一株能降低抗藥性的嗜酸乳桿菌及其制備的生物制劑的制作方法
【專利摘要】一株能降低抗藥性的嗜酸乳桿菌及其制備的生物制劑。本發(fā)明公開嗜酸乳桿菌的新菌株(Lactobacillusacidophilus)XD13R，其保藏號為CCTCCM2014216，該菌株具有減少動物體內(nèi)抗藥性細(xì)菌的比例的能力，可降低動物及人體對多種抗生素的抗藥性。同時，本發(fā)明還公開了該嗜酸乳桿菌XD13R制備的生物制劑及方法，利用該生物制劑喂養(yǎng)畜禽動物可降低動物體內(nèi)對不同抗生素抗藥性細(xì)菌比例30~96%。
CCTCC NO:M2014216
2014.05.22
【專利說明】一株能降低抗藥性的嗜酸乳桿菌及其制備的生物制劑

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及了一株能降低動物抗藥性的嗜酸乳桿菌，尤其涉及一株能減少動物體 內(nèi)抗藥性細(xì)菌比例的嗜酸乳桿菌。本發(fā)明同時還涉及了使用該嗜酸乳桿菌新菌株制備的生 物制劑及方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 在過去的20年里，許多幾乎已經(jīng)銷聲匿跡或普遍認(rèn)為對人類健康不構(gòu)成重大威 脅的疾病好像結(jié)核和肺炎，隨著感染性疾病的爆發(fā)和耐藥菌株的增長及其在全球的重新蔓 延，又一次向全人類的健康布下了蒼白的陰影。事實上，我們正在步入所謂的"后抗生素 時代"--在抗生素被發(fā)現(xiàn)之前，人們經(jīng)歷了無法控制感染類疾病的黑暗時代，而今天，已 經(jīng)有數(shù)種細(xì)菌對幾乎所有抗生素耐藥。中國是世界上濫用抗生素最為嚴(yán)重的國家之一，由 此造成的細(xì)菌耐藥性問題尤為突出，臨床分離的一些細(xì)菌對某些藥物的耐藥性已居世界首 位，尤其值得注意的是，人們對其危害性的了解遠(yuǎn)遠(yuǎn)不足夠。
[0003] 所謂抗藥性又稱耐藥性，是指某種細(xì)菌對某種抗菌藥物反復(fù)接觸后對抗菌藥物的 反應(yīng)降低，對某種抗生素不再敏感，抗生素對它們不再起作用的現(xiàn)象。是由于長期使用抗菌 藥物，應(yīng)用劑量不足時，細(xì)菌通過產(chǎn)生使藥物失活的酶、改變膜通透性阻滯藥物進(jìn)入、改變 靶結(jié)構(gòu)或改變原有代謝過程而產(chǎn)生的。細(xì)菌耐藥性一旦形成，不論感染在哪個人的身上，抗 生素都不能有效的殺滅或抑制它們。因此，耐藥細(xì)菌的危害會對整個人群健康構(gòu)成威脅，而 不是有人理解的那樣："誰濫用，誰受害"。這個科學(xué)道理決非空穴來風(fēng)夸大其詞，潛在的危 害已經(jīng)擺在了我們的面前。照此下去，人類將可能自食其果。
[0004] 不僅如此，更為嚴(yán)重的是耐藥細(xì)菌可以從一個區(qū)域轉(zhuǎn)移到另一個地區(qū)或多個地 區(qū)，從一個國家轉(zhuǎn)移到一個或多個國家，甚至從人傳給動物，動物傳給人，隨著人們交流的 頻繁與便捷，世界經(jīng)濟(jì)全球化的進(jìn)程，人流，物流，信息流更加暢通，耐藥菌種的傳播速度越 來越快，范圍越來越廣，所以，細(xì)菌耐藥性和耐藥性轉(zhuǎn)移已成為全球性的、世紀(jì)性的嚴(yán)肅命 題，已引起各國政府和科學(xué)家的高度重視。
[0005] 為了更好地發(fā)揮抗生素藥物的作用，對付細(xì)菌對抗菌藥物產(chǎn)生抗藥性，現(xiàn)有技術(shù) 的方法是（1)加大抗生素藥物的用藥劑量；（2)交替使用抗生素藥物；（3)對有適應(yīng)證的 動物或病人，藥物種類、用量及使用時間都必須嚴(yán)格控制，能用窄譜的就不要用廣譜抗菌藥 物，能用一種有效的就不必用多種，以避免耐藥性和二重感染；（4)嚴(yán)格掌握抗菌藥物的使 用適應(yīng)證，病毒感染不應(yīng)采用抗菌藥物治療；（5)加快新型抗生素藥物的研制。
