一種干旱誘導(dǎo)型啟動(dòng)子及其應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明一種干旱誘導(dǎo)型啟動(dòng)子及其應(yīng)用屬于基因工程領(lǐng)域，具體涉及DNA重組技術(shù)中一種調(diào)節(jié)基因表達(dá)的非編碼核酸。本發(fā)明提供的啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子的核苷酸序列為SEQIDNO:1。本發(fā)明所述的啟動(dòng)子能夠?yàn)橹参锷锓磻?yīng)器的研發(fā)提供實(shí)驗(yàn)和技術(shù)支撐。利用所述的干旱誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，以植物作為生物反應(yīng)器，表達(dá)疫苗、抗體及其他藥用蛋白等，可突破傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)范疇，延伸到醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種干旱誘導(dǎo)型啟動(dòng)子及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體涉及DNA重組技術(shù)中一種調(diào)節(jié)基因表達(dá)的非編碼 核酸。

【背景技術(shù)】
[0002] 在植物基因工程研究中，使外源目的基因在受體中表達(dá)，以提高作物對(duì)干旱、低 溫、鹽堿以及病蟲(chóng)害等逆境脅迫的抗性，或提高作物品質(zhì)及改良作物農(nóng)藝性狀等，已成為目 前作物育種的一種重要手段。真核生物的基因表達(dá)調(diào)控包括轉(zhuǎn)錄前調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、轉(zhuǎn)錄后 調(diào)控、翻譯調(diào)控和翻譯后調(diào)控。其中，轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控受順式作用元件和轉(zhuǎn)錄因子協(xié)調(diào)作 用，是表達(dá)調(diào)控的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。因此，有關(guān)啟動(dòng)子的分離和研究成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)之一。
[0003] 使用組成型啟動(dòng)子驅(qū)使外源基因表達(dá)，不僅造成資源浪費(fèi)，還直接影響植株的生 長(zhǎng)發(fā)育及正常的生理代謝，而使用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，不僅不會(huì)造成各種資源的浪費(fèi)，又能增強(qiáng) 植物體對(duì)外界的抗性，減少對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育及其他代謝途徑的影響。因此，如何控制外源基 因定時(shí)定量地高效表達(dá)，是基因工程技術(shù)在作物遺傳改良方面有效應(yīng)用的關(guān)鍵所在。除了 尋找有效的目的基因之外，發(fā)現(xiàn)有效控制外源基因表達(dá)的啟動(dòng)子成為基因工程改良中需要 解決的重要問(wèn)題。啟動(dòng)子根據(jù)其功能和作用方式大致分為組成型啟動(dòng)子、組織特異性啟動(dòng) 子和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子三種。組成型啟動(dòng)子調(diào)控的基因表達(dá)不受外界環(huán)境條件的影響，幾乎在 所有植物不同組織中都能表達(dá)。典型的是花椰菜花葉病毒（cauli-flower mosaic virus, CaMV) 35S啟動(dòng)子，被廣泛應(yīng)用于雙子葉植物轉(zhuǎn)基因工程（Benfey等，1990, Science 250， 959-966)。其它單子葉有玉米泛素 Ubiquitin 啟動(dòng)子（Streatfield 等，2004, Transgenic Res 13,299-312)和水稻肌動(dòng)蛋白（Actin)啟動(dòng)子。該類(lèi)啟動(dòng)子活性較高，但由于其導(dǎo) 致外源基因在轉(zhuǎn)基因植物整個(gè)生長(zhǎng)時(shí)期的不同部位表達(dá)，影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育和正常生 理代謝，有些產(chǎn)物可能造成毒害作用，不利于品質(zhì)和產(chǎn)量的提高，甚至?xí)?dǎo)致植物的死亡。 Kasuga等利用誘導(dǎo)型rd29A啟動(dòng)子代替CaMV35S啟動(dòng)子轉(zhuǎn)化擬南芥，提高了轉(zhuǎn)基因擬 南芥的抗旱性，同時(shí)減少了組成型過(guò)表達(dá)造成的植株生長(zhǎng)停滯或矮化現(xiàn)象的發(fā)生（Kasuga， 2004, Plant and Cell Physiology 45，346-350)。因此，為了更好地調(diào)控植物基因的表 達(dá)，組織特異型啟動(dòng)子和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的研究和應(yīng)用越來(lái)越受到人們重視。
