地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和干酪乳桿菌制劑及制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和干酪乳桿菌復(fù)合益生菌制劑的制備及其制備方法，屬于飼料微生物【技術(shù)領(lǐng)域】。所述益生菌劑以豆粕、麩皮、玉米粉為基質(zhì)，利用地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和干酪乳桿菌進行固態(tài)發(fā)酵而成。本發(fā)明的制備方法生產(chǎn)成本低，可以提高經(jīng)濟效益并且操作簡單，可廣泛應(yīng)用于微生態(tài)領(lǐng)域的益生菌固體發(fā)酵技術(shù)；采用混菌固態(tài)發(fā)酵，利用菌株間的互利共棲協(xié)同作用，能提高產(chǎn)率和菌體濃度所得發(fā)酵產(chǎn)品的活菌數(shù)較高，有利于豆粕和玉米粉中的蛋白質(zhì)被分解成小肽和游離氨基酸，利于腸胃的消化吸收。本發(fā)明產(chǎn)品在飼料中添加使用時，此類產(chǎn)品用于奶牛飼喂時能有效提高飼料的利用效率13-25%。
【專利說明】地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和干酪乳桿菌制劑及制備
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于飼料微生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種以豆柏、麩皮和玉米粉為基質(zhì)，以益生菌地衣芽抱桿菌 BL-09 (Bacillus licheniformis BL-09)、枯草芽抱桿菌 HM-66 (Bacillussubtilis HM-66)和干釀乳桿菌 HM-09 (Lactobacillus casei HM-09)為菌種的固態(tài)發(fā)酵技術(shù)，此技術(shù)可廣泛應(yīng)用于動物微生態(tài)等方面。
【背景技術(shù)】
[0002]目前，益生菌制品多采用益生菌直接與液態(tài)牛乳和豆乳發(fā)酵，得到功能性的酸牛奶或者酸豆奶，其余則采用液態(tài)發(fā)酵，直接收集益生菌菌體，制作成益生菌粉劑、片劑或者膠囊。采用液態(tài)發(fā)酵會產(chǎn)生大量的廢水，對環(huán)境污染較大，后處理比較困難，機器設(shè)備操作繁瑣。因此本申請采用地衣芽孢桿菌BL-09、枯草芽孢桿菌HM-66和干酪乳桿菌腿_09混合固態(tài)發(fā)酵豆柏、麩皮和玉米粉，采用固態(tài)發(fā)酵，其生產(chǎn)成本低，投資的資金較少，在下游處理方便，污染小，設(shè)備結(jié)構(gòu)簡單、易操作。采用地衣芽孢桿菌BL-09、枯草芽孢桿菌HM-66和干酪乳桿菌HM-09進行固態(tài)發(fā)酵，可生改善動物飼料的適口性。其蛋白質(zhì)被分解成小肽和游離氨基酸，有利于動物腸胃消化吸收。[0003]中國發(fā)明專利200810175856.7公開了一株具有益生功效的干酪乳桿菌(LACTOBACILLUS CASEI ZHANG)的高密度發(fā)酵技術(shù)，包括增殖培養(yǎng)基和發(fā)酵工藝條件優(yōu)化控制，和該菌株的高活力凍干菌粉的制備技術(shù)。通過本發(fā)明可以得到1011CFU/ML以上活菌數(shù)的干酪乳桿菌的凍干菌粉，能夠直接應(yīng)用于該菌株益生菌發(fā)酵劑和益生菌制劑的制備和應(yīng)用。
[0004]名稱為一種干酪乳桿菌及其在固態(tài)發(fā)酵中的應(yīng)用中國發(fā)明專利，申請?zhí)枮?00710118485.4，該發(fā)明公開了一種干酪乳桿菌及其在固態(tài)發(fā)酵中的應(yīng)用。所述干酪乳桿菌(LACTOBACILLUS CASEI ZHANG)是從酸馬奶中分離得到的耐酸和耐膽汁酸的益生菌；該菌菌株已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物菌種保藏中心，保藏號:CGMCC N0.1697。本發(fā)明的干酪乳桿菌(LACTOBACILLUS CASEI ZHANG)能實現(xiàn)在固態(tài)發(fā)酵方面的應(yīng)用，特別是作為發(fā)酵劑在乳制品、健康食品、微生物飼料以及動物保健制品中的應(yīng)用；本發(fā)明的干酪乳桿菌菌體存活率提高的方法，是一種優(yōu)化固態(tài)培養(yǎng)基的方法，能得到較高的菌體密度和菌體存活率；本發(fā)明的干酪乳桿菌固態(tài)發(fā)酵活菌數(shù)是液體MRS發(fā)酵活菌數(shù)的二十倍以上。
