飼用微生態(tài)制劑及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物發(fā)酵【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種飼用微生態(tài)制劑及其制備方法。本發(fā)明制備方法包括以下步驟：（1）配備嗜酸乳桿菌、釀酒酵母菌和枯草芽孢桿菌；（2）固體培養(yǎng)基制備：將一定量以下原料混合均勻：麩皮、蘋果渣、玉米粉、紅糖、磷酸氫二鉀和硫酸銨；進行滅菌后再加水調(diào)節(jié)含水量；（3）接種、發(fā)酵：采用兩次接種、分階段發(fā)酵。本發(fā)明飼用微生態(tài)制劑的微生物菌種生長良好、數(shù)量較多，而且發(fā)酵培養(yǎng)基呈酸香味，適口性強，有利于在飼料添加使用。本發(fā)明制備方法采用二次接種、分階段發(fā)酵，提供良好的物質(zhì)條件和生長環(huán)境。
【專利說明】飼用微生態(tài)制劑及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物發(fā)酵【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種飼用微生態(tài)制劑及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]動物微生態(tài)制劑的研究與應(yīng)用，最早可追溯到1947年，Mollgaard首先發(fā)現(xiàn)使用乳酸桿菌飼喂仔豬，可有效增加體重并改善身體健康。然而，上世紀中后葉正是抗生素研究、生產(chǎn)和使用的黃金時期，使微生態(tài)制劑研究和開發(fā)工作處于低潮。近年來，由于養(yǎng)殖業(yè)中大量使用抗生素和合成藥物，引發(fā)動物源食品的安全隱患及環(huán)境污染，造成嚴重的社會、經(jīng)濟和生態(tài)問題，微生態(tài)制劑又重新成為研究熱點。
[0003]飼用微生態(tài)制劑是作為飼料添加劑直接添加使用的微生態(tài)制劑。它不僅能促進動物胃腸道正常微生物區(qū)系的建立，增強畜禽免疫力，減少疾病的發(fā)生促進生長，提高畜禽日增重，改善畜產(chǎn)品的質(zhì)量，還能產(chǎn)生多種氨基酸、維生素及一些未知促生物質(zhì)；還能刺激腸道內(nèi)免疫功能，及時殺死入侵病菌，又能減少氨及其它腐敗物質(zhì)的產(chǎn)生阻礙有害物質(zhì)及廢物的吸收。
[0004]我國農(nóng)業(yè)部于2008年公布了 16種可直接使用的微生物飼料添加劑菌種，主要以乳酸菌、糞鏈球菌、芽孢桿菌、酵母菌、片球菌和光合細菌等為主。目前，我國許多企業(yè)已實現(xiàn)飼用微生物活菌制劑產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，并在飼料中應(yīng)用，但存在應(yīng)用效果不突出、效果穩(wěn)定性和重復(fù)性差等問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種微生物菌種生長良好、數(shù)量較多，而且發(fā)酵培養(yǎng)基呈酸香味，適口性強，有利于在飼料添加使用的飼用微生態(tài)制劑。
[0006]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:
設(shè)計一種飼用微生態(tài)制劑的制備方法，包括如下步驟:
(1)菌種配備:配備嗜酸乳桿菌不小于3X IO9cfu/L、釀酒酵母菌不小于I X IO8cfu/L、枯草芽孢桿菌不小于6 X IO9 cfu/L ；
(2)固體培養(yǎng)基制備:以重量百分比計，將以下原料混合均勻:麩皮75?85%、蘋果渣10?20%、玉米粉I?3%、紅糖I?3%、磷酸氫二鉀0.2?0.8%和硫酸銨0.3?0.8% ;進行滅菌后再加水調(diào)節(jié)含水量至10?15wt% (重量百分比)；
