本發(fā)明的細(xì)菌、培養(yǎng)物或組合物的局部灌溉系統(tǒng)(例如，微型噴灑器，可選地具有例如旋轉(zhuǎn)或擴(kuò)散元件)。例如，本發(fā)明的方法可以包括使用分配本發(fā)明的細(xì)菌、培養(yǎng)物或組合物的噴灑器。

局部灌溉系統(tǒng)可以定義為：為了保持液體以合適且恒定的水平分配至土壤中，以緩慢、局部且均勻的方式在植物根塊中逐滴應(yīng)用所述液體的分配液體(水、肥料、或者在本情形中為本發(fā)明的細(xì)菌、培養(yǎng)物或組合物)方法。

局部灌溉系統(tǒng)可以包括滴注、滲出和/或微噴灑系統(tǒng)。

本領(lǐng)域技術(shù)人員了解局部灌溉系統(tǒng)如何運(yùn)行以及如何使用它們。

根據(jù)本發(fā)明的滴頭定義為本發(fā)明的細(xì)菌、培養(yǎng)物或組合物在待處理的植物附近的輸送點(diǎn)。本領(lǐng)域技術(shù)人員了解滴頭如何運(yùn)行和如何使用。

因此，本發(fā)明的另一個(gè)目的涉及對(duì)植物病原生物體(優(yōu)選真菌、細(xì)菌和線蟲(chóng))進(jìn)行生物控制(預(yù)防)的方法，所述方法包括以下步驟：

a.獲得本發(fā)明所述的細(xì)菌、細(xì)菌培養(yǎng)物或組合物；和

b.將植物與步驟a中所獲得的細(xì)菌、細(xì)菌培養(yǎng)物或組合物接觸，為此使用分配本發(fā)明的細(xì)菌、培養(yǎng)物或組合物的分配系統(tǒng)。

根據(jù)本發(fā)明，預(yù)防是為使風(fēng)險(xiǎn)最小化而提前采取的行為。本發(fā)明的預(yù)防的目的在于避免發(fā)生可能的損害(受植物病原生物體感染)。

因此，本發(fā)明的另一個(gè)目的涉及對(duì)植物病原生物體(優(yōu)選真菌、細(xì)菌、昆蟲(chóng)和線蟲(chóng))進(jìn)行生物控制(處理)的方法，所述方法包括以下步驟：

a.獲得本發(fā)明所述的細(xì)菌、細(xì)菌培養(yǎng)物或組合物；和

b.將受植物病原體影響的植物與步驟a中所獲得的細(xì)菌、培養(yǎng)物或組合物接觸，為此使用分配本發(fā)明的細(xì)菌、培養(yǎng)物或組合物的分配系統(tǒng)。

在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)“處理”應(yīng)理解為其目的在于治愈或減輕(緩和)疾病或癥狀的手段的集合。

因此，本發(fā)明的另一個(gè)目的涉及對(duì)植物病原生物體進(jìn)行生物控制的方法，所述植物病原生物體優(yōu)選為真菌(除屬于物種稻瘟病菌的那些)、細(xì)菌(優(yōu)選根癌農(nóng)桿菌、黑腐果膠桿菌、青枯雷爾氏菌和野油菜黃單胞菌)、昆蟲(chóng)(優(yōu)選屬于蚜科的植物病原昆蟲(chóng)，以及屬于通常稱作粉虱的物種的昆蟲(chóng))和/或線蟲(chóng)(例如，屬于根結(jié)線蟲(chóng)屬、孢囊線蟲(chóng)屬、黃金線蟲(chóng)屬、根腐線蟲(chóng)屬、針線蟲(chóng)屬、短體線蟲(chóng)屬、劍線蟲(chóng)屬、毛刺線蟲(chóng)屬的物種，和大致所有寄生植物線蟲(chóng))，所述方法包括以下步驟：

a.獲得本發(fā)明所述的細(xì)菌、細(xì)菌培養(yǎng)物或組合物；和

b.將受植物病原體影響的植物與步驟a中所獲得的細(xì)菌、培養(yǎng)物或組合物接觸，為此使用分配本發(fā)明的細(xì)菌、培養(yǎng)物或組合物的分配系統(tǒng)。