[0006] 現(xiàn)有技術(shù)對復(fù)合微生物菌劑的研究和應(yīng)用已經(jīng)十分普遍，這些微生物菌劑有由某 一個屬的多個菌種復(fù)合培養(yǎng)而成，也有由一個或兩個以上的屬中的多個菌種復(fù)合培養(yǎng)而 成，目前應(yīng)用最多的有乳酸菌、酵母、芽胞桿菌、雙歧桿菌等，這些不同配方的復(fù)合微生物菌 劑已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用到畜牧養(yǎng)殖業(yè)、水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)及人體保健等多個【技術(shù)領(lǐng)域】，應(yīng)用最為廣 泛的如乳酸菌制成的酸奶制品，還有EM菌劑、酵素菌、益生菌等等，這些產(chǎn)品的應(yīng)用功能基 本上都定位在用于提高動物及人體的免疫能力，平衡腸道的微生態(tài)菌群結(jié)構(gòu)，改善微生態(tài) 環(huán)境等等，至今所有的生物制劑均未發(fā)現(xiàn)具備降低抗藥性細(xì)菌的比例的能力，無法降低動 物體內(nèi)或人體內(nèi)細(xì)菌對抗生素的抗藥性。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的第一個目的是提供了一株嗜酸乳桿菌的新菌株（Lactobacillus acidophilus) XD13R，其保藏號為CCTCC NO :M 2014216,該菌株具有減少動物體內(nèi)抗藥性 細(xì)菌的比例的能力，可降低動物及人體對多種抗生素的抗藥性。
[0008] 本發(fā)明的第二個目的是提供一種用上述嗜酸乳桿菌XD13R制備的生物制劑，利用 該生物制劑喂養(yǎng)畜禽動物可降低動物體內(nèi)對不同抗生素抗藥性細(xì)菌比例30~96%。
[0009] 本發(fā)明的第三個目的是提供一種用上述嗜酸乳桿菌XD13R制備生物制劑的方法。
[0010] 本發(fā)明的第一個目的提供的嗜酸乳桿菌新菌株（Lactobacillus acidophilus) XD13R，它具有降低動物體內(nèi)抗藥性細(xì)菌的比例的能力。該嗜酸乳桿菌新菌株XD13R已 經(jīng)于2014年5月22日在中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，并收到保藏登記號CCTCC NO :M 2014216。
[0011] 本發(fā)明第二個目的通過以下技術(shù)措施來實現(xiàn)：一種用上述嗜酸乳桿菌XD13R制備 的生物制劑，其由以下方法制備而成： (1) 配制培養(yǎng)基：以蔗糖、蛋白胨、酵母膏、KH2PO4、西紅柿汁和水為主要原料配制培養(yǎng) 基，它們的重量百分比為： 蔗糖2. 0?5. 0%、蛋白胨1. 5?4%、酵母膏0. 5?3%、KH2PO4 0. 2?3%、西紅柿汁:T8%、水余 量； (2) 取嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus) XD13R菌液接種至經(jīng)過高溫滅菌的 所述步驟（1)制備的培養(yǎng)基中，調(diào)整起始PH至5飛.5,在發(fā)酵罐中進(jìn)行厭氧發(fā)酵:T15天，至 終點pH為:T4,即得該嗜酸乳桿菌XD13R制備的生物制劑。
[0012] 本發(fā)明步驟（2)中的嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus) XD13R按照常規(guī) 的從100L種子罐到1000L發(fā)酵罐的發(fā)酵工藝及接種量培養(yǎng)，就可以實現(xiàn)本發(fā)明的目的。但 是作為本發(fā)明的一個實施例，優(yōu)選的嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus) XD13R菌 液在種子罐的接種量在培養(yǎng)基總質(zhì)量的5~10%范圍內(nèi)。