[0004] 組織特異型啟動(dòng)子是調(diào)控目的基因只在特定器官或組織中表達(dá)。該類(lèi)啟動(dòng)子一般 存在一些與組織特異性相關(guān)的特異基序。Nitz等從擬南芥中分離得到編碼在根和下胚軸 中特異表達(dá)的黑芥子酶基因 PyklO啟動(dòng)子序列，該啟動(dòng)子能調(diào)控目的基因在轉(zhuǎn)基因擬南 芥根部高水平特異表達(dá)（Nitz等，2001，Plant Science, 161,337-346)。Bate等通過(guò)缺失 突變分析馬鈴薯花特異表達(dá)基因 LAT25的啟動(dòng)子發(fā)現(xiàn)，調(diào)控花粉特異表達(dá)元件位于該基 因啟動(dòng)子-492到-52區(qū)段（Bate等，1998, 37,859-869)。玉米葉片特異性PPCA1啟動(dòng)子 (Gowik 等，2004, Plant Cell 16,1077-1090)、草莓果實(shí)特異性 GalUR 啟動(dòng)子（Agius 等， 2005，J Exp Bot 56,37-46)等。對(duì)該類(lèi)啟動(dòng)子的深入研究有助于闡明植物生長(zhǎng)發(fā)育和 生理代謝的基礎(chǔ)理論，而且具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子是指正常狀態(tài)下不表達(dá)或 低表達(dá)，受到某些物理或化學(xué)信號(hào)的刺激，可以大幅度地提高基因的表達(dá)水平一類(lèi)啟動(dòng)子。 根據(jù)誘導(dǎo)因素，誘導(dǎo)型啟動(dòng)子可分為光誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、溫度誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、損傷誘導(dǎo)型啟動(dòng) 子、激素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子和真菌誘導(dǎo)型啟動(dòng)子等。其特點(diǎn)是：受到物理或化學(xué)因素的誘導(dǎo)；含 有多種功能元件，協(xié)同增強(qiáng)或降低啟動(dòng)子的活性；部分誘導(dǎo)型啟動(dòng)子同時(shí)具有組織特異性 啟動(dòng)子的特點(diǎn)。其他誘導(dǎo)型啟動(dòng)子如水稻質(zhì)膜CaATPase啟動(dòng)子受干旱、寒冷、茉莉酸甲酯 以及脫落酸的誘導(dǎo)（Huda等，2013，PLoS One 8)。擬南芥RBCS-1A啟動(dòng)子是光誘導(dǎo)型啟 動(dòng)子，同時(shí)具有組織特異性（習(xí)雨琳等，2012，作物學(xué)報(bào)38，1561-1569);對(duì)于誘導(dǎo)型啟 動(dòng)子，目的基因只有在接受誘導(dǎo)信號(hào)后才會(huì)表達(dá)，不僅不會(huì)造成各種資源的浪費(fèi)，又能增強(qiáng) 植物體對(duì)外界的抗性，減少對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育及其他代謝途徑的影響。因此，研究和利用誘導(dǎo) 型啟動(dòng)子，對(duì)于研究植物響應(yīng)各種脅迫的生理機(jī)理以及研究農(nóng)作物的抗逆基因工程都有重 要的意義，在基礎(chǔ)研究和植物生物技術(shù)方面也有著廣闊的應(yīng)用前景。然而到目前為止，能應(yīng) 用于轉(zhuǎn)基因研究的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子仍然很少。因此，對(duì)于新的抗逆相關(guān)啟動(dòng)子的克隆、順式 作用元件具體序列的確定、各元件之間的相互作用，以及與這些元件互作的轉(zhuǎn)錄因子的研 究仍然是今后啟動(dòng)子研究的重點(diǎn)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種能在干旱誘導(dǎo)時(shí)啟動(dòng)目的基因表達(dá)的啟動(dòng)子及其應(yīng)用。 本發(fā)明一方面提供了一種啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子的核苷酸序列為SEQ ID N0:1。
[0006] 本發(fā)明還提供了含有上述啟動(dòng)子的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞或重組菌。
[0007] 所述的重組載體是在載體的多克隆位點(diǎn)處插入所述的啟動(dòng)子后得到的重組質(zhì)粒。
[0008] 所述表達(dá)盒由所述的啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子表達(dá)的目的基因，以及轉(zhuǎn)錄終止序列組成； 所述的啟動(dòng)子以功能性方式與所述目的基因連接，且所述目的基因與所述轉(zhuǎn)錄終止序列連 接。
[0009] 本發(fā)明有一個(gè)方面是提供了所述的啟動(dòng)子在啟動(dòng)目的基因于植物表達(dá)中的應(yīng)用。 優(yōu)選是在干旱誘導(dǎo)時(shí)。