本發(fā)明的另一個(gè)目的涉及對(duì)植物病原生物體進(jìn)行生物控制的方法，所述植物病原生物體優(yōu)選為：真菌(屬于物種鏈格孢菌、黑曲霉、灰葡萄孢、尖孢鐮孢菌、惡疫霉菌、樟疫霉菌、米根霉、核盤(pán)菌、水稻紋枯病菌和棉花黃萎病菌)、細(xì)菌(優(yōu)選屬于物種根癌農(nóng)桿菌、黑腐果膠桿菌、青枯雷爾氏菌和野油菜黃單胞菌)和/或線蟲(chóng)(例如，屬于根結(jié)線蟲(chóng)屬、孢囊線蟲(chóng)屬、黃金線蟲(chóng)屬、根腐線蟲(chóng)屬、針線蟲(chóng)屬、短體線蟲(chóng)屬、劍線蟲(chóng)屬、毛刺線蟲(chóng)屬的物種，和大致所有寄生植物線蟲(chóng))，所述方法包括以下步驟：

a.獲得本發(fā)明所述的細(xì)菌、細(xì)菌培養(yǎng)物或組合物；和

b.將受植物病原體影響的植物與步驟a中所獲得的細(xì)菌、培養(yǎng)物或組合物接觸，為此使用分配本發(fā)明的細(xì)菌、培養(yǎng)物或組合物的分配系統(tǒng)。

分配本發(fā)明的細(xì)菌、培養(yǎng)物或組合物的分配系統(tǒng)可以包括局部灌溉系統(tǒng)、滴頭、自補(bǔ)償?shù)晤^、微型噴灑器和/或噴灑器。

此外，在本發(fā)明的方法中，可以將本發(fā)明的細(xì)菌、培養(yǎng)物和/或組合物與受影響的植物接觸至少一次、優(yōu)選至少兩次、優(yōu)選至少三次、優(yōu)選至少四次、優(yōu)選至少五次、優(yōu)選至少六次或者更多次。

此外，本發(fā)明細(xì)菌、培養(yǎng)物和/或組合物的一次應(yīng)用與下一次應(yīng)用(如果其用于多于一次的接觸或應(yīng)用)之間的時(shí)間間隔為2天、或3天、或5天、或10天、或15天、或20天、或30天。

優(yōu)選地，本發(fā)明的細(xì)菌、培養(yǎng)物和/或組合物與受影響的植物接觸兩次，一次在時(shí)間(t)＝0時(shí)，另一次在30天后。

優(yōu)選地，本發(fā)明的細(xì)菌、培養(yǎng)物和/或組合物與受影響的植物每10天接觸一次持續(xù)60天，或每天一次持續(xù)8-12天。

此外，在本發(fā)明的方法中，本發(fā)明的具有至少10⁸集落形成單位(CFU)/ml的微生物濃度的培養(yǎng)物和/或組合物以0.5％至5％(v/v)的稀釋度使用，例如0.5％、1％、1.5％、2％、3％和/或5％(v/v)。優(yōu)選地，在本發(fā)明的方法中，本發(fā)明的培養(yǎng)物和/或組合物的微生物濃度為1.5％(v/v)的含5x 10⁸CFU/ml的制備物。

因此，本發(fā)明的一個(gè)目的涉及對(duì)植物病原生物體進(jìn)行生物控制的方法，所述植物病原生物體優(yōu)選為：真菌(屬于物種鏈格孢菌、黑曲霉、灰葡萄孢、尖孢鐮孢菌、惡疫霉菌、樟疫霉菌、米根霉、核盤(pán)菌、水稻紋枯病菌和棉花黃萎病菌)、細(xì)菌(優(yōu)選屬于物種根癌農(nóng)桿菌、黑腐果膠桿菌、青枯雷爾氏菌和野油菜黃單胞菌)和/或線蟲(chóng)(例如，屬于根結(jié)線蟲(chóng)屬、孢囊線蟲(chóng)屬、黃金線蟲(chóng)屬、根腐線蟲(chóng)屬、針線蟲(chóng)屬、短體線蟲(chóng)屬、劍線蟲(chóng)屬、毛刺線蟲(chóng)屬的物種)、屬于蚜科的昆蟲(chóng)和屬于通常稱為粉虱的物種的昆蟲(chóng)、以及大致所有寄生植物線蟲(chóng)和昆蟲(chóng)(優(yōu)選粉虱、蚜蟲(chóng))，所述方法包括以下步驟：