[0005]名稱為用于飼料添加劑益生菌固體發(fā)酵的干酪乳桿菌、動物雙歧桿菌、植物乳桿菌和枯草芽孢桿菌的發(fā)明專利，申請?zhí)枮?1310321977.9，該發(fā)明公開用于飼料添加劑益生菌固體發(fā)酵的干酪乳桿菌、動物雙歧桿菌、植物乳桿菌和枯草芽孢桿菌，其特征在于:所述枯草芽孢桿菌HM-66、干酪乳桿菌F-08、植物乳桿菌HM-20和動物雙歧桿菌V9均為益生菌，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物菌種保藏中心，保藏號分別為CGMCCN0.6733、CGMCCN0.6735、CGMCCN0.6744 和 CGMCCN0.5470，枯草芽孢桿菌 HM-66、干酪乳桿菌F-08和植物乳桿菌HM-20的保藏日期為2012年10月29日，動物雙歧桿菌V9的保藏日期為2011年11月18日。本發(fā)明還公開了其應(yīng)用方法。
[0006]用于飼料添加劑益生菌固體發(fā)酵的動物雙歧桿菌和枯草芽孢桿菌的中國發(fā)明專利，申請?zhí)枮?01310321979.8，發(fā)明涉及一種可生產(chǎn)出具有特殊酸香味的發(fā)酵型豆柏、且含高活菌數(shù)以及高蛋白質(zhì)降解率的可用于食品和飼料添加劑領(lǐng)域的益生菌固體發(fā)酵。用于固體發(fā)酵的枯草芽孢桿菌HM-66和動物雙歧桿菌V9均為益生菌，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號分別為CGMCCN0.6733和CGMCCN0.5470。
[0007]用于飼料添加劑領(lǐng)域的益生菌固體發(fā)酵的植物乳桿菌和枯草芽孢桿菌審中的中國發(fā)明專利，申請?zhí)枮?01310322177.9，公開了一種污染小、易操作、有利于腸胃消化吸收的用于飼料添加劑益生菌固體發(fā)酵的植物乳桿菌和枯草芽孢桿菌，其特征在于:所述枯草芽孢桿菌HM-66和植物乳桿菌HM-20均為益生菌，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物菌種保藏中心，保藏號分別為CGMCCN0.6733和CGMCCN0.6744。
[0008]用于飼料添加劑領(lǐng)域的益生菌固體發(fā)酵的干酪乳桿菌和枯草芽孢桿菌審中的中國發(fā)明專利，申請?zhí)枮?01310322953.5。公開了一種污染小、易操作、有利于腸胃消化吸收的用于飼料添加劑益生菌固體發(fā)酵的枯草芽孢桿菌和干酪乳桿菌，其特征在于:所述枯草芽孢桿菌HM-66)和干酪乳桿菌F-08均為益生菌，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物菌種保藏中心，保藏號分別為CGMCCN0.6733和CGMCCN0.6735。
[0009]名稱為一種有效預(yù)防及改善牛乳房炎的復(fù)合乳酸菌微生態(tài)制劑中國專利，申請?zhí)枮?01310094615.0,該專利公開一種預(yù)防及改善牛乳房炎的復(fù)合微生態(tài)制劑，復(fù)合微生態(tài)制劑中干酪乳桿菌HM_09(L.casei HM-09)質(zhì)量份數(shù)為10%，植物乳桿菌HM-10(L.Plantarum HM-10)質(zhì)量份數(shù)為10%，其余80%為沸石粉，同時復(fù)合微生態(tài)制劑中L.caseiHM-09 活菌數(shù)量≥ 2.5X108cfu/g, L.plantarum HM-10 活菌數(shù)量≥ 2.5X 108cfu/g ;所述干酪乳桿菌和植物乳桿菌已于2012年10月29日在地址為北京市大屯路，中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，干酪乳桿菌HM_09(L.casei HM-09)保藏號:CGMCCN0.6736 ;植物乳桿菌 HM-10 (L.plantarum HM-10)保藏號:CGMCC N0.6741。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]本發(fā)明目的在于采用地衣芽孢桿菌BL-09、枯草芽孢桿菌HM-66和干酪乳桿菌HM-09進行固態(tài)發(fā)酵豆柏、麩皮和玉米粉，提供一種以豆柏、麩皮和玉米粉為基質(zhì)可廣泛應(yīng)用于微生態(tài)領(lǐng)域的益生菌固體發(fā)酵技術(shù)，此方法發(fā)酵產(chǎn)品的活菌數(shù)高，豆柏蛋白質(zhì)的降解率高。此制備方法生產(chǎn)成本低，可以提高經(jīng)濟效益并且操作簡單。
[0011]本發(fā)明是通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)的。
[0012]一種以豆柏、麩皮和玉米粉為基質(zhì)可廣泛應(yīng)用于微生態(tài)領(lǐng)域的益生菌固體發(fā)酵技術(shù)，包括地衣芽孢桿菌BL-09、枯草芽孢桿菌HM-66和干酪乳桿菌腿_09的培養(yǎng)及其固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)，得到益生菌的固態(tài)發(fā)酵豆柏、麩皮和玉米粉產(chǎn)品。