[0013] 所述步驟（2)中嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus) XD13R菌液的制備方 法：接種嗜酸乳桿菌XD13R的新鮮培養(yǎng)物至MRS培養(yǎng)基中，30-40°C培養(yǎng)18?48h即可。
[0014] 本發(fā)明第三個目的通過以下技術(shù)措施來實現(xiàn)：一種用上述嗜酸乳桿菌制備生物制 劑的方法，其包括以下步驟： ⑴培養(yǎng)基的制作：以蔗糖、蛋白胨、酵母膏、KH2PO4、西紅柿汁和水為主要原料配制培 養(yǎng)基，它們的重量百分比為： 蔗糖2. 0?5. 0%、蛋白胨1. 5?4%、酵母膏0. 5?3%、KH2PO4 0. 2?3%、西紅柿汁:T8%、水余 量； (2)取嗜酸乳桿菌XD13R菌液接種至經(jīng)過高溫滅菌的所述步驟（1)制備的培養(yǎng)基中， 調(diào)整起始PH至5飛.5,在發(fā)酵罐中進(jìn)行厭氧發(fā)酵:T15天，至終點pH為:T4,即得該嗜酸乳 桿菌XD13R制備的生物制劑。
[0015] 所述步驟（2)中嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus) XD13R菌液的制備方 法：接種嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus) XD13R的新鮮培養(yǎng)物至裝有MRS培養(yǎng) 基的三角瓶中，在30-40°C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18?48h，獲得XD13R菌液。
[0016] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點： 1?本發(fā)明提供的嗜酸乳桿菌菌株（Lactobacillus acidophilus) XD13R，是非致病 菌，是一種益生菌，該菌株具有減少動物體內(nèi)抗藥性細(xì)菌的比例的能力，可降低動物及人體 對多種抗生素的抗藥性。
[0017] 2.本發(fā)明的嗜酸乳桿菌制備的生物制劑，利用該生物制劑喂養(yǎng)畜禽動物可降低 動物體內(nèi)對不同抗生素抗藥性細(xì)菌比例30~96%，將其應(yīng)用于畜禽養(yǎng)殖中，可以降低養(yǎng)殖動 物對目前常用的多種抗生素的抗藥性，降低常見疫病的治療難度。
[0018] 本發(fā)明的嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus) XD13R 已經(jīng)于 2014年 5 月 22 日在中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，地址：武漢市武昌珞珈山武漢大學(xué)，并收到保藏登記號 (CCTCC NO :M 2014216)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0019] 圖 1 是嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus) XD13R 的 DNA 測序圖。

【具體實施方式】