(3)接種、發(fā)酵:先將嗜酸乳桿菌和釀酒酵母菌菌種按1:0.8?1.2的體積比混合，再按相對于固體培養(yǎng)基25?35wt% (重量百分比)的接種量接種于上述固體培養(yǎng)基，于25?30°C下厭氧發(fā)酵6?8天后，再按相對于固體培養(yǎng)基8?12wt% (重量百分比)的接種量接入枯草芽孢桿菌，于25?30°C下厭氧發(fā)酵2?4天，即得。
[0007]對于上述的用微生態(tài)制劑的制備方法，步驟(2)所述原料配比為:麩皮80%、蘋果渣15%、玉米粉2%、紅糖2%、磷酸氫二鉀0.5%和硫酸銨0.5%。
[0008]對于上述的用微生態(tài)制劑的制備方法，在所述步驟(3)中，接種后的固體培養(yǎng)基在固態(tài)料袋中進行發(fā)酵，所述固態(tài)料袋為帶有向外透氣的單向空氣閥門的塑料袋。
[0009]由以上所述制備方法獲得的飼用微生態(tài)制劑。
[0010]本發(fā)明具有積極有益的效果:
1.本發(fā)明克服傳統(tǒng)的技術(shù)偏見(多菌種同時接種一次發(fā)酵)，采用二次接種、分階段發(fā)酵的制備方法，即先接種嗜酸乳桿菌、釀酒酵母菌進行的厭氧發(fā)酵有利于產(chǎn)酸、抑制有害雜菌的生長、分解有機物質(zhì)，進而為二次接種的枯草芽孢桿菌的繁衍，提供良好的物質(zhì)條件和生長環(huán)境。
[0011]2.所采用固體培養(yǎng)基原料來源廣泛，原料成分配伍合理，有利于有益菌株的生長繁殖。
[0012]3.本發(fā)明方法能使微生物菌株生長良好、數(shù)量多，而且發(fā)酵培養(yǎng)基呈酸香味，適口性強，有利于在飼料添加使用。飼料中添加飼用微生態(tài)制劑，可提高育肥豬日增重，提高飼料轉(zhuǎn)化率。
[0013]4.本發(fā)明微生態(tài)制劑能促進動物腸道正常微生物區(qū)系的建立，增強畜禽免疫力，減少疾病的發(fā)生，促進生長，提高畜禽日增重，改善畜產(chǎn)品的質(zhì)量，還能產(chǎn)生多種氨基酸、維生素及一些未知促生物質(zhì)；還能刺激腸道內(nèi)免疫功能，及時殺死入侵病菌；又能減少氨及其它腐敗物質(zhì)的產(chǎn)生，阻礙有害物質(zhì)及廢物的吸收，減少對養(yǎng)殖環(huán)境的危害。
【具體實施方式】
[0014]以下結(jié)合具體實施例進一步闡述本發(fā)明。下述實施例中所涉及的試驗方法或分析方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法，所用試劑如無特別說明，均為市售。
[0015]實施例1種液制備:
1.菌種來源
嗜酸乳桿菌來源:中國科學(xué)院微生物研究所菌種保藏管理中心CGMCC，植物乳桿菌植物亞種，ASl.2707 ;枯草芽孢桿菌來源:中國科學(xué)院微生物研究所菌種保藏管理中心CGMCC，枯草芽孢桿菌枯草亞種，ASl.2163 ;釀酒酵母菌來源:中國科學(xué)院微生物研究所菌種保藏管理中心CGMCC，釀酒酵母，AS2.3875。
[0016]2.釀酒酵母菌液
2.1斜面菌種:培養(yǎng)基:酵母膏l(xiāng)wt%、蛋白胨2wt%、葡萄糖2wt%、瓊脂2wt%。0.1Mpa滅菌20min，無菌接種，28°C培養(yǎng)48h。
[0017]2.2三角瓶搖床培養(yǎng):培養(yǎng)基:葡萄糖2wt%、尿素0.5wt%、硫酸銨lwt%、酵母膏0.5wt%。0.1Mpa滅菌20min,無菌接種，28°C搖床培養(yǎng)48h,搖床轉(zhuǎn)速140rpm。
[0018]2.3 100L種子罐培養(yǎng):菌種培養(yǎng)基:豆芽汁培養(yǎng)基:取10wt%黃豆芽加水煮沸30min,過濾除去固體部分,添加10wt%鹿糖,定容。0.1Mpa滅菌20min,火焰接種,28°C培養(yǎng)48h,通氣量:0.4vvm。
[0019]2.4 0.5T發(fā)酵罐培養(yǎng):發(fā)酵培養(yǎng)基為豆芽汁培養(yǎng)基，0.1Mpa滅菌20min，28°C培養(yǎng)48h，通氣量:0.5vvm。培養(yǎng)結(jié)束酵母菌細胞濃度大于108cfu/mL。
[0020]3.嗜酸乳桿菌液
3.1培養(yǎng)基:斜面培養(yǎng)基:MRS培養(yǎng)基；
種子培養(yǎng)基:酵母膏0.5wt%、蛋白胨1.25wt%、葡萄糖2.5wt%、牛肉膏2.5wt%、吐溫800.lwt%, pH6.5?7.0。