a.獲得本發(fā)明所述的細(xì)菌、細(xì)菌培養(yǎng)物或組合物；和

b.借助分配系統(tǒng)和/或滴頭和/或局部灌溉系統(tǒng)和/或噴灑器將受植物病原體影響的植物與步驟a中所獲得的細(xì)菌、培養(yǎng)物或組合物接觸，例如至少一次、優(yōu)選至少兩次、優(yōu)選至少三次、優(yōu)選至少四次、優(yōu)選至少五次、優(yōu)選至少六次或更多次，為此使用分配本發(fā)明的細(xì)菌、培養(yǎng)物或組合物的分配系統(tǒng)，其中所述培養(yǎng)物或組合物具有至少10⁸集落形成單位(CFU)/ml的微生物濃度，以0.5％至5％(v/v)的稀釋度(例如0.5％、1％、1.5％、2％、3％和/或5％(v/v))使用，優(yōu)選每10天一次持續(xù)60天、或每天一次持續(xù)8-12天。

因此，本發(fā)明的一個(gè)目的涉及對(duì)植物病原生物體進(jìn)行生物控制的方法，所述植物病原生物體優(yōu)選為屬于物種鏈格孢菌、黑曲霉、灰葡萄孢、尖孢鐮孢菌、惡疫霉菌、樟疫霉菌、米根霉、核盤(pán)菌、水稻紋枯病菌和棉花黃萎病菌的真菌，所述方法包括以下步驟：

a.獲得本發(fā)明所述的細(xì)菌、細(xì)菌培養(yǎng)物或組合物；和

b.借助分配系統(tǒng)和/或滴頭和/或局部灌溉系統(tǒng)和/或噴灑器將受植物病原體影響的植物與步驟a中所獲得的細(xì)菌、培養(yǎng)物或組合物接觸，例如至少一次、優(yōu)選至少兩次、優(yōu)選至少三次、優(yōu)選至少四次、優(yōu)選至少五次、優(yōu)選至少六次或更多次，為此使用分配本發(fā)明的細(xì)菌、培養(yǎng)物或組合物的分配系統(tǒng)，其中所述培養(yǎng)物或組合物具有至少10⁸集落形成單位(CFU)/ml的微生物濃度，以0.5％至5％(v/v)的稀釋度(例如0.5％、1％、1.5％、2％、3％和/或5％(v/v))使用，優(yōu)選每10天一次持續(xù)60天、或每天一次持續(xù)8-12天。

因此，本發(fā)明的一個(gè)目的涉及對(duì)植物病原生物體進(jìn)行生物控制的方法，所述植物病原生物體優(yōu)選為細(xì)菌，優(yōu)選屬于物種根癌農(nóng)桿菌、黑腐果膠桿菌、青枯雷爾氏菌和野油菜黃單胞菌的細(xì)菌，所述方法包括以下步驟：

a.獲得本發(fā)明所述的細(xì)菌、細(xì)菌培養(yǎng)物或組合物；和

b.借助分配系統(tǒng)和/或滴頭和/或局部灌溉系統(tǒng)和/或噴灑器將受植物病原體影響的植物與步驟a中所獲得的細(xì)菌、培養(yǎng)物或組合物接觸，例如至少一次、優(yōu)選至少兩次、優(yōu)選至少三次、優(yōu)選至少四次、優(yōu)選至少五次、優(yōu)選至少六次或更多次，為此使用分配本發(fā)明的細(xì)菌、培養(yǎng)物或組合物的分配系統(tǒng)，其中所述培養(yǎng)物或組合物具有至少10⁸集落形成單位(CFU)/ml的微生物濃度，以0.5％至5％(v/v)的稀釋度(例如0.5％、1％、1.5％、2％、3％和/或5％(v/v))使用，優(yōu)選每10天一次持續(xù)60天、或每天一次持續(xù)8-12天。

