一種黃麻的組織培養(yǎng)快繁方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種黃麻的組織培養(yǎng)快繁方法，即以莖尖為外植體建立了黃麻離體快繁體系，為黃麻轉(zhuǎn)基因育種提供實(shí)驗(yàn)材料。本發(fā)明以莖尖為外植體，通過愈傷組織誘導(dǎo)、分化培養(yǎng)、不定芽誘導(dǎo)、根苗誘導(dǎo)以及試管苗馴化移栽等過程實(shí)現(xiàn)了黃麻的組織培養(yǎng)快速繁殖，對黃麻轉(zhuǎn)基因研究具有重要的應(yīng)用價(jià)值。
【專利說明】 一種黃麻的組織培養(yǎng)快繁方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)生物技術(shù)中植物組織培養(yǎng)的方法，具體地說，涉及一種黃麻的組織培養(yǎng)快繁方法。

【背景技術(shù)】
[0002]黃麻是椴樹科黃麻屬一年生草本韌皮纖維作物，也是世界上重要的長纖維作物之一，是麻紡工業(yè)的重要原料，世界上黃麻的產(chǎn)量和種植面積僅次于棉花。黃麻具纖維產(chǎn)量高，吸濕性強(qiáng)、透氣性好等優(yōu)點(diǎn)。
[0003]在其他麻類作物的離體快速繁殖、原生質(zhì)體質(zhì)分離培養(yǎng)、體細(xì)胞胚發(fā)生和器官發(fā)生等組織培養(yǎng)方面已取得了較大的突破，但由于過去黃麻韌皮纖維應(yīng)用范圍僅限于編制麻袋、經(jīng)濟(jì)效益低下，導(dǎo)致對黃麻作物的研究較為滯后，至今為止，尚未見有關(guān)黃麻離體再生體系系統(tǒng)的所道，這嚴(yán)重制約著黃麻遺傳育種研究的發(fā)展。因此，非常有必要建立系統(tǒng)的黃麻離體快繁體系，為今后對黃麻進(jìn)行品質(zhì)遺傳改良奠定基礎(chǔ)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種黃麻的組織培養(yǎng)快繁方法，本發(fā)明以莖尖為外植體，通過愈傷組織誘導(dǎo)、分化培養(yǎng)、不定芽誘導(dǎo)、根苗誘導(dǎo)以及試管苗馴化移栽等過程實(shí)現(xiàn)了黃麻的組織培養(yǎng)快速繁殖，對黃麻轉(zhuǎn)基因研究具有重要的應(yīng)用價(jià)值。
[0005]本發(fā)明的一種黃麻的組織培養(yǎng)快繁方法，包括以下的工藝步驟:
(I)外植體的處理:選取當(dāng)年收飽滿的黃麻種子，以洗潔精水輕輕刷洗，置于自來水中沖洗10?30min，于超凈工作臺(tái)中以75?80%乙醇溶液浸泡10?30s，無菌水沖洗3?5次，再用含有0.01?0.05%吐溫-20的0.1?0.5%升汞溶液消毒5?lOmin，無菌水沖洗3?5次后用無菌濾紙吸干表面的水分，并接種于種子萌發(fā)培養(yǎng)基中于每天光照10?11小時(shí)，光照強(qiáng)度為1500?25001x，培養(yǎng)溫度為25?28°C的條件下培養(yǎng)直至得到無菌苗。
[0006](2)愈傷組織誘導(dǎo):剪取無菌苗莖尖部分約0.2?0.3cm,并接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)，接種后先在25?28°C條件下全暗培養(yǎng)5?10天，然后置于每天光照10?16小時(shí)，光照強(qiáng)度為1500?25001x，培養(yǎng)溫度為25?28°C的條件下培養(yǎng)直至形成愈傷組織。
[0007](3)增殖培養(yǎng):愈傷組織生長至15?25天后，將長勢良好的愈傷組織轉(zhuǎn)接至增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖培養(yǎng)，接種后先在25?28°C條件下全暗培養(yǎng)3?7天，然后置于每天光照12?16小時(shí)，光照強(qiáng)度為2000?30001x，培養(yǎng)溫度為25?28°C的條件下培養(yǎng)，15?20天轉(zhuǎn)接一次。
[0008](4)分化培養(yǎng):將培養(yǎng)至15?20天的長勢良好的愈傷組織轉(zhuǎn)接至分化培養(yǎng)基中進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)，接種后先在25?28°C條件下全暗培養(yǎng)2?5天，然后置于每天光照12?16小時(shí)，光照強(qiáng)度為2000?30001x，培養(yǎng)溫度為25?28°C的條件下培養(yǎng)直至形成不定芽。
[0009](5)生根培養(yǎng):將分化出的不定芽長至2?3cm接種至生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)，接種后先在25?28°C條件下全暗培養(yǎng)7?14天，然后置于每天光照12?16小時(shí)，光照強(qiáng)度為2000?30001x，培養(yǎng)溫度為25?28°C的條件下培養(yǎng)直至長出根。