[0021]3.2發(fā)酵培養(yǎng)基原料
胡蘿卜汁:市售胡蘿卜，加入2倍體積水，用組織搗碎機搗碎，過濾后離心取上清液；西紅柿汁:市售西紅柿，95° C熱燙5min，加入等量水，用組織搗碎機搗碎，過濾后離心取上清液；酵母膏=BR級生化試劑；葡萄糖:食品級；CaC03、KH2P04、K2HP04、Na0H、NaNO3:化學(xué)純。
[0022]3.3緩沖鹽
KH2PO4 lwt%、K2HPO4 lwt%、NaNO3 0.5wt% 配制成混合鹽，再用 NaOH 調(diào) pH 為 6.8。
[0023]3.4發(fā)酵培養(yǎng)基
酵母膏l(xiāng)wt%、葡萄糖1.2wt%、胡蘿卜汁5wt%、西紅柿汁5wt%、KH2PO4 0.05wt%、K2HPO4
0.05wt%,pH6.5?7。
[0024]3.5主要設(shè)備
LDZM-60KCS型立式壓力蒸汽滅菌鍋；BNT-9272A型電熱恒溫培養(yǎng)箱；SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺；FA1104型電子天平；THZ-82B型氣浴恒溫振蕩器；PHS_3C型電子pH計；TP10-20型蠕動泵；50-500L鎮(zhèn)江東方發(fā)酵罐。
[0025]3.6發(fā)酵培養(yǎng)方法
一級搖瓶種子培養(yǎng):取嗜酸乳桿菌斜面菌種接入裝50mL種子培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，置于37°C, 140r/min恒溫振蕩器培養(yǎng)24h。
[0026]二級搖瓶種子培養(yǎng):以5%接種量將一級搖瓶種子接入裝有200mL種子培養(yǎng)基的IOOOmL三角瓶中，置于40°C，140r/min的恒溫振蕩器上培養(yǎng)48h。
[0027]50L自動控制發(fā)酵罐分批補料發(fā)酵培養(yǎng):按發(fā)酵罐實際工作體積30L配制發(fā)酵培養(yǎng)基，0.lMPa，30min滅菌，冷卻至42°C，接入二級搖瓶種子。發(fā)酵培養(yǎng)期間控制空氣流速0.8vvm，攪拌轉(zhuǎn)速160r/min，溫度40°C ;發(fā)酵培養(yǎng)時通過自動流加20%CaC03穩(wěn)定pH6.8?7.0 ;補料的流加方式為三段式:(Tl2h不補料，為分批培養(yǎng)，12?26h補料培養(yǎng)，26?60h不補料。
[0028]3.7活菌總數(shù)測定
采用MRS培養(yǎng)基，梯度稀釋混合平板培養(yǎng)活菌計數(shù)法。通過本試驗證明在50L發(fā)酵罐中，控制生產(chǎn)工藝參數(shù)空氣流速0.8vvm，攪拌轉(zhuǎn)速160r/min，溫度40°C條件下，培養(yǎng)12h后對罐內(nèi)流加補料，補料量為胡蘿卜汁160 mL/L、西紅柿汁160 mL/L、緩沖鹽100mL/L，嗜酸乳桿菌數(shù)量大于3 X 109cfu/mL。
[0029]4.枯草芽孢桿菌液
4.1培養(yǎng)基原料
豆柏粉:市售豆柏，粉碎過40目篩；紅糖:市售；牛肉膏、蛋白胨、葡萄糖:均為BR級生化試劑；KH2P04、K2HP04、Na0H、NaCUMgSO4:化學(xué)純。
[0030]4.2培養(yǎng)基
斜面培養(yǎng)基:牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基；種子培養(yǎng)基:牛肉膏0.5wt%、蛋白胨1.25wt%、葡萄糖 2.5wt% ；pH6.5?7.0。
[0031]4.3復(fù)合鹽
KH2PO4 2wt%、K2HPO4 2wt%、MgSO4 lwt% 配制成混合鹽，再用 NaOH 調(diào) pH 為 6.8。
[0032]4.4發(fā)酵培養(yǎng)基豆柏粉 lwt%、紅糖 1.2wt%、KH2PO4 0.05wt%、K2HPO4 0.05wt%, pH6.5~7。
[0033]4.5主要設(shè)備
LDZM-60KCS型立式壓力蒸汽滅菌鍋；BNT-9272A型電熱恒溫培養(yǎng)箱；SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺；FA1104型電子天平；THZ-82B型氣浴恒溫振蕩器；PHS_3C型電子pH計；TP10-20型蠕動泵；50-500L鎮(zhèn)江東方發(fā)酵罐。