因此，本發(fā)明的一個(gè)目的涉及對(duì)植物病原生物體進(jìn)行生物控制的方法，所述植物病原生物體優(yōu)選為線蟲(chóng)，例如根結(jié)線蟲(chóng)屬、孢囊線蟲(chóng)屬、黃金線蟲(chóng)屬、根腐線蟲(chóng)屬、針線蟲(chóng)屬、短體線蟲(chóng)屬、劍線蟲(chóng)屬、毛刺線蟲(chóng)屬的物種以及大致所有的寄生植物線蟲(chóng)，所述方法包括以下步驟：

a.獲得本發(fā)明所述的細(xì)菌、細(xì)菌培養(yǎng)物或組合物；和

b.借助分配系統(tǒng)和/或滴頭和/或局部灌溉系統(tǒng)和/或噴灑器將受植物病原體影響的植物與步驟a中所獲得的細(xì)菌、培養(yǎng)物或組合物接觸，例如至少一次、優(yōu)選至少兩次、優(yōu)選至少三次、優(yōu)選至少四次、優(yōu)選至少五次、優(yōu)選至少六次或更多次，為此使用分配本發(fā)明的細(xì)菌、培養(yǎng)物或組合物的分配系統(tǒng)，其中所述培養(yǎng)物或組合物具有至少10⁸集落形成單位(CFU)/ml的微生物濃度，以0.5％至5％(v/v)的稀釋度(例如0.5％、1％、1.5％、2％、3％和/或5％(v/v))使用，優(yōu)選每10天一次持續(xù)60天、或每天一次持續(xù)8-12天。

因此，本發(fā)明的一個(gè)目的涉及對(duì)植物病原生物體進(jìn)行生物控制的方法，所述植物病原生物體優(yōu)選為昆蟲(chóng)，例如屬于蚜科的物種，以及屬于通常稱為粉虱的物種的昆蟲(chóng)，所述方法包括以下步驟：

a.獲得本發(fā)明所述的細(xì)菌、細(xì)菌培養(yǎng)物或組合物；和

b.借助分配系統(tǒng)和/或滴頭和/或局部灌溉系統(tǒng)和/或噴灑器將受植物病原體影響的植物與步驟a中所獲得的細(xì)菌、培養(yǎng)物或組合物接觸，例如至少一次、優(yōu)選至少兩次、優(yōu)選至少三次、優(yōu)選至少四次、優(yōu)選至少五次、優(yōu)選至少六次或更多次，為此使用分配本發(fā)明的細(xì)菌、培養(yǎng)物或組合物的分配系統(tǒng)，其中所述培養(yǎng)物或組合物具有至少10⁸集落形成單位(CFU)/ml的微生物濃度，以0.5％至5％(v/v)的稀釋度(例如0.5％、1％、1.5％、2％、3％和/或5％(v/v))使用，優(yōu)選每10天一次持續(xù)60天、或每天一次持續(xù)8-12天。

因此，本發(fā)明的一個(gè)目的涉及刺激植物生長(zhǎng)的方法，所述方法包括以下步驟：

a.獲得本發(fā)明所述的細(xì)菌、細(xì)菌培養(yǎng)物或組合物；和

b.借助分配系統(tǒng)和/或滴頭和/或局部灌溉系統(tǒng)和/或噴灑器將植物(其受或未受植物病原體影響)與步驟a中所獲得的細(xì)菌、培養(yǎng)物或組合物接觸，例如至少一次、優(yōu)選至少兩次、優(yōu)選至少三次、優(yōu)選至少四次、優(yōu)選至少五次、優(yōu)選至少六次或更多次，為此使用分配本發(fā)明的細(xì)菌、培養(yǎng)物或組合物的分配系統(tǒng)，其中所述培養(yǎng)物或組合物具有至少10⁸集落形成單位(CFU)/ml的微生物濃度，以0.5％至5％(v/v)的稀釋度(例如0.5％、1％、1.5％、2％、3％和/或5％(v/v))使用，優(yōu)選每10天一次持續(xù)60天、每天一次持續(xù)8-12天、或者在30天的時(shí)段中兩次(一次在第0天時(shí)間，另一次在第30天時(shí)間)。

在整個(gè)說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求書(shū)中，詞語(yǔ)“包含”及其變體并非意在排除其它技術(shù)特征、添加物、成分或步驟。術(shù)語(yǔ)“包含”還涵蓋術(shù)語(yǔ)“由…組成”。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，本發(fā)明的其它目的、優(yōu)點(diǎn)和特征將部分地從說(shuō)明書(shū)中且部分地通過(guò)將本發(fā)明投入實(shí)施而得出。通過(guò)說(shuō)明方式提供以下實(shí)施例，但并非意在限制本發(fā)明。