[0010](6)試管苗移栽:將長至8?1cm的生根試管苗的培養(yǎng)瓶瓶蓋打開并置于自然光照下煉苗5?7天后，將試管苗從培養(yǎng)瓶中取出，洗掉根部培養(yǎng)基，盡量不傷害根部，栽入由黃沙土和火碳泥(I:1)混合成的基質(zhì)中并定植于大田中。
[0011]上述步驟(I)所述的種子萌發(fā)培養(yǎng)基為:MS+ 0.1?0.3mg/LGA3+2.5%?3.5%蔗糖+0.35%?0.5%瓊脂+0.05%?0.1%活性炭，pH值為5.4?5.8。
[0012]上述步驟(2)所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:MS+0.1?1.0mg/L TDZ+1.0?2.0mg/LNAA+2.5% ?3.5% 蔗糖 +0.35% ?0.5% 瓊脂 +0.05% ?0.1% 活性炭，pH 值為 5.4 ?5.8。
[0013]上述步驟(3)所述的增殖培養(yǎng)基為:MS+0.1?1.0mg/L NAA+1.0?2.0mg/L6-BA+2.5% ?3.5% 蔗糖 +0.35% ?0.5% 瓊脂 +0.05% ?0.1% 活性炭，pH 值為 5.4 ?5.8。
[0014]上述步驟(4)所述的分化培養(yǎng)基為:MS+1?2mg/L 6-BA+0.1?0.5mg/LNAA+100 ?200mg/L HC+2.0% ?2.5% 蔗糖 +0.4% ?0.6% 瓊脂 +0.05% ?0.1% 活性炭，pH值為5.4?5.8。
[0015]上述步驟(5)所述的生根培養(yǎng)基為:MS+0.1?0.5mg/L 6-BA+1?2mg/LNAA+2.0% ?2.5% 蔗糖 +0.4% ?0.6% 瓊脂 +0.05% ?0.1% 活性炭，pH 值為 5.4 ?5.8。
[0016]目前尚未見有關(guān)黃麻離體再生體系系統(tǒng)的所道，這嚴(yán)重制約著黃麻遺傳育種研究的發(fā)展。因此，本發(fā)明的實(shí)施可為今后對黃麻進(jìn)行品質(zhì)遺傳改良奠定基礎(chǔ)。

【具體實(shí)施方式】
[0017]以下實(shí)施例是對本發(fā)明的進(jìn)一步說明，不是對本發(fā)明的限制。
[0018]實(shí)施例1
(I)外植體的處理:選取當(dāng)年收飽滿的黃麻種子，以洗潔精水輕輕刷洗，置于自來水中沖洗lOmin，于超凈工作臺(tái)中以75%乙醇溶液浸泡10s，無菌水沖洗3次，再用含有0.01%吐溫-20的0.1%升汞溶液消毒5min，無菌水沖洗3次后用無菌濾紙吸干表面的水分，并接種于種子萌發(fā)培養(yǎng)基中于每天光照10小時(shí)，光照強(qiáng)度為1500x，培養(yǎng)溫度為25°C的條件下培養(yǎng)直至得到無菌苗，所述的萌發(fā)培養(yǎng)基為:MS+ 0.lmg/LGA3+2.5%蔗糖+0.35%瓊脂+0.05%活性炭，PH值為5.8。
[0019](2)愈傷組織誘導(dǎo):剪取無菌苗莖尖部分約0.2?0.3cm,并接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)，接種后先在25°C條件下全暗培養(yǎng)5天，然后置于每天光照10小時(shí)，光照強(qiáng)度為15001x，培養(yǎng)溫度為25°C的條件下培養(yǎng)35天即可形成愈傷組織，愈傷組織誘導(dǎo)率為85%。所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:MS+0.lmg/L TDZ+1.0mg/L NAA+2.5%蔗糖+0.35%瓊脂+0.05%活性炭，pH值為5.8。
[0020](3)增殖培養(yǎng):愈傷組織生長至15天后，將長勢良好的愈傷組織轉(zhuǎn)接至增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖培養(yǎng)，接種后先在25°C條件下全暗培養(yǎng)5天，然后置于每天光照12小時(shí)，光照強(qiáng)度為20001x，培養(yǎng)溫度為25°C的條件下培養(yǎng)，15天轉(zhuǎn)接一次。所述的增殖培養(yǎng)基為:MS+0.lmg/L NAA+1.0mg/L 6-BA+2.5% 蔗糖 +0.35% 瓊脂 +0.05% 活性炭，pH 值為 5.8。
[0021](4)分化培養(yǎng):將培養(yǎng)至15天的長勢良好的愈傷組織轉(zhuǎn)接至分化培養(yǎng)基中進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)，接種后先在25°C條件下全暗培養(yǎng)3天，然后置于每天光照12小時(shí)，光照強(qiáng)度為20001x，培養(yǎng)溫度為25V的條件下培養(yǎng)18天即可形成不定芽。所述的分化培養(yǎng)基為:MS+lmg/L 6-BA+0.lmg/L NAA+100mg/L HC+2.0% 蔗糖+0.4% 瓊脂+0.05% 活性炭，pH 值為