[0034]4.6發(fā)酵培養(yǎng)方法
一級搖瓶種子培養(yǎng):取枯草芽孢桿菌斜面菌種接入裝IOOmL種子培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，置于37°C, 160r/min恒溫振蕩器培養(yǎng)24h。
[0035]二級搖瓶種子培養(yǎng):以2wt%接種量將一級搖瓶種子接入裝有200mL種子培養(yǎng)基的1000mL三角瓶中，置于37°C，140r/min的恒溫振蕩器上培養(yǎng)24h。
[0036]50L自動控制發(fā)酵罐分批補料發(fā)酵培養(yǎng):按發(fā)酵罐實際工作體積30L配制發(fā)酵培養(yǎng)基，0.1MPa, 30min滅菌，冷卻至40°C，接入二級搖瓶種子，接種量為5wt%。發(fā)酵培養(yǎng)期間控制空氣流速1.2vvm，攪拌轉(zhuǎn)速160r/min，溫度37°C ;補料的流加方式為三段式:(Tl2h不補料，為分批培養(yǎng)，12~32h補料培養(yǎng)，32~48h不補料。
[0037]4.6活菌總數(shù)測定
采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，梯度稀釋混合平板培養(yǎng)活菌計數(shù)法。 [0038]通過本試驗證明在50L發(fā)酵罐中，控制生產(chǎn)工藝參數(shù)空氣流速1.2vvm,攪拌轉(zhuǎn)速160r/min，溫度37°C條件下，培養(yǎng)12h后對罐內(nèi)流加補料，補料量為豆柏粉10 g/L、紅糖10g/L、復(fù)合鹽20mL/L，是枯草芽孢桿菌流加補料最佳組合。發(fā)酵培養(yǎng)后，枯草芽孢桿菌數(shù)量大于 6X109cfu/mL。
[0039]實施例2
本實施例飼用微生態(tài)制劑的制備方法，包括如下步驟:
Cl)菌種配備:配備嗜酸乳桿菌32.1 X IO8 cfu/L、釀酒酵母菌I x IO8 cfu/L、枯草芽孢桿菌 6L 5 X IO8 cfu/L ；
(2)固體培養(yǎng)基制備:以重量百分比計，將以下原料混合均勻:麩皮80%、蘋果渣15%、玉米粉2%、紅糖2%、磷酸氫二鉀0.5%和硫酸銨0.5% ;進行滅菌后再加水調(diào)節(jié)含水量至12wt%，分裝至固態(tài)料袋(帶有向外透氣的單向空氣閥門的塑料袋)；
(3)接種、發(fā)酵:先將嗜酸乳桿菌和釀酒酵母菌菌種按1:1的體積比混合，再按相對于固體培養(yǎng)基30wt%的接種量接種于上述固體培養(yǎng)基，于30°C下厭氧發(fā)酵7天后，再按相對于固體培養(yǎng)基10wt%的接種量接入枯草芽孢桿菌，于30°C下厭氧發(fā)酵3天，即得。
[0040]實施例3
本實施例飼用微生態(tài)制劑的制備方法，包括如下步驟:
(1)菌種配備:配備嗜酸乳桿菌3X IO9cfu/L、釀酒酵母菌不小于1.1 X IO8cfu/L、枯草芽孢桿菌不小于6 X IO9 cfu/L ；
(2)固體培養(yǎng)基制備:以重量百分比計，將以下原料混合均勻:麩皮75%、蘋果渣20%、玉米粉1%、紅糖3%、磷酸氫二鉀0.2%和硫酸銨0.8% ;進行滅菌后再加水調(diào)節(jié)含水量至10wt%，分裝至固態(tài)料袋(帶有向外透氣的單向空氣閥門的塑料袋)；
(3)接種、發(fā)酵:先將嗜酸乳桿菌和釀酒酵母菌菌種按1:0.8的體積比混合，再按相對于固體培養(yǎng)基25wt%的接種量接種于上述固體培養(yǎng)基，于25°C下厭氧發(fā)酵8天后，再按相對于固體培養(yǎng)基8wt%的接種量接入枯草芽孢桿菌，于25°C下厭氧發(fā)酵4天，即得。
[0041]實施例4
本實施例飼用微生態(tài)制劑的制備方法，包括如下步驟:
(1)菌種配備:配備嗜酸乳桿菌3.5 X IO9cfu/L、釀酒酵母菌1.5 X IO8cfu/L、枯草芽孢桿菌 6.2 X IO9 cfu/L ；