[0013]所述地衣芽孢桿菌BL-09、枯草芽孢桿菌HM-66和干酪乳桿菌腿_09種子培養(yǎng)基為:蛋白胨1_2%，葡萄糖2-4%，加水至100%, ρΗ7.0-7.2。
[0014]所述的地衣芽孢桿菌BL-09、枯草芽孢桿菌HM-66種子培養(yǎng)條件，放置于搖床上，轉(zhuǎn)速為150-180r/min，溫度為30-37°C，培養(yǎng)20_24h ;干酪乳桿菌HM-09種子培養(yǎng)條件，30-37 °C 靜置培養(yǎng) 20-24h。[0015]所述固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)方法為:固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基上首先接種地衣芽孢桿菌BL-09和枯草芽孢桿菌腿-66種子液，接種量各為2-8%(v/w)，控制發(fā)酵溫度30_38°C，濕度40_65%，混菌培養(yǎng)12-18h ;再添加干酪乳桿菌HM-09種子液，接種量為l_8%(v/w)，其他條件不變，再發(fā)酵12-36h。發(fā)酵結(jié)束后干燥獲得。
[0016]固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基組成為豆柏、麩皮和玉米粉，所述豆柏、麩皮和玉米粉的組成和質(zhì)量比例比例為:豆柏、麩皮、玉米粉=10:8-10:0.5-1。水份含量控制在40-75%。
[0017]地衣芽孢桿菌BL-09、枯草芽孢桿菌HM-66和干酪乳桿菌腿_09混菌發(fā)酵，在發(fā)酵結(jié)束后，游離氨基態(tài)氮含量達(dá)到1109.lumol/g，較發(fā)酵前提高約11倍，地衣芽孢桿菌BL-09和枯草芽孢桿菌HM-66芽孢率較單獨發(fā)酵分別提高2.1倍和1.5倍。
[0018]枯草芽孢桿菌HM-66和干酪乳桿菌HM-09于2012年10月29日保藏，保藏號分別為CGMCC N0.6733和CGMCC N0.6736。菌保藏地址為:北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學(xué)院微生物研究所，郵政編碼100101，保藏單位:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。
[0019]地衣芽抱桿菌BL-09分類名稱分別為(Bacillus licheniformis)BL-09、地衣芽孢桿菌BL-09于2011年12月31日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，菌保藏地址為:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，郵編100101 ;保藏號為CGMCCN0.5686。
[0020]地衣芽孢桿菌BL-09分離自內(nèi)蒙古自治區(qū)呼和浩特市地區(qū)健康牛腸道樣品中芽孢桿菌，屬于兼性厭氧的、革蘭氏陽性芽孢桿菌；菌體呈棒桿狀，偶爾見長桿狀，芽孢中生，呈橢圓形；最適生長溫度為37土 1°C，最適生長pH為7.0-7.4，固態(tài)發(fā)酵烘干產(chǎn)物常溫儲存6個月，芽孢損失率低于5% ;營養(yǎng)瓊脂平板培養(yǎng)12h左右，菌落不規(guī)則、邊緣不光滑，菌落中央具有明顯的凸起峰，培養(yǎng)至24-36h，菌落褶皺明顯且褶皺內(nèi)物質(zhì)呈液體狀，接種環(huán)挑取具有拉絲情況，鏡檢芽孢基本脫落，經(jīng)過伯杰氏細(xì)菌手冊(第9版)生理生化試驗及細(xì)菌、菌落形態(tài)確定為地衣芽孢桿菌，命名為地衣芽孢桿菌BL-09。體外實驗證實，該菌株具有良好的耐高溫、耐酸、耐膽鹽等生化特性地衣芽孢桿菌BL-09還具有高產(chǎn)蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等多種酶類及氨基酸、維生素、抗菌物質(zhì)等多種生理活性物質(zhì)，發(fā)酵后的固態(tài)培養(yǎng)基粘度很大，拉絲嚴(yán)重，培養(yǎng)器皿底部可見少量液體物質(zhì)，證明其固態(tài)發(fā)酵中的保濕能力相對較強。
[0021]耐酸試驗:
[0022]地衣芽孢桿菌BL-09于肉湯種子液中，37 0C，180r/min培養(yǎng)24h，于4°C、4000r/min離心10min收集菌體，用0.85%無菌生理鹽水漂洗一次后，懸浮于pH分別為2.0、3.0及4.0的緩沖溶液中，37°C培養(yǎng)I~3h，檢測活菌數(shù)變化，結(jié)果顯示地衣芽孢桿菌BL-09具有良好
的耐酸性。
[0023]
【權(quán)利要求】
