本發(fā)明涉及一種生物農(nóng)藥技術(shù)領(lǐng)域的制備方法，具體涉及一種用番石榴葉提取物制備抑菌類生物農(nóng)藥的方法。

背景技術(shù)：

番石榴(Psidium guafaVB L。)俗稱拔子、雞矢果、芭樂(lè)、紅心果、喇叭果等，為桃金娘科番石榴屬植物，是常綠小喬木或灌木。原產(chǎn)熱帶美洲和東南亞，現(xiàn)廣泛分布和種植于熱帶、亞熱帶地區(qū)。番石榴是廈門市近年來(lái)發(fā)展較快，經(jīng)濟(jì)效益較好的水果之一。

番石榴鮮葉及帶葉嫩莖的干燥葉在布朗語(yǔ)中稱“麻果”。番石榴葉中含有豐富的黃酮類化合物、酚類化合物、多糖、無(wú)機(jī)元素、揮發(fā)油、皂苷及齊墩果酸與熊果酸等多種功能成分。我國(guó)民間常用番石榴葉及其提取物治療急性或慢性腸炎、痢疾等疾病。中醫(yī)認(rèn)為：番石榴葉，性平，味干澀，入脾、胃、大腸、肝經(jīng)，具有生津止渴、除煩、收斂止瀉、消炎止血、止癢、驅(qū)蟲等功用。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究認(rèn)為：番石榴葉具有降血糖、抗氧化、抗病毒、抗菌、抗傷害感受等藥理學(xué)作用。

國(guó)內(nèi)外對(duì)番石榴葉有效成分的研究大多集中于研究其在醫(yī)學(xué)上的作用。雷琦等用牛津杯法做抑菌實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明番石榴葉和果實(shí)的水提、醇粗提液對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、陰溝腸桿菌、血溶葡萄球等均有很好的抑菌效果；葉和果實(shí)總黃酮提取液的抑菌作用也很明顯。番石榴果實(shí)和葉片的提取物可使食源性病原菌株系的存活量和生長(zhǎng)量顯著降低。蔡玲斐等應(yīng)用瓊脂打孔擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)和試管稀釋法，測(cè)定番石榴葉提取物對(duì)11種常見細(xì)菌的抑菌效果，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)相同濃度的番石榴葉提取物比魚腥草注射液抑菌效果強(qiáng)。

番石榴葉在農(nóng)業(yè)上作為植物源農(nóng)藥的應(yīng)用未見報(bào)道。開發(fā)番石榴葉為新的植物源農(nóng)藥，能夠減少有機(jī)農(nóng)藥殘留給人們生活不良影響。

植物源農(nóng)藥又稱植物性農(nóng)藥。利用植物資源開發(fā)的農(nóng)藥。包括從植物中提取的活性成分、植物本身和按活性結(jié)構(gòu)合成的化合物及衍生物。植物源農(nóng)藥來(lái)源于自然，能在自然界 降解，一般不會(huì)污染環(huán)境及農(nóng)產(chǎn)品，在環(huán)境和人體中積累毒性的可能性不大，對(duì)人和牲畜相對(duì)安全，病害蟲對(duì)其難以產(chǎn)生抗體，具有低毒、低殘留的特點(diǎn)，能夠保持農(nóng)產(chǎn)品的高品質(zhì)，再加上使用成本低等，優(yōu)點(diǎn)越來(lái)越受到人們的重視與青睞。在全世界面臨人口迅速增長(zhǎng)、環(huán)境污染壓力日趨嚴(yán)重的今天，更深入、更廣泛的研究和開發(fā)安全、無(wú)毒、來(lái)源廣、成本低的植物源農(nóng)藥具有重要的經(jīng)濟(jì)意義、生態(tài)意義和社會(huì)意義。

