人工合成的根特異啟動(dòng)子及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及“人工合成的根特異啟動(dòng)子及其應(yīng)用”，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。人工合成的根特異性啟動(dòng)子，命名為SRS1，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO1所示，利用重疊PCR方法添加35S啟動(dòng)子部分區(qū)域及Omega序列，合成的序列為SRSO1，以pCAMB2300.1為基礎(chǔ)載體(含有GUSplus報(bào)告基因)，分別用人工合成的啟動(dòng)子替換pCAMBIA2300.1上的CaMV35S啟動(dòng)子，得到表達(dá)載體p2300.1-SRSO1，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌后，轉(zhuǎn)入煙草中驗(yàn)證，表明啟動(dòng)子SRS1具有根特異性表達(dá)特性。該人工合成的啟動(dòng)子SRS1，豐富了根特異表達(dá)啟動(dòng)子的種類，可用于植物抗蟲(chóng)基因的根部表達(dá)，防治地下害蟲(chóng)。
【專利說(shuō)明】人工合成的根特異啟動(dòng)子及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，特別是涉及根部特異表達(dá)啟動(dòng)子，其克隆、功能驗(yàn)證其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]組織特異性啟動(dòng)子，可以避免蛋白合成的浪費(fèi)，使基因只在某些特定的器官或組織中表達(dá)。目前相繼發(fā)現(xiàn)的組織特異性啟動(dòng)子主要有根部特異、果實(shí)特異、維管組織特異、花粉管特異、韌皮部特異、種子特異和塊莖特異等組織特異啟動(dòng)子，是研究基因功能及表達(dá)特性的重要工具，尤其在植物基因工程育種中發(fā)揮重要作用。
[0003]根是植物體的重要器官，除了吸收土壤中的水分及養(yǎng)分、貯存合成有機(jī)物質(zhì)，還和土壤中的微生物有密切的互作關(guān)系。植物根系容易受地下害蟲(chóng)的啃食，繼而感染根腐病、莖腐病等細(xì)菌真菌病害的幾率增加，造成作物部分產(chǎn)區(qū)的減產(chǎn)絕收。植物抗病蟲(chóng)基因工程的研究已經(jīng)在我國(guó)陸續(xù)的展開(kāi)，根部特異表達(dá)啟動(dòng)子的獲得，對(duì)于保證抗病蟲(chóng)外源基因在作物根中特異、穩(wěn)定、高效表達(dá)及增加轉(zhuǎn)基因生物安全性具有重要意義。目前已克隆到的植物根特異性啟動(dòng)子主要在擬南芥、水稻、煙草、大豆、玉米、松樹(shù)、胡蘿卜、番茄中，這些啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的基因多與根 系分泌、次生代謝有關(guān)。
[0004]在植物基因工程應(yīng)用中，由于所使用的天然啟動(dòng)子與植物內(nèi)源基因啟動(dòng)子存在潛在的同源性，因此可能會(huì)造成外源基因的沉默(Thierry D, Vaucheret H.Sequencehomology requirements for transcriptional silencing of35S transgenes andpost-transcriptional silencing of nitrite reductase(trans)genes by thetobacco2711ocus.Plant Molecular Biology, 1996, 32 (6): 1075-1083.)。而人工合成啟動(dòng)子不存在這一問(wèn)題，可極大程度上避免由于啟動(dòng)子同源性造成的基因沉默。另外，與天然啟動(dòng)子相比，人工啟動(dòng)子可根據(jù)不同目的合成各種組織特異或廣泛誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，從而在基因表達(dá)時(shí)間和空間上進(jìn)行更為精確的調(diào)控(彭舒，黃真池，歐陽(yáng)樂(lè)軍等.植物基因工程中人工啟動(dòng)子的研究進(jìn)展.植物生理學(xué)報(bào)，2011，47 (2):141-146.)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]針對(duì)上述領(lǐng)域中的需求，本發(fā)明合成了兩條啟動(dòng)子序列SRSl和SRS2，通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，人工合成的啟動(dòng)子序列SRSl具有根特異表達(dá)的特性，而SRS2并不具有該特性。該人工合成的根特異啟動(dòng)子SRSl可用于植物地下害蟲(chóng)防治。