(2)固體培養(yǎng)基制備:以重量百分比計，將以下原料混合均勻:麩皮85%、蘋果渣10%、玉米粉3%、紅糖1%、磷酸氫二鉀0.7%和硫酸銨0.3% ;進行滅菌后再加水調(diào)節(jié)含水量至15wt%，分裝至固態(tài)料袋(帶有向外透氣的單向空氣閥門的塑料袋)；
(3)接種、發(fā)酵:先將嗜酸乳桿菌和釀酒酵母菌菌種按1:1.2的體積比混合，再按相對于固體培養(yǎng)基35wt%的接種量接種于上述固體培養(yǎng)基，于30°C下厭氧發(fā)酵6天后，再按相對于固體培養(yǎng)基12 wt %的接種量接入枯草芽孢桿菌，于30°C下厭氧發(fā)酵2天，即得。
[0042]實施例5豬場試驗
試驗設(shè)計:試驗采取單因素、多重復(fù)對照試驗法。選取同日齡、體重接近的健康斷奶仔豬120頭，隨機分為6組，其中5個試驗組，I個對照組，每組設(shè)兩個重復(fù)，每個重復(fù)10頭。設(shè)預(yù)飼期7天，預(yù)飼期內(nèi)對豬進行驅(qū)蟲和喂料、飲水、排便習(xí)慣適應(yīng)性訓(xùn)練管理，而后進入正式試驗期。試驗期間，對斷奶后育肥豬進行比對試驗，在試驗組飼料中添加2wt%的本發(fā)明實施例1所得飼用微生態(tài)制劑，在對照組飼料中添加常規(guī)量金霉素，仔豬自由采食、自由飲水，并做好采食量和稱重記錄，試驗期為30天。
[0043]試驗地點:濮陽江都綠色養(yǎng)殖場(生長期)，輝縣市綠寶養(yǎng)殖有限公司(保育期)。
[0044]試驗結(jié)果:兩次試驗平均日增重分別提高0.132kg和0.079kg，料肉比分別降低
0.166和0.3。主要原因是大量有益微生物在豬的消化道內(nèi)和飼料中繁殖時生成大量的生物活性物質(zhì)，特別是維生素和酶，有營養(yǎng)和增強消化的作用。在育肥豬飼料中添加本發(fā)明飼用微生態(tài)制劑能增加豬對常見疾病的抵抗力，減少豬感冒和豬胃腸炎的發(fā)生。微生態(tài)制劑中的微生物能對腸道中的不良代謝產(chǎn)物起到轉(zhuǎn)化和消除作用，特別是減輕尿糞臭味。
[0045]表I濮陽江都綠色養(yǎng)殖場試驗結(jié)果
【權(quán)利要求】
1.一種飼用微生態(tài)制劑的制備方法，其特征在于，包括如下步驟: (1)菌種配備:配備嗜酸乳桿菌不小于3\109(^11/1、釀酒酵母菌不小于1\108(^11/1、枯草芽孢桿菌不小于6 X IO9 cfu/L ； (2)固體培養(yǎng)基制備:以重量百分比計，將以下原料混合均勻:麩皮75~85%、蘋果渣10~20%、玉米粉I~3%、紅糖I~3%、磷酸氫二鉀0.2~0.8%和硫酸銨0.3~0.8% ;進行滅菌后再加水調(diào)節(jié)含水量至10~15wt% ； (3)接種、發(fā)酵:先將嗜酸乳桿菌和釀酒酵母菌菌種按1:0.8~1.2的體積比混合，再按相對于固體培養(yǎng)基25~35wt%的接種量接種于上述固體培養(yǎng)基，于25~30°C下厭氧發(fā)酵6~8天后，再按相對于固體培養(yǎng)基8~12wt%的接種量接入枯草芽孢桿菌，于25~30°C下厭氧發(fā)酵2~4天，即得。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用微生態(tài)制劑的制備方法，其特征在于:步驟(2)所述原料配比為:麩皮80%、蘋果渣15%、玉米粉2%、紅糖2%、磷酸氫二鉀0.5%和硫酸銨0.5%。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用微生態(tài)制劑的制備方法，其特征在于:在所述步驟(3)中，接種后的固體培養(yǎng)基在固態(tài)料袋中進行發(fā)酵，所述固態(tài)料袋為帶有向外透氣的單向空氣閥門的塑料袋。
4.由權(quán)利要求1 ~3任一項所述制備方法制得的飼用微生態(tài)制劑。
【文檔編號】A23K1/175GK103988977SQ201410228604
【公開日】2014年8月20日 申請日期:2014年5月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月28日
【發(fā)明者】楊建平, 趙志軍, 劉永祥, 劉延賀, 胡華鋒 申請人:河南牧業(yè)經(jīng)濟學(xué)院