我國(guó)是研究應(yīng)用植物源農(nóng)藥最早的國(guó)家，早在二十世紀(jì)30年代，我國(guó)曾對(duì)煙草、魚藤、巴豆、百部等植物進(jìn)行過(guò)廣泛的研究。進(jìn)入80年代后，更多的研究者投身于有應(yīng)用前途的植物源農(nóng)藥的研究開發(fā)，其中許多種類具有殺蟲(菌)作用或已被作為植物源農(nóng)藥利用。目前有煙堿、苦參堿、楝素、茴蒿素和茶皂素等18種植物源農(nóng)藥已登記注冊(cè)，生產(chǎn)廠家達(dá)46家。

在國(guó)外，根據(jù)EPA統(tǒng)計(jì)資料，至1999年末，美國(guó)已有187種生物源農(nóng)藥的活性成分約700個(gè)產(chǎn)品登記注冊(cè)，微生物源農(nóng)藥居多，植物源農(nóng)藥較少；1999年接收生物農(nóng)藥登記的品種為21個(gè)，其中植物源農(nóng)藥5個(gè)；2001年接收了58種生物農(nóng)藥的登記，其中28種屬于植物源農(nóng)藥，在品種比例上，植物源農(nóng)藥首次超過(guò)微生物源農(nóng)藥。日本著重研究植物源農(nóng)藥的化學(xué)成分如苦參的分離、提純、分子結(jié)構(gòu)的鑒定，從而找到新品種的植物源農(nóng)藥。因此，對(duì)植物源農(nóng)藥的有效化學(xué)成分的提純、分子結(jié)構(gòu)的鑒定和理化性質(zhì)的研究是重要的研究方向。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提出一種用番石榴葉提取物制備抑菌類生物農(nóng)藥的方法，使其對(duì)蔬菜常見真菌病害有較高的預(yù)防效果，且具有無(wú)公害、無(wú)污染和無(wú)殘毒的特點(diǎn)，避免了化學(xué)農(nóng)藥的危害。

本發(fā)明提供的技術(shù)方案如下：

一種用番石榴葉提取物制備抑菌類生物農(nóng)藥的方法，包括以下步驟：

A、番石榴葉的初級(jí)加工，將番石榴葉干燥并粉碎；

B、番石榴葉的提取物制備

(1)粗提：將經(jīng)過(guò)初級(jí)加工后的番石榴葉粉，70-90℃加熱，10-90％乙醇為提取劑， 料液比為10-30倍，加熱回流提取2-4h；制取番石榴葉黃酮的提取液；

(2)精提：按以上提取工藝反復(fù)提取2-3次，直至基本將番石榴葉粉中的有效成分提取完畢；

C、番石榴葉提取液的濃縮

(1)離心：將番石榴葉提取液倒入離心儀，用3000-6000轉(zhuǎn)，離心5-15分鐘，收集上清液；

(2)濃縮：將上步獲得的上清液倒入真空濃縮旋蒸儀中，水浴40-60℃；將其濃縮至膏狀，即得番石榴葉膏狀提取物；

D、脫脂

(1)將番石榴葉膏加入0.5-3倍體積的石油醚，經(jīng)過(guò)20-40分鐘超聲，再用搖床震蕩50-70分鐘，最后離心，移去石油醚層；

(2)重復(fù)(1)步操作2-3次，得到脫脂番石榴葉膏；

E、烘干磨粉

將脫脂番石榴葉膏用烘箱，烘干至水分小于10％。研磨得番石榴葉提取液干粉；

F、將干粉配制成農(nóng)藥。

在本發(fā)明的較佳實(shí)施例中，步驟A包括如下步驟：

(1)干燥：取收集來(lái)的成熟番石榴葉采用日光晾曬或烘干方法進(jìn)行干燥至含水分≤10％；

(2)去雜：將經(jīng)過(guò)干燥后的番石榴葉經(jīng)振動(dòng)分揀篩處理、分離，濾去雜質(zhì)；

(3)粉碎：將經(jīng)過(guò)以上工藝加工的符合標(biāo)準(zhǔn)的番石榴葉進(jìn)行粉碎，粉碎過(guò)80目篩。

在本發(fā)明的較佳實(shí)施例中，步驟C還包括：(3)回收：采用濃縮設(shè)備上的酒精回收裝置，將酒精回收后經(jīng)酒精檢測(cè)儀檢測(cè)≥80％時(shí)，可作為提取溶劑繼續(xù)待用，如果達(dá)不到以上標(biāo)準(zhǔn)，可以單獨(dú)用濃縮設(shè)備將其濃縮，達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)以后收集待用。