[0020] 實施例一： 嗜酸乳桿菌XD13R菌株的馴化和篩選：從廣東省微生物研究所菌種保藏中心購買了 4 株芽孢桿菌（XD05B-XD08B)，3株乳酸菌（XD05R-XD07R)，1株酵母（XD05J)，從廣州百佳超市 購買了 2株酵母（XD06J-XD07J)，再從自然界分離篩選了 8株菌斑形態(tài)、菌體形態(tài)均有別于 上述菌株的乳酸菌（XD08-RXD15R)，合計共收集了 4株芽孢桿菌（XD05B-XD08B)，11株乳酸 菌（XD05R-XD15R)，3株酵母（XD05J-XD07J)，然后將它們分別經(jīng)10代高抗藥性細(xì)菌比例的 生豬糞水環(huán)境的誘變培養(yǎng)，最后挑選出能適應(yīng)上述生豬糞水環(huán)境的，能降低抗藥性細(xì)菌比 例的菌株。
[0021] 上述的高抗藥性細(xì)菌比例的生豬糞水：是從十多個養(yǎng)殖場取來新鮮豬糞各15公 斤，按豬糞比水的重量比為1 : 5的比例配制后，濾去糞渣，將糞水分別添加0mg/kg、25mg/ kg、50mg/kg、100mg/kg的鏈霉素和鹽酸林可霉素后，在35度培養(yǎng)箱培養(yǎng)36小時，分別進(jìn)行 細(xì)菌總數(shù)的計數(shù)，將各種抗生素分別添加25mg/kg、50mg/kg、100mg/kg的細(xì)菌總數(shù)除以添 加0mg/kg的對照組的細(xì)菌總數(shù)，得出該糞水中的細(xì)菌在該抗生素該濃度下的抗藥性細(xì)菌 比例，挑選出抗藥性細(xì)菌比例最高的糞水來自清遠(yuǎn)市清城區(qū)沙田養(yǎng)豬場，作為本發(fā)明用于 篩選具有降低抗藥性細(xì)菌比例功能的糞水。
[0022] 上述的降低抗藥性細(xì)菌比例的檢驗方法：將上述方法制成的糞水分別裝入144個 500ml的三角瓶中，分別接種上述的18種菌，每種菌接種8瓶，在35度的培養(yǎng)箱培養(yǎng)8小 時后，分別添加0mg/kg、25mg/kg、50mg/kg、100mg/kg的鏈霉素和鹽酸林可霉素，在35度培 養(yǎng)箱培養(yǎng)36小時，分別進(jìn)行細(xì)菌總數(shù)的計數(shù)，將各種抗生素分別添加25mg/kg、50mg/kg、 100mg/kg的細(xì)菌總數(shù)除以添加0mg/kg的對照組的細(xì)菌總數(shù)，得出該糞水中的細(xì)菌在該抗 生素該濃度下的抗藥性細(xì)菌比例，本發(fā)明首先篩選出具有降低糞水中抗藥性細(xì)菌比例的菌 株，再經(jīng)過上述步驟重復(fù)10次，最終篩選出降低抗藥性細(xì)菌能力最強的菌株為XD13R，對該 菌株我們送華南農(nóng)業(yè)大學(xué)分子遺傳實驗室進(jìn)行DNA測序(見圖1)，結(jié)果證明該菌株是一株 嗜酸乳桿菌的菌株。
[0023] 實施例二： (1)制備嗜酸乳桿菌XD13R菌液：接種嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus) XD13R的新鮮培養(yǎng)物至裝有MRS培養(yǎng)基的1(T20個500ml三角瓶中，在30°C的培養(yǎng)箱中培 養(yǎng)48h，得嗜酸乳桿菌XD13R菌液； ⑵培養(yǎng)基的制作：以蔗糖、蛋白胨、酵母膏、KH2PO4、西紅柿汁和水為主要原料配制培 養(yǎng)基，它們的重量百分比為： 蔗糖4%、蛋白胨2. 5%、酵母膏1%、KH2PO4 1%、西紅柿汁4%、水余量。
[0024] (3)取上述嗜酸乳桿菌XD13R菌液接種至經(jīng)過高溫滅菌的上述培養(yǎng)基中，調(diào)整起 始pH至5飛.5,在發(fā)酵罐中進(jìn)行厭氧發(fā)酵15天，至終點pH為:T4,即得該嗜酸乳桿菌XD13R 制備的生物制劑。
[0025] 實施例三： (1)制備嗜酸乳桿菌XD13R菌液：接種嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus) XD13R的新鮮培養(yǎng)物至裝有MRS培養(yǎng)基的1(T20個500ml三角瓶中，在38°C的培養(yǎng)箱中培 養(yǎng)40h，得嗜酸乳桿菌XD13R菌液； ⑵培養(yǎng)基的制作：以蔗糖、蛋白胨、酵母膏、KH2PO4、西紅柿汁和水為主要原料配制培 養(yǎng)基，它們的重量百分比為： 蔗糖4%、蛋白胨2. 5%、酵母膏1%、KH2PO4 1%、西紅柿汁4%、水余量。