1.一種復(fù)合益生菌制劑，可由下述方法制得:固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基上首先接種地衣芽孢桿菌BL-09和枯草芽孢桿菌HM-66種子液，接種量各為2-8%(v/w)，控制發(fā)酵溫度30-38°C，濕度40-65%，混菌培養(yǎng)12-18h ;再添加干酪乳桿菌HM-09種子液，接種量為l_8%(V/w)，其他條件不變，再發(fā)酵12-36h，發(fā)酵結(jié)束干燥。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的復(fù)合益生菌制劑:其特征在于，固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基組成為豆柏、麩皮和玉米粉，所述豆柏、麩皮和玉米粉的組成和質(zhì)量比例比例為:豆柏、麩皮、玉米粉=10:8-10:0.5-1。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的復(fù)合益生菌制劑:其特征在于，地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)，保藏號為 CGMCC N0.5686。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的復(fù)合益生菌制劑的制備方法，包括如下步驟:固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基上首先接種地衣芽孢桿菌BL-09和枯草芽孢桿菌HM-66種子液，接種量各為2_8%，控制發(fā)酵溫度30-38°C，濕度40-65%，混菌培養(yǎng)12_18h ;再添加干酪乳桿菌腿_09種子液，接種量為1_8%，其他條件不變,再發(fā)酵12_36h,發(fā)酵結(jié)束干燥；固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基組成為S.柏、麩皮和玉米粉，所述豆柏、麩皮和玉米粉的組成和質(zhì)量比例比例為:豆柏、麩皮、玉米粉=10:8-10:0.5-1。地衣芽孢桿菌，保藏號為CGMCC N0.5686。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的復(fù)合益生菌制劑的制備方法，固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基上首先接種地衣芽孢桿菌BL-09和枯草芽孢桿菌HM-66種子液，接種量各為3%，控制發(fā)酵溫度35°C，濕度60%，混菌培養(yǎng)12h ;再添加干酪乳桿菌HM-09種子液，接種量為5%，其他條件不變，再發(fā)酵12h，共計發(fā)酵總時間為24h。發(fā)酵結(jié)束經(jīng)流化床干燥方法獲得干燥的培養(yǎng)物；固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基組成為豆柏、麩皮和玉米粉，所述豆柏、麩皮和玉米粉的組成和質(zhì)量比例比例為:豆柏、麩皮、玉米粉=10:10:0.5，水份含量控制在60%;發(fā)酵結(jié)束后，游離氨基態(tài)氮含量達(dá)到1038.7umol/g。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的復(fù)合益生菌制劑的制備方法，所述固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)方法為:固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基上首先接種地衣芽孢桿菌BL-09和枯草芽孢桿菌HM-66種子液，接種量各為3%，控制發(fā)酵溫度37°C，濕度45%，混菌培養(yǎng)15h ;再添加干酪乳桿菌HM-09種子液，接種量為5%，其他條件不變，再發(fā)酵16h，發(fā)酵結(jié)束經(jīng)流化床干燥方法獲得干燥的培養(yǎng)物； 固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基組成為豆柏、麩皮和玉米粉，所述豆柏、麩皮和玉米粉的組成和質(zhì)量比例比例為:豆柏、麩皮、玉米粉=10:8:1，水份含量控制在70%，游離氨基態(tài)氮含量達(dá)到1019.9umol/g。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的復(fù)合益生菌制劑在畜禽養(yǎng)殖中的應(yīng)用。
【文檔編號】A23K1/16GK103952336SQ201410121427
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2014年3月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月28日
【發(fā)明者】高鵬飛, 趙樹平, 姚國強 申請人:內(nèi)蒙古和美科盛生物技術(shù)有限公司