在本發(fā)明的較佳實(shí)施例中，步驟D還包括：(3)將(1)移去的石油醚層收集后，用真空濃縮旋蒸儀回收石油醚。

在本發(fā)明的較佳實(shí)施例中，步驟E的烘干溫度為40-70℃。

在本發(fā)明的較佳實(shí)施例中，步驟F為將干粉配置為大于15mg/ml的水溶液，優(yōu)選為20-150mg/ml的水溶液。

由上述描述可知，本發(fā)明提供了一種番石榴葉提取物制備抑菌類生物農(nóng)藥的方法，番石榴葉通過(guò)初級(jí)加工、制備提取物、濃縮。制粉等步驟，獲得干粉。該干粉可配置成15-150mg/ml的水溶液，用于防治植物尤其是蔬菜的病菌。

附圖說(shuō)明

圖1為番石榴葉提取液干粉5mg/ml對(duì)4種病原菌物菌絲生長(zhǎng)的毒力；A茄子白絹病菌；B甘藍(lán)黑斑病菌；C白菜炭疽病菌；D黃瓜枯萎病菌；圖片中左為對(duì)照。

圖2為番石榴葉提取液干粉10mg/ml對(duì)4種病原菌物菌絲生長(zhǎng)的毒力；A茄子白絹病菌；B甘藍(lán)黑斑病菌；C白菜炭疽病菌；D黃瓜枯萎病菌，圖片中左為對(duì)照。

圖3為番石榴葉提取液干粉20mg/ml對(duì)4種病原菌物菌絲生長(zhǎng)的毒力；A茄子白絹病菌；B甘藍(lán)黑斑病菌；C白菜炭疽病菌；D黃瓜枯萎病菌，圖片中左為對(duì)照。

圖4為番石榴葉提取液干粉40mg/ml對(duì)4種病原菌物菌絲生長(zhǎng)的毒力；A茄子白絹病菌；B甘藍(lán)黑斑病菌；C白菜炭疽病菌；D黃瓜枯萎病菌，圖片中左為對(duì)照。

圖5為番石榴葉提取液干粉80mg/ml對(duì)4種病原菌物菌絲生長(zhǎng)的毒力；A茄子白絹病菌；B甘藍(lán)黑斑病菌；C白菜炭疽病菌；D黃瓜枯萎病菌，圖片中左為對(duì)照。

具體實(shí)施方式

制備例1

A、番石榴葉的初級(jí)加工

(1)干燥：取收集來(lái)的成熟番石榴葉采用日光晾曬方法進(jìn)行干燥至含水分≤10％；

(2)去雜：將經(jīng)過(guò)干燥后的番石榴葉經(jīng)振動(dòng)分揀篩處理、分離，濾去雜質(zhì)；

(3)粉碎：將經(jīng)過(guò)以上工藝加工的符合標(biāo)準(zhǔn)的番石榴葉進(jìn)行粉碎，粉碎過(guò)80目篩；

B、番石榴葉的提取物制備

(1)粗提：將經(jīng)過(guò)初級(jí)加工后的番石榴葉粉，80℃加熱，80％乙醇為提取劑，料液比為20倍，加熱回流提取3h。制取番石榴葉黃酮的提取液；