5.8。
[0022](5)生根培養(yǎng):將分化出的不定芽長至2?3cm接種至生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)，接種后先在25°C條件下全暗培養(yǎng)9天，然后置于每天光照12小時(shí)，光照強(qiáng)度為20001x，培養(yǎng)溫度為25°C的條件下培養(yǎng)14天即長出根。
[0023](6)試管苗移栽:將長至8?1cm的生根試管苗的培養(yǎng)瓶瓶蓋打開并置于自然光照下煉苗5天后，將試管苗從培養(yǎng)瓶中取出，洗掉根部培養(yǎng)基，盡量不傷害根部，栽入由黃沙土和火碳泥(I:1)混合成的基質(zhì)中并定植于大田中，移栽成活率達(dá)91%。
[0024]實(shí)施例2
(I)外植體的處理:選取當(dāng)年收飽滿的黃麻種子，以洗潔精水輕輕刷洗，置于自來水中沖洗20min，于超凈工作臺(tái)中以80%乙醇溶液浸泡15s，無菌水沖洗4次，再用含有0.03%吐溫-20的0.5%升汞溶液消毒7min，無菌水沖洗3次后用無菌濾紙吸干表面的水分，并接種于種子萌發(fā)培養(yǎng)基中于每天光照11小時(shí)，光照強(qiáng)度為2000x，培養(yǎng)溫度為28°C的條件下培養(yǎng)直至得到無菌苗，所述的萌發(fā)培養(yǎng)基為:MS+ 0.4mg/LGA3+2.5%蔗糖+0.38%瓊脂+0.1%活性炭，pH值為5.8。
[0025](2)愈傷組織誘導(dǎo):剪取無菌苗莖尖部分約0.2?0.3cm,并接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)，接種后先在28°C條件下全暗培養(yǎng)7天，然后置于每天光照12小時(shí)，光照強(qiáng)度為20001x，培養(yǎng)溫度為28°C的條件下培養(yǎng)37天即可形成愈傷組織，愈傷組織誘導(dǎo)率為88%。所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:MS+0.2mg/L TDZ+1.3mg/L NAA+2.5%蔗糖+0.35%瓊脂+0.05%活性炭，pH值為5.8。
[0026](3)增殖培養(yǎng):愈傷組織生長至15天后，將長勢良好的愈傷組織轉(zhuǎn)接至增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖培養(yǎng)，接種后先在28°C條件下全暗培養(yǎng)6天，然后置于每天光照13小時(shí)，光照強(qiáng)度為25001x，培養(yǎng)溫度為28°C的條件下培養(yǎng)，18天轉(zhuǎn)接一次。所述的增殖培養(yǎng)基為:MS+0.5mg/L NAA+1.2mg/L 6-BA+2.5% 蔗糖 +0.35% 瓊脂 +0.05% 活性炭，pH 值為 5.8。
[0027](4)分化培養(yǎng):將培養(yǎng)至15天的長勢良好的愈傷組織轉(zhuǎn)接至分化培養(yǎng)基中進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)，接種后先在28°C條件下全暗培養(yǎng)4天，然后置于每天光照15小時(shí)，光照強(qiáng)度為25001x，培養(yǎng)溫度為25V的條件下培養(yǎng)20天即可形成不定芽。所述的分化培養(yǎng)基為:MS+1.2mg/L 6-BA+0.4mg/L NAA+180mg/L HC+2.0% 蔗糖 +0.4% 瓊脂 +0.05% 活性炭，pH 值為5.8。
[0028](5)生根培養(yǎng):將分化出的不定芽長至2?3cm接種至生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)，接種后先在28°C條件下全暗培養(yǎng)10天，然后置于每天光照12小時(shí)，光照強(qiáng)度為25001x，培養(yǎng)溫度為28°C的條件下培養(yǎng)17天即長出根。
[0029](6)試管苗移栽:將長至8?1cm的生根試管苗的培養(yǎng)瓶瓶蓋打開并置于自然光照下煉苗7天后，將試管苗從培養(yǎng)瓶中取出，洗掉根部培養(yǎng)基，盡量不傷害根部，栽入由黃沙土和火碳泥(I:1)混合成的基質(zhì)中并定植于大田中，移栽成活率達(dá)93%。
【權(quán)利要求】