實(shí)施例

實(shí)施例1.菌株XT1和XT2的分離

本發(fā)明的目的物菌株XT1(保藏號(hào)CECT8661)于1999年分離自位于Fuente de Piedra,Malaga(西班牙)的Capacete湖附近的土壤的根際的樣品。菌株XT2(保藏號(hào)CECT8662)于2010年分離自Velez河(Malaga,西班牙)的河口附近的土壤。所用的培養(yǎng)基對(duì)于菌株XT1為添加有7.5％海鹽的MY培養(yǎng)基(Moraine和Rogovin 1966)，且對(duì)于菌株XT2為添加有3％海鹽的MY培養(yǎng)基。兩種菌株均針對(duì)約5000個(gè)菌落進(jìn)行特性選擇(借助Jain等1991的方法搜尋具有更高的表面活性劑活性的那些)。

實(shí)施例2.菌株XT1、XT2和模式株作為抗真菌劑的應(yīng)用

通過(guò)將菌株XT1、XT2、模式株和Botrybel菌株接種至PDA培養(yǎng)基(馬鈴薯右旋糖瓊脂)中的小范圍內(nèi)來(lái)建立抗真菌活性(表1)。然后在相對(duì)末端安置約1cm²的具有待測(cè)試的真菌的菌絲體的瓊脂片，并在25℃溫育20天之后，測(cè)定真菌菌絲體的最大和最小半徑，以計(jì)算該真菌的生長(zhǎng)減少的百分比。

表1.以nm表示的針對(duì)不同真菌的最大和最小抑制值，括號(hào)中為菌絲體的減少百分比。ND：未測(cè)得

在受測(cè)真菌中，針對(duì)葡萄孢屬實(shí)現(xiàn)了最高抑制(菌株XT1和XT2)，而針對(duì)鐮孢菌屬實(shí)現(xiàn)了最低抑制(圖1)。

還測(cè)定了菌株XT1和XT2以及模式株針對(duì)釀酒酵母(一種具有巨大工業(yè)應(yīng)用的有益酵母)的抗微生物活性，并在其不存在時(shí)進(jìn)行了觀察(即，抑制區(qū)為0mm)。

實(shí)施例3.菌株XT1、XT2和模式株作為抗細(xì)菌劑的應(yīng)用

通過(guò)在具有胰酶解大豆瓊脂(TSA)的皮氏培養(yǎng)皿中加入6ml無(wú)菌TSA(45℃)覆蓋物和1ml處于指數(shù)生長(zhǎng)期的待分析植物病原菌株的培養(yǎng)物(其濃度根據(jù)Mac Farland標(biāo)準(zhǔn)相當(dāng)于1)來(lái)測(cè)定抗細(xì)菌活性。然后，一旦培養(yǎng)基固化，則將100μl來(lái)自培養(yǎng)物的上清液接種至板孔中。在溫育24小時(shí)后，測(cè)定抑制區(qū)(表2，圖2)。

表2.抗細(xì)菌活性。結(jié)果以生長(zhǎng)抑制mm表示。R：具有抗性

實(shí)施例4.菌株XT1、XT2和模式株作為對(duì)線蟲(chóng)進(jìn)行生物控制的試劑的應(yīng)用

a)在用爪哇根結(jié)線蟲(chóng)接種的番茄植株中的測(cè)試(圖3、4和5)

使用5批番茄植株(Solanum lycopersicum)，每批10株。將3批用選定的菌株(2x10⁸CFU)接種然后用爪哇根結(jié)線蟲(chóng)J2(1500)接種。最后，使用具有和不具有線蟲(chóng)的兩批作為對(duì)照。在50天后，測(cè)定每個(gè)植株的土壤中和根中的線蟲(chóng)數(shù)，并計(jì)算增殖系數(shù)(Talavera等，2012)。所得結(jié)果可見(jiàn)圖3、4和5。

觀察到所有菌株均使線蟲(chóng)增殖系數(shù)、每株的線蟲(chóng)數(shù)和每g根的線蟲(chóng)數(shù)減少，該減少在菌株XT1和XT2的情形中更為顯著。

b)采用菌株XT1在具有每年復(fù)發(fā)的問(wèn)題(由于土壤中水分過(guò)多、難以生根和根出現(xiàn)高度腐爛以及受線蟲(chóng)感染)的荷蘭黃瓜作物中進(jìn)行溫室測(cè)試。