(2)精提：按以上提取工藝反復(fù)提取2次，直至基本將番石榴葉粉中的有效成分提取完畢；

C、番石榴葉提取液的濃縮

(1)離心：將番石榴葉提取液倒入離心儀，用4000轉(zhuǎn)，離心10分鐘，收集上清液。

(2)濃縮：將上步獲得的上清液倒入真空濃縮旋蒸儀中，水浴50℃。將其濃縮至膏狀，即得番石榴葉膏狀提取物。

(3)回收：采用濃縮設(shè)備上的酒精回收裝置，將酒精回收后經(jīng)酒精檢測(cè)儀檢測(cè)≥80％時(shí)，可作為提取溶劑繼續(xù)待用，如果達(dá)不到以上標(biāo)準(zhǔn)，可以單獨(dú)用濃縮設(shè)備降其濃縮達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)以上后收集待用。

D、脫脂

(1)將番石榴葉膏加入1倍體積的石油醚，經(jīng)過(guò)30分鐘超聲，再用搖床震蕩60分鐘，最后離心，移去石油醚層。

(2)重復(fù)(1)步操作2次，得到脫脂番石榴葉膏

(3)將(1)步移去的石油醚層收集后，用真空濃縮旋蒸儀回收石油醚。

F、烘干磨粉

將脫脂番石榴葉膏用烘箱，恒溫60℃，烘干。水分小于10％。研磨得番石榴葉提取液干粉。

制備例2

A、番石榴葉的初級(jí)加工

(1)干燥：取收集來(lái)的成熟番石榴葉采用日光晾曬進(jìn)行干燥至含水分≤10％；

(2)去雜：將經(jīng)過(guò)干燥后的番石榴葉經(jīng)振動(dòng)分揀篩處理、分離，濾去雜質(zhì)；

(3)粉碎：將經(jīng)過(guò)以上工藝加工的符合標(biāo)準(zhǔn)的番石榴葉進(jìn)行粉碎，粉碎過(guò)100目篩；

B、番石榴葉的提取物制備

(1)粗提：將經(jīng)過(guò)初級(jí)加工后的番石榴葉粉，75℃加熱，70％乙醇為提取劑，料液比為25倍，加熱回流提取4h。制取番石榴葉黃酮的提取液；

(2)精提：按以上提取工藝反復(fù)提取2次，直至基本將番石榴葉粉中的有效成分提取完畢；

C、番石榴葉提取液的濃縮

(1)離心：將番石榴葉提取液倒入離心儀，用5000轉(zhuǎn)，離心5分鐘，收集上清液。

(2)濃縮：將上步獲得的上清液倒入真空濃縮旋蒸儀中，水浴40℃。將其濃縮至膏狀，即得番石榴葉膏狀提取物。

(3)回收：采用濃縮設(shè)備上的酒精回收裝置，將酒精回收后經(jīng)酒精檢測(cè)

儀檢測(cè)≥80％時(shí)，可作為提取溶劑繼續(xù)待用，如果達(dá)不到以上標(biāo)準(zhǔn)，可以單獨(dú)用濃縮設(shè)備降其濃縮達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)以上后收集待用。

D、脫脂

(1)將番石榴葉膏加入2倍體積的石油醚，經(jīng)過(guò)20分鐘超聲，再用搖床震蕩60分鐘，最后離心，移去石油醚層。

(2)重復(fù)(1)步操作2次，得到脫脂番石榴葉膏

(3)將(1)步移去的石油醚層收集后，用真空濃縮旋蒸儀回收石油醚。

F、烘干磨粉

將脫脂番石榴葉膏用烘箱，恒溫50℃，烘干至水分小于10％。研磨得番石榴葉提取液干粉。

實(shí)施例3

A、番石榴葉的初級(jí)加工

(1)干燥：取收集來(lái)的成熟番石榴葉采用日光晾曬進(jìn)行干燥至含水分≤10％；

(2)去雜：將經(jīng)過(guò)干燥后的番石榴葉經(jīng)振動(dòng)分揀篩處理、分離，濾去雜質(zhì)；

3)粉碎：將經(jīng)過(guò)以上工藝加工的符合標(biāo)準(zhǔn)的番石榴葉進(jìn)行粉碎，粉碎過(guò)80目篩；

B、番石榴葉的提取物制備

(1)粗提：將經(jīng)過(guò)初級(jí)加工后的番石榴葉粉，70℃加熱，60％乙醇為提取劑，料液比為15倍，加熱回流提取2h。制取番石榴葉黃酮的提取液；