[0010] 本發(fā)明還有一個(gè)方面是提供了一種利用所述的啟動(dòng)子培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，包 括如下步驟： 1) 構(gòu)建目的基因重組表達(dá)載體：將目的基因插入到含有所述啟動(dòng)子的重組載體中，干 旱誘導(dǎo)使所述的啟動(dòng)子啟動(dòng)所述目的基因表達(dá)，得到目的基因重組表達(dá)載體； 2) 將步驟1)構(gòu)建的目的基因重組表達(dá)載體導(dǎo)入目的植物中，干旱誘導(dǎo)使所述的啟動(dòng)子 啟動(dòng)所述目的基因表達(dá)，得到表達(dá)所述目的基因的轉(zhuǎn)基因植物。
[0011] 本發(fā)明還有一個(gè)方面是提供了一種使植物在干旱誘導(dǎo)時(shí)表達(dá)目的基因的方法，其 是將目的基因插入到含有所述啟動(dòng)子的重組載體中，并將該重組載體導(dǎo)入目的植物中，然 后干旱誘導(dǎo)目的基因在植物中進(jìn)行表達(dá)。
[0012] 本發(fā)明所述的啟動(dòng)子能夠?yàn)橹参锷锓磻?yīng)器的研發(fā)提供實(shí)驗(yàn)和技術(shù)支撐。利用所 述的干旱誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，以植物作為生物反應(yīng)器，表達(dá)疫苗、抗體及其他藥用蛋白等，可突 破傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)范疇，延伸到醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0013] 圖1 :本發(fā)明啟動(dòng)子/70^構(gòu)建PCR電泳圖。
[0014] 圖2 :本發(fā)明的啟動(dòng)子/70^連接T載體質(zhì)粒酶切鑒定電泳圖。
[0015] 圖3 :本發(fā)明的啟動(dòng)子/70^連接PC0390⑶S酶切鑒定電泳圖。
[0016] 圖4 :干旱誘導(dǎo)條件下，啟動(dòng)子/70^轉(zhuǎn)化煙草葉片的GUS基因組織化學(xué)染色。 [0017] 圖5 :干旱誘導(dǎo)條件下，啟動(dòng)子與對(duì)照的⑶S活性比較。

【具體實(shí)施方式】
[0018] 下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的方法進(jìn)行詳細(xì)的描述，但是以下描述的目的是示例性 的，而不是限制本發(fā)明的范圍。
[0019] 實(shí)施例1 :本發(fā)明所述干旱誘導(dǎo)型啟動(dòng)子/70^的分離 1. 1甜蕎基因組DNA的制備 將帶培養(yǎng)基質(zhì)的甜蕎苗在光照條件為8000LUX，溫度為25°C條件下生長(zhǎng)3周。然后轉(zhuǎn) 入光照條件為8000LUX，接著采用北京艾德萊生物科技有限公司的新型植物基因組DNA快 速提取試劑盒（目錄號(hào)DN15)提取DNA。
[0020] 1. 2啟動(dòng)子的克隆和序列分析 以上面提取的DNA為模板，用PCR方法擴(kuò)增FeDREBl基因上游啟動(dòng)子序列。其擴(kuò)增引 物如下，其上游引物中引入Hind III酶切位點(diǎn)，下游引物中引入Bamh I酶切位點(diǎn)： 上游引物：5'_ CCCAAGCTTAAGGTTCTTTGCAAGTC -3' 下游引物：5'_ GCGGATCCGATCGATCCTGAATATAT -3' PCR反應(yīng)體系

【權(quán)利要求】
1. 一種啟動(dòng)子，其特征在于該啟動(dòng)子的核苷酸序列為SEQ ID NO: 1。
2. 含有如權(quán)利要求1所述啟動(dòng)子的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞或重組菌。
3. 如權(quán)利要求1所述的啟動(dòng)子在啟動(dòng)目的基因于植物表達(dá)中的應(yīng)用。
4. 如權(quán)利要求3所述的啟動(dòng)子在干旱誘導(dǎo)時(shí)啟動(dòng)目的基因于植物表達(dá)中的應(yīng)用。
5. 利用權(quán)利要求1所述的啟動(dòng)子培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括如下步驟： 1) 構(gòu)建目的基因重組表達(dá)載體：將目的基因插入到含有所述啟動(dòng)子的重組載體中，干 旱誘導(dǎo)使所述的啟動(dòng)子啟動(dòng)所述目的基因表達(dá)，得到目的基因重組表達(dá)載體； 2) 將步驟1)構(gòu)建的目的基因重組表達(dá)載體導(dǎo)入目的植物中，干旱誘導(dǎo)使所述的啟動(dòng)子 啟動(dòng)所述目的基因表達(dá)，得到表達(dá)所述目的基因的轉(zhuǎn)基因植物。
6. -種使植物在干旱誘導(dǎo)時(shí)表達(dá)目的基因的方法，其特征在于該方法是將目的基因插 入到含有如權(quán)利要求1所述啟動(dòng)子的重組載體中，并將該重組載體導(dǎo)入目的植物中，然后 干旱誘導(dǎo)目的基因在植物中進(jìn)行表達(dá)。
【文檔編號(hào)】A01H5/00GK104250647SQ201410442242
【公開(kāi)日】2014年12月31日 申請(qǐng)日期:2014年9月2日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月2日
【發(fā)明者】方正武, 劉志雄, 王彩麗, 李曉方 申請(qǐng)人:長(zhǎng)江大學(xué)