使用2000m²的區(qū)用于滴灌中的滴注，另一個(gè)類似的區(qū)用作對(duì)照。將7.5l培養(yǎng)物在以10天時(shí)間間隔的六次施用中施用(每次施用1250I的具有至少10⁸CFU/ml的培養(yǎng)物)。在對(duì)照區(qū)和處理區(qū)中均維持通常的施肥和植物健康處理。對(duì)照區(qū)的該處理期間損失的植株數(shù)為36，而用菌株XT1處理的植株的損失數(shù)為6。生產(chǎn)差異同樣顯著，在經(jīng)處理區(qū)獲得了高出30％的生產(chǎn)。

實(shí)施例5.菌株XT1、XT2和模式株作為對(duì)昆蟲(chóng)進(jìn)行生物控制的試劑的應(yīng)用

a)出于測(cè)定死亡百分比的目的，用大麥蚜蟲(chóng)(Rhopalosiphum padi)和小黑花蝽象(Anthocoris nemoralis)進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)，在這些昆蟲(chóng)上產(chǎn)生了三種甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌的三種菌株的細(xì)菌培養(yǎng)物及其表面活性劑。由于第一類昆蟲(chóng)是吸啜昆蟲(chóng)，測(cè)試僅局部地進(jìn)行，而在第二種情況中既在局部進(jìn)行也通過(guò)吞咽進(jìn)行。

通過(guò)局部使用在兩類昆蟲(chóng)中分析了具有5x 10⁸CFU/ml的菌株XT1和XT2的細(xì)菌培養(yǎng)物及其在蒸餾水中濃度為1/1000的表面活性劑的活性。對(duì)于每次處理使用10個(gè)個(gè)體。在小黑花蝽象的情形中，用移液管在其蟲(chóng)體上應(yīng)用5μΙ，而用刷以相同量對(duì)蚜蟲(chóng)進(jìn)行浸漬。細(xì)菌培養(yǎng)基SG用作對(duì)照。獲得的結(jié)果以48h后的存活百分比表示如下：

表3.通過(guò)在大麥蚜蟲(chóng)(Rhopalosiphum padi)和小黑花蝽象中的局部使用的死亡率。結(jié)果以個(gè)體百分比表示。

同樣地對(duì)小黑花蝽象通過(guò)吞咽分析了具有5x 10⁸CFU/ml的菌株XT1、XT2和甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌模式株及三種對(duì)應(yīng)表面活性劑(濃度為在蒸餾水中1/1000)的細(xì)菌培養(yǎng)物的活性。使用水和Tween 80(1/1000稀釋)作為對(duì)照。將不同產(chǎn)物施用在以水(1ml)浸濕的海綿上和通過(guò)噴霧(0.25ml)施用在食物(地中海斑螟(Ephestia kuheniella)卵)上以確保其良好覆蓋。對(duì)每個(gè)處理進(jìn)行四次重復(fù)，每次5個(gè)個(gè)體，每日進(jìn)行觀察持續(xù)6日。所獲得的以死亡率百分比表示的結(jié)果如下表所示：

表4.小黑花蝽象中通過(guò)吞咽的死亡率。結(jié)果以個(gè)體百分比表示。

b)此外，對(duì)受綠蚜蟲(chóng)和黑蚜蟲(chóng)高度影響的油桃樹(shù)(桃種油桃變種(Prunus persica var.nectarina)，見(jiàn)圖6)進(jìn)行了處理。采用具有5x 10⁸CFU/ml的XT1培養(yǎng)物。具體地，每10天通過(guò)葉面應(yīng)用來(lái)施用50ml的所述培養(yǎng)物的5％稀釋液。在第二次施用后，群體基本消失，但在某些保持卷曲的葉的末端仍有具有蚜蟲(chóng)的小區(qū)域并手動(dòng)除去。一個(gè)月后，害蟲(chóng)得到控制。