(2)精提：按以上提取工藝反復(fù)提取3次，直至基本將番石榴葉粉中的有效成分提取完畢；

C、番石榴葉提取液的濃縮

(1)離心：將番石榴葉提取液倒入離心儀，用3000轉(zhuǎn)，離心15分鐘，收集上清液。

(2)濃縮：將上步獲得的上清液倒入真空濃縮旋蒸儀中，水浴45℃。將其濃縮至膏狀，即得番石榴葉膏狀提取物。

(3)回收：采用濃縮設(shè)備上的酒精回收裝置，將酒精回收后經(jīng)酒精檢測(cè)

儀檢測(cè)≥80％時(shí)，可作為提取溶劑繼續(xù)待用，如果達(dá)不到以上標(biāo)準(zhǔn)，可以單獨(dú)用濃縮設(shè)備降其濃縮達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)以上后收集待用。

D、脫脂

(1)將番石榴葉膏加入1倍體積的石油醚，經(jīng)過(guò)30分鐘超聲，再用搖床震蕩60分鐘，最后離心，移去石油醚層。

(2)重復(fù)(1)步操作2次，得到脫脂番石榴葉膏

(3)將(1)步移去的石油醚層收集后，用真空濃縮旋蒸儀回收石油醚。

F、烘干磨粉

將脫脂番石榴葉膏用烘箱，恒溫50℃，烘干至水分小于10％。研磨得番石榴葉提取液干粉。

實(shí)施例4番石榴葉粗提取液不同濃度對(duì)4種蔬菜真菌病害室內(nèi)抑菌實(shí)驗(yàn)：

1.番石榴葉粗提取液不同濃度抑制病原菌菌絲生長(zhǎng)的毒力作用

取實(shí)施例1的干粉，配制成不同濃度的水溶液，分別為5mg、10mg、20mg、40mg、80mg/ml。番石榴葉提取物干粉系列濃度梯度對(duì)4種病原菌物菌絲生長(zhǎng)的毒力測(cè)定結(jié)果見圖1至圖5以及表1，結(jié)果表明，番石榴葉提取液對(duì)4種病原菌物菌絲生長(zhǎng)的毒力強(qiáng)弱依次為黃瓜枯萎病菌、白菜炭疽病菌、茄子白絹病菌、甘藍(lán)黑斑病菌，其中對(duì)黃瓜枯萎病菌毒力最強(qiáng)，Ec50為14.2mg/ml。

表1番石榴葉提取液干粉對(duì)4種病原菌物菌絲生長(zhǎng)的毒力

實(shí)施例5白菜的田間防治試驗(yàn)

1、試驗(yàn)設(shè)計(jì)：3個(gè)處理：番石榴葉提取物液干粉、50％多菌靈，以清水為對(duì)照，每個(gè)處理種植20株，重復(fù)3次，共60株。

2、試驗(yàn)濃度：番石榴葉提取物液干粉0.1g/ml、50％多菌靈800倍。

3、方法試驗(yàn)：待新葉尚未發(fā)病時(shí)，進(jìn)行噴藥試驗(yàn)，共施藥3次，間隔7天，于最后一次施藥后30天進(jìn)行調(diào)查。

4、試驗(yàn)結(jié)果：CK發(fā)病11株，發(fā)病率為18.3％；番石榴葉提取物液干粉發(fā)病2株，發(fā)病率為3.3％，番石榴葉粗提液干粉的防治效果為(18.3-3.3)/18.3＝82％；50％多菌靈發(fā)病0株，發(fā)病率0，50％多菌靈的防治效果100％。