[0006]人工合成的根特異性啟動(dòng)子，命名為SRS1，其核苷酸序列如SEQ ID NOl所示。
[0007]合成的啟動(dòng)子，命名為SRS01，其核苷酸序列如SEQ ID N03所示。
[0008]一種表達(dá)載體，其含有上述根特異性啟動(dòng)子SRSl。
[0009]上述表達(dá)載體在轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
[0010]上述人工合成的根特異性啟動(dòng)子在轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
[0011]所述應(yīng)用為將含有該根特異性啟動(dòng)子和抗蟲(chóng)基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入植物中，使其在植物根部表達(dá)該抗蟲(chóng)基因，以防治地下害蟲(chóng)。
[0012]本發(fā)明根據(jù)表達(dá)元件合成了兩個(gè)啟動(dòng)子序列SRS1、SRS2(SEQ ID NOU SEQ IDN02)，利用重疊PCR方法添加35S啟動(dòng)子部分區(qū)域及Omega序列，合成的序列為SRSOl和SRS02 (SEQ ID N03、SEQ ID N04)，以 pCAMB2300.1 為基礎(chǔ)載體(含有⑶Splus 報(bào)告基因)，分別用人工合成的啟動(dòng)子替換PCAMBIA2300.1上的CaMV35S啟動(dòng)子，得到兩個(gè)表達(dá)載體P2300.l-SRS01/p2300.1-SRS02，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌后，轉(zhuǎn)入煙草中驗(yàn)證，表明啟動(dòng)子SRSl具有根特異性表達(dá)特性，而啟動(dòng)子SRS2沒(méi)有根特異表達(dá)的特性。
[0013]該人工合成的啟動(dòng)子SRS1，豐富了根特異表達(dá)啟動(dòng)子的種類，可用于植物抗蟲(chóng)基因的根部表達(dá)，防治地下害蟲(chóng)。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0014]圖1利用重疊PCR合成人工啟動(dòng)子SRSOl，
[0015]其中A:SRS1、35S mini及Ω序列的PCR擴(kuò)增；B:利用重疊PCR合成人工啟動(dòng)子SRSOl ；M:DL500marker ；N:陰性對(duì)照(ddH20) ；1:SRS1 片段的 PCR 擴(kuò)增結(jié)果；2:35S_minipromoter PCR擴(kuò)增結(jié)果；3: Ω序列PCR擴(kuò)增結(jié)果；4:利用重疊PCR合成人工啟動(dòng)子SRSOl，
[0016]圖2p2300-SRS01/p2300.1-SRS02 酶切鑒定，
[0017]其中M:DL15000marker ；1:人工啟動(dòng)子SRSOl 的PCR擴(kuò)增；2:p2300.1-SRSOI/BamHI+Hind III ；3:p2300.l_SRS02/BamH I+Hind III，
[0018]圖 3ρ2300.l_SRS01/p2300.1-SRS02 轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌 LBA4404 的 PCR 鑒定
[0019]其中M:DL500marker ；N:陽(yáng)性對(duì)照(ddH20) ；P:陽(yáng)性對(duì)照(plasmid DNA) ;1、2:P2300.1-SRS01轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌的PCR檢測(cè)結(jié)果；3、4:p2300.1-SRS02轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌的PCR檢測(cè)結(jié)果，
[0020]圖4 轉(zhuǎn) p2300.1-SRS01、ρ2300.1-SRS02 煙草的⑶S 染色結(jié)果，
[0021]其中A:煙草葉片(轉(zhuǎn)化p2300.1-SRS01載體)；Β:根部(轉(zhuǎn)化p2300.1-SRS01載體)；C:煙草葉片(轉(zhuǎn)化p2300.1-SRS02載體)；D:根部(轉(zhuǎn)化p2300.1-SRS02載體)。
【具體實(shí)施方式】
[0022]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。
[0023]下面所涉及的實(shí)驗(yàn)材料均為己公開(kāi)的或市售的材料。