c)在用菌株XT1處理的溫室番茄培養(yǎng)物中觀察到類似的粉虱的消失(參見(jiàn)實(shí)施例6b1)。

實(shí)施例6.菌株XT1、XT2和模式株作為植物強(qiáng)化劑的應(yīng)用

a)用菌株XT1、XT2和模式株對(duì)辣椒植株(辣椒屬)和南瓜植株(南瓜屬)的盆測(cè)試。

使用移種到直徑10cm且高15cm的盆中的16棵來(lái)自前述植物中每一種的5cm高的幼苗，并令其暴露于室溫(20℃至38℃的溫度范圍)35天。每48h用相同的水量(約50ml)對(duì)所述盆進(jìn)行灌溉。獲得每類植物各4批，每批4盆。每7天在灌溉后向每類植物的3批添加5ml的5x10⁸CFU/ml的芽孢桿菌菌株XT1、菌株XT2和模式株的培養(yǎng)物的1/100稀釋液。將每類植物的一批(4盆)用作對(duì)照，因此其未進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)物接種。35天后，切下地上部分并干燥。所得結(jié)果見(jiàn)于下表中。

表5.菌株XT1、XT2和模式株的植物強(qiáng)化效果

注：在黃瓜作物中，在對(duì)照以及用模式株灌溉的那些植株的情形中存在因天氣條件和害蟲(chóng)導(dǎo)致的50％植株損失，在用菌株XT2灌溉的植株中存在25％損失；然而，所有用XT1灌溉的植株保持最佳狀況。

b)進(jìn)而，采用菌株XT1進(jìn)行以下測(cè)試：

b.1.在溫室梨果番茄(pear tomato)作物中的測(cè)試。

借助噴灑以3種不同劑量的含至少10⁸CFU/ml的培養(yǎng)物肉湯(0.5％、1％和1.5％v/v)通過(guò)葉面施用進(jìn)行處理，并進(jìn)行兩次重復(fù)(在時(shí)間0和30天后)。每次處理栽植6棵植株。使用未經(jīng)處理的對(duì)照。在研究期間，在溫室內(nèi)并且因此在對(duì)照中存在幾種病害：粉虱、蚜蟲(chóng)、粉孢子和葡萄孢。在用菌株XT1的培養(yǎng)物處理的區(qū)域中損失的植株數(shù)少于對(duì)照區(qū)的損失數(shù)，最合適的劑量為1.5％(v/v)劑量。另外，從經(jīng)處理植株摘取的番茄重量大于對(duì)照植株的番茄重量(參見(jiàn)表6)。

表6.在用XT1處理后的兩個(gè)溫室梨果番茄作物區(qū)的番茄植株損失和摘取的番茄重量

這些結(jié)果顯示出施用產(chǎn)品與相對(duì)于對(duì)照的植株生產(chǎn)增加之間有明顯趨勢(shì)，其可歸因于對(duì)植株的代謝的刺激效果。此外，經(jīng)處理的植株顯示出粉虱和蚜蟲(chóng)害蟲(chóng)的顯著減少并且從葡萄孢和粉孢子的感染中恢復(fù)。

b.2.對(duì)健康已發(fā)育的番茄植株(Solanum lycopersicum)、辣椒植株(辣椒屬)、南瓜植株(南瓜屬)和黃瓜植株(Cucumis sativus)作物采用菌株XT1進(jìn)行的更長(zhǎng)期盆測(cè)試

使用每種前述物種(番茄(Solanum lycopersicum)、辣椒(辣椒屬)、南瓜(南瓜屬)和黃瓜(Cucumis sativus))的4棵10cm高的幼苗。將其移種到直徑10cm且高15cm的盆中并令其暴露于室溫(15℃至32℃的溫度范圍)。用相同的水量(約100ml)對(duì)所述盆每48h進(jìn)行灌溉。每7天在灌溉后向一半的盆添加5ml的芽孢桿菌屬菌株XT1的培養(yǎng)物的1/100稀釋液。另一半盆用作對(duì)照，因此未對(duì)其進(jìn)行接種。50天后，切下地上部分并干燥。同樣地，記錄葉、花和果實(shí)的數(shù)量以及其高度。所得結(jié)果(平均值)見(jiàn)于下表中。獲得了86％的地上植物重量增加、57.6％的葉數(shù)量增加以及分別為112.5％和137.5％的果實(shí)和花的數(shù)量增加(見(jiàn)表7)。此外，經(jīng)處理的植株的尺寸增加了38.3％。南瓜作物的結(jié)果可見(jiàn)圖7。

表7.XT1在辣椒、黃瓜、番茄和南瓜植株中的灌溉效果。示出平均值。