[0026] (3)取上述嗜酸乳桿菌XD13R菌液接種至經(jīng)過高溫滅菌的上述培養(yǎng)基中，調(diào)整起 始pH至5飛.5,在發(fā)酵罐中進(jìn)行厭氧發(fā)酵4天，至終點pH為:T4,即得該嗜酸乳桿菌XD13R 制備的生物制劑。
[0027] 實施例四： (1)制備嗜酸乳桿菌XD13R菌液：接種嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus) XD13R的新鮮培養(yǎng)物至裝有MRS培養(yǎng)基的1(T20個500ml三角瓶中，在40°C的培養(yǎng)箱中培 養(yǎng)18h，得嗜酸乳桿菌XD13R菌液； ⑵培養(yǎng)基的制作：以蔗糖、蛋白胨、酵母膏、KH2PO4、西紅柿汁和水為主要原料配制培 養(yǎng)基，它們的重量百分比為： 蔗糖5%、蛋白胨2%、酵母膏1. 5%、KH2PO4 1. 2%、西紅柿汁6%、水余量。
[0028] (3)取上述嗜酸乳桿菌XD13R菌液接種至經(jīng)過高溫滅菌的上述培養(yǎng)基中，調(diào)整起 始pH至5飛.5,在發(fā)酵罐中進(jìn)行厭氧發(fā)酵5天，至終點pH為:T4,即得該嗜酸乳桿菌XD13R 制備的生物制劑。
[0029] 實施例五： (1)制備嗜酸乳桿菌XD13R菌液：接種嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus) XD13R的新鮮培養(yǎng)物至裝有MRS培養(yǎng)基的1(T20個500ml三角瓶中，在35°C的培養(yǎng)箱中培 養(yǎng)35h，得嗜酸乳桿菌XD13R菌液； ⑵培養(yǎng)基的制作：以蔗糖、蛋白胨、酵母膏、KH2PO4、西紅柿汁和水為主要原料配制培 養(yǎng)基，它們的重量百分比為： 蔗糖5. 0%、蛋白胨4%、酵母膏3%、KH2PO4 3%、西紅柿汁8%、水余量。
[0030] (3)取上述嗜酸乳桿菌菌液接種至經(jīng)過高溫滅菌的上述培養(yǎng)基中，調(diào)整起始pH 至5飛.5,在發(fā)酵罐中進(jìn)行厭氧發(fā)酵10天，至終點pH為:T4,即得該嗜酸乳桿菌XD13R制備 的生物制劑。
[0031] 試驗例一： 以將所篩選出來的嗜酸乳桿菌XD13R菌株制成的生物制劑在廣東省清遠(yuǎn)市清城區(qū) 沙田養(yǎng)豬場、廣東省鶴山市鶴城鎮(zhèn)鄧三輝養(yǎng)豬場，鶴山市源生態(tài)農(nóng)民專業(yè)合作社馬山養(yǎng)殖 場進(jìn)行養(yǎng)殖了 3個批次共90頭肉豬的養(yǎng)殖試驗，試驗的方法是選擇30公斤左右的普通 瘦肉型中豬，將上述實施例三所制成的生物制劑按重量比1 : 50的比例稀釋后每天供生 豬飲用，經(jīng)60-90天的喂養(yǎng)試驗結(jié)果表明，這種生物制劑適口性好，生豬喜歡飲用，安全性 好，沒有出現(xiàn)任何不良反應(yīng)，吃了這種飼料的生豬極少發(fā)病，欄舍內(nèi)的氨氣濃度一直保持在 0-5ppm之間，明顯優(yōu)于國家行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(欄舍內(nèi)氨氣濃度彡30ppm)，生豬糞便中的抗藥性細(xì) 菌比例如表一所示： 表一：

【權(quán)利要求】
1. 一種嗜酸乳桿菌新菌種（Lactobacillus acidophilus) XD13R，其保藏號為CCTCC Μ 2014216,其具有降低動物體內(nèi)抗藥性細(xì)菌的比例的能力。