1.一種黃麻的組織培養(yǎng)快繁方法，其特征在于包括以下工藝步驟: (1)外植體的處理:選取當(dāng)年收飽滿的黃麻種子，以洗潔精水輕輕刷洗，置于自來水中沖洗10?30min，于超凈工作臺(tái)中以75?80%乙醇溶液浸泡10?30s，無菌水沖洗3?5次，再用含有0.01?0.05%吐溫-20的0.1?0.5%升汞溶液消毒5?lOmin，無菌水沖洗3?5次后用無菌濾紙吸干表面的水分，并接種于種子萌發(fā)培養(yǎng)基中于每天光照10?11小時(shí)，光照強(qiáng)度為1500?25001x，培養(yǎng)溫度為25?28°C的條件下培養(yǎng)直至得到無菌苗； (2)愈傷組織誘導(dǎo):剪取無菌苗莖尖部分約0.2?0.3cm,并接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)，接種后先在25?28°C條件下全暗培養(yǎng)5?10天，然后置于每天光照10?16小時(shí)，光照強(qiáng)度為1500?25001x，培養(yǎng)溫度為25?28°C的條件下培養(yǎng)直至形成愈傷組織； (3)增殖培養(yǎng):愈傷組織生長至15?25天后，將長勢良好的愈傷組織轉(zhuǎn)接至增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖培養(yǎng)，接種后先在25?28°C條件下全暗培養(yǎng)3?7天，然后置于每天光照12?16小時(shí)，光照強(qiáng)度為2000?30001x，培養(yǎng)溫度為25?28°C的條件下培養(yǎng)，15?20天轉(zhuǎn)接一次； (4)分化培養(yǎng):將培養(yǎng)至15?20天的長勢良好的愈傷組織轉(zhuǎn)接至分化培養(yǎng)基中進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)，接種后先在25?28°C條件下全暗培養(yǎng)2?5天，然后置于每天光照12?16小時(shí)，光照強(qiáng)度為2000?30001x，培養(yǎng)溫度為25?28°C的條件下培養(yǎng)直至形成不定芽； (5)生根培養(yǎng):將分化出的不定芽長至2?3cm接種至生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)，接種后先在25?28°C條件下全暗培養(yǎng)7?14天，然后置于每天光照12?16小時(shí)，光照強(qiáng)度為2000?30001x，培養(yǎng)溫度為25?28°C的條件下培養(yǎng)直至長出根； (6)試管苗移栽:將長至8?1cm的生根試管苗的培養(yǎng)瓶瓶蓋打開并置于自然光照下煉苗5?7天后，將試管苗從培養(yǎng)瓶中取出，洗掉根部培養(yǎng)基，盡量不傷害根部，栽入由黃沙土和火碳泥(I:1)混合成的基質(zhì)中并定植于大田中。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種黃麻的組織培養(yǎng)快繁方法，其特征在于步驟(I)所述的種子萌發(fā)培養(yǎng)基為:MS+ 0.1?0.3mg/LGA3+2.5%?3.5%蔗糖+0.35%?0.5%瓊脂+0.05%?0.1%活性炭，pH值為5.4?5.8。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種黃麻的組織培養(yǎng)快繁方法，其特征在于步驟(2)所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:MS+0.1 ?L Omg/L TDZ+1.0 ?2.0mg/L NAA+2.5% ?3.5% 蔗糖 +0.35% ?0.5%瓊脂+0.05%?0.1%活性炭，pH值為5.4?5.8。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種黃麻的組織培養(yǎng)快繁方法，其特征在于步驟(3)所述的增殖培養(yǎng)基為:MS+0.1 ?1.0mg/L NAA+1.0 ?2.0mg/L 6-BA+2.5% ?3.5% 蔗糖 +0.35% ?0.5%瓊脂+0.05%?0.1%活性炭，pH值為5.4?5.8。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種黃麻的組織培養(yǎng)快繁方法，其特征在于步驟(4)所述的分化培養(yǎng)基為:MS+1 ?2mg/L 6-BA+0.1 ?0.5mg/L NAA+100 ?200mg/L HC+2.0% ?2.5%蔗糖+0.4%?0.6%瓊脂+0.05%?0.1%活性炭，pH值為5.4?5.8。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種黃麻的組織培養(yǎng)快繁方法，其特征在于步驟(5)所述的生根培養(yǎng)基為:MS+0.1 ?0.5mg/L 6-BA+1 ?2mg/L NAA+2.0% ?2.5% 蔗糖 +0.4% ?0.6%瓊脂+0.05%?0.1%活性炭，pH值為5.4?5.8。
【文檔編號】A01H4/00GK104285817SQ201410607817
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年11月3日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月3日
【發(fā)明者】楊業(yè)容 申請人:楊業(yè)容