[0024]1、實(shí)驗(yàn)步驟和方法
[0025]1.1人工啟動(dòng)子SRSl和SRS2的構(gòu)建
[0026]人工合成兩條啟動(dòng)子序列SRS1，SRS2，序列交由金維智生物科技(蘇州)有限公司進(jìn)行化學(xué)合成。
[0027]SEQ ID NOl =SRSl:
[0028] aagcttGATTATTTACTCTTGTAAATAAAAGAGAACGTGATTTACTCTTGTAAATAAAAGAGAACGTGACTGTGTA GCACTGTGTACATAACTGTGTACATTTGAAACTGTGTAAAGTTTTATCTTTAGTTTTTAATCTTTACTTTTAATCTTTTA ATAAAGATTAGAGCCTTGAACGGCAAGTTTCACGCTGTCACTTGATAATTAATTCATATTTTAAAAATATTAAATAAATT AATTTTTAATATTTACCAGAAATGATAATTAATTCATATTTTTTTATCAAGCATGCTTCTTGC[0029]SEQ ID N02:SRS2:
[0030]aagcttCCATTAGATCTCTTCAATTTCAAAGAGAATCATCCAAACTCTTCAATTTCAAAGAGATTCCTACTGTGTAAGAC TGTGTATCTAACTGTGTAGAAAGCAAACTGTGTATTGTAATATCTTTGGAATACAATCTTTCAATACGATCTTTATTTAA AGATAAGTTACTTGAACGGCAAGTTTCACGCTGTCACTCCATTATAACAACATATTTATTAAATATTATTTACATTAATA ATTAATATTCAAACATTACGATAATTAATTCATATTTAATTATCAAGCATGCTTCTTGC
[0031]利用重疊PCR方法添加35S啟動(dòng)子部分區(qū)域及Omega序列，合成的序列為SRSOl和SRS02，(見(jiàn)SEQ ID N03、SEQ ID N04)所用到的引物如下，小寫(xiě)部分為所加酶切位點(diǎn):
[0032]proSRSFHl:5’-aagcttGATTATTTACTCTTGTAAAT_3’
[0033]proSRSFH2:5’-aagcttCCATTAGATCTCTTCAATTT_3’
[0034]proSRSRcd:5’-GAAGGATAGTGGGATTGCAAGAAGCATGCTT-3’
[0035]35SminiFcd:5’-AAGCATGCTTCTTGCAATCCCACTATCCTTC-3’
[0036]35SminiRcd:5’-AATTGTTGTAAAAATTCCTCTCCAAATGAAATG-3’
[0037]OmegaFcd:5’-CATTTCATTTGGAGAGGAATTTTTACAACAATT-3’
[0038]OmegaRB:5’-ggatccTGTAATTGTAAATAGTAATTG_3’
[0039]35S啟動(dòng)子部分區(qū)域及Omega序列擴(kuò)增所用引物對(duì)分別為35sminiFcd/35sminiRcd 和 OmegaFcd/OmegaRB, PCR 反應(yīng)體系和反應(yīng)條件如下:
[0040]
【權(quán)利要求】
1.人工合成的根特異性啟動(dòng)子，命名為SRS1，其核苷酸序列如SEQID NOl所示。
2.合成的啟動(dòng)子，命名為SRS01，其核苷酸序列如SEQID N03所示。
3.—種表達(dá)載體,其含有權(quán)利要求1或2所述的啟動(dòng)子。
4.權(quán)利要求3所述表述載體在轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，所述表述載體中含有抗蟲(chóng)基因，將該載體轉(zhuǎn)入植物，使其在植物根部表達(dá)該抗蟲(chóng)基因，以防治地下害蟲(chóng)。
6.權(quán)利要求1或2所述的啟動(dòng)子在轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求6所述應(yīng)用，為將含有權(quán)利要求1或2所述的啟動(dòng)子和抗蟲(chóng)基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入植物中，使 其在植物根部表達(dá)該抗蟲(chóng)基因，以防治地下害蟲(chóng)。
【文檔編號(hào)】A01H5/00GK103966220SQ201410228207
【公開(kāi)日】2014年8月6日 申請(qǐng)日期:2014年5月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月27日
【發(fā)明者】張 杰, 耿麗麗, 遲婧, 束長(zhǎng)龍, 宋福平, 彭琦, 梁影屏 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所