2. -種用權(quán)利要求1所述的嗜酸乳桿菌制備的生物制劑，其特征在于，包括以下步驟： (1) 配制培養(yǎng)基：以蔗糖、蛋白胨、酵母膏、ΚΗ2Ρ04、西紅柿汁和水為主要原料配制培養(yǎng) 基，它們的重量百分比為： 蔗糖2. (Γ5. 0%、蛋白胨1. 5?4%、酵母膏0. 5?3%、ΚΗ2Ρ04 0. 2?3%、西紅柿汁：Γ8%、水余 量； (2) 取嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus) XD13R菌液接種至經(jīng)過高溫滅菌的 所述步驟（1)制備的培養(yǎng)基中，調(diào)整起始pH至5飛.5,在發(fā)酵罐中進(jìn)行厭氧發(fā)酵:Γ15天，至 終點pH為:Γ4,即得該嗜酸乳桿菌制備的生物制劑。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的嗜酸乳桿菌制備的生物制劑，其特征在于，所述步驟（2)中嗜 酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus) XD13R按照常規(guī)的從100L種子罐到1000L發(fā)酵 罐的發(fā)酵工藝及接種量進(jìn)行培養(yǎng)，所述嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus) XD13R 菌液在種子罐的接種量在培養(yǎng)基總質(zhì)量的5~10%范圍內(nèi)。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的嗜酸乳桿菌制備的生物制劑，其特征在于，所述步驟（2)中嗜 酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus) XD13R菌液的制備方法：接種XD13R的新鮮培養(yǎng) 物至MRS培養(yǎng)基中，30-40°C培養(yǎng)18?48h即可。
5. -種用權(quán)利要求1所述的嗜酸乳桿菌制備生物制劑的方法，其特征在于，包括以下 步驟： (1) 配制培養(yǎng)基：以蔗糖、蛋白胨、酵母膏、ΚΗ2Ρ04、西紅柿汁和水為主要原料配制培養(yǎng) 基，它們的重量百分比為： 蔗糖2. (Γ5. 0%、蛋白胨1. 5?4%、酵母膏0. 5?3%、ΚΗ2Ρ04 0. 2?3%、西紅柿汁：Γ8%、水余 量； (2) 取嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus) XD13R菌液接種至經(jīng)過高溫滅菌的 所述步驟（1)制備的培養(yǎng)基中，調(diào)整起始pH至5飛.5,在發(fā)酵罐中進(jìn)行厭氧發(fā)酵:Γ15天，至 終點pH為:Γ4,即得該嗜酸乳桿菌制備的生物制劑。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的嗜酸乳桿菌制備的生物制劑，其特征在于，所述的步驟（2)中 嗜酸乳桿菌XD13R菌液的接種量在培養(yǎng)基總質(zhì)量的5~10%范圍內(nèi)。
7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的嗜酸乳桿菌制備的生物制劑，其特征在于，所述步驟（2)中嗜 酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus) XD13R菌液的制備方法：接種XD13R的新鮮培養(yǎng) 物至MRS培養(yǎng)基中，30-40°C培養(yǎng)18?48h即可。
【文檔編號】A23K1/16GK104293691SQ201410262552
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年6月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月13日
【發(fā)明者】楊雄 申請人:楊雄