一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的甘蔗轉(zhuǎn)基因方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的甘蔗轉(zhuǎn)基因方法，其包括農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化、超凈臺吹干、浸染、生根誘導(dǎo)、煉苗、移栽等步驟，以消毒處理后的甘蔗葉圓片為受體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)，快速獲得一種轉(zhuǎn)基因甘蔗。本發(fā)明的方法不受材料限制，節(jié)約時(shí)間，在三個(gè)月內(nèi)就可獲得轉(zhuǎn)基因甘蔗植株，適合大規(guī)模的轉(zhuǎn)基因甘蔗研制；同時(shí)，方法培養(yǎng)時(shí)間短，避免了長期組織培養(yǎng)過程中，外源激素導(dǎo)致變異的影響。
【專利說明】一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的甘蔗轉(zhuǎn)基因方法
[0001]
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明涉及植物轉(zhuǎn)基因培養(yǎng)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的甘蔗轉(zhuǎn)基因方法。
[0003]【背景技術(shù)】
[0004]轉(zhuǎn)基因技術(shù)是指將人工分離和修飾過的基因?qū)氲缴矬w基因組中，由于導(dǎo)入基因的表達(dá)，引起生物體性狀的改變，是可遺傳的修飾。植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)是植物學(xué)研究領(lǐng)域的重要方面，是研究特定目的基因功能和開發(fā)轉(zhuǎn)基因植物的基礎(chǔ)技術(shù)手段。一直以來，植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)是研究者關(guān)注的熱點(diǎn)，隨著研究的逐漸深入，轉(zhuǎn)基因技術(shù)也日趨完善。
[0005]甘蔗是一種重要的糖料作物，甘蔗糖占我國食糖總量的90%以上。同時(shí)，甘蔗也是一種生物質(zhì)能源作物，甘蔗作為目前栽培作物中光合效率最高、產(chǎn)量最高的高光效C4作物，是生產(chǎn)乙醇的最佳能源作物。甘蔗遺傳背景復(fù)雜，常規(guī)的雜交育種周期長，效率低下。轉(zhuǎn)基因技術(shù)能夠快速對現(xiàn)有品種進(jìn)行定向改良，在甘蔗育種上有著廣泛對應(yīng)用前景。甘蔗轉(zhuǎn)基因技術(shù)和其它植物相比，十分落后，直到上世紀(jì)九十年代才通過愈傷組織途徑獲得了轉(zhuǎn)基因植株。目前，甘蔗轉(zhuǎn)基因所常用的受體材料多為愈傷組織或胚狀體。這兩者都需要一定的時(shí)間進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo)，比較費(fèi)時(shí)費(fèi)力，同時(shí)受到再生體系建立困難的限制。
[0006]
【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]為克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明的`在于提供一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的甘蔗轉(zhuǎn)基因方法，利用處理后的甘蔗葉圓片為受體，通`過農(nóng)桿菌介導(dǎo)快速獲得轉(zhuǎn)基因甘蔗。
[0008]為實(shí)現(xiàn)上述目的本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下:
一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的甘蔗轉(zhuǎn)基因方法，其步驟如下:
1)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化:將含有外源基因的農(nóng)桿菌培養(yǎng)至對數(shù)生長期，收集菌體，重懸于含乙酰丁香酮的MS液體培養(yǎng)基中，得到轉(zhuǎn)化菌液；
2)干旱脅迫:取甘蔗末梢的葉片，酒精表面消毒后切成厚度為0.3~0.5cm的甘蔗葉圓片，在超凈臺上放置15~50分鐘，進(jìn)行干旱脅迫；
3)浸染:將步驟2)得到的甘蔗葉圓片浸泡在步驟I)制備的轉(zhuǎn)化菌液中，將液體吸干后再將甘蔗葉圓片置于共培養(yǎng)培養(yǎng)基上，于25~30°C暗培養(yǎng)3~4天；
4)生根誘導(dǎo):將上述經(jīng)過浸染后的甘蔗胚性細(xì)胞置于選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)，進(jìn)行再生；待苗高為2~3cm時(shí)，切取植株接到生根培養(yǎng)基進(jìn)行生根誘導(dǎo)，得到生根的植株；
5)煉苗、移栽:將生根的植株煉苗、移栽，得到轉(zhuǎn)基因甘蔗植株。
[0009]上述方法中，作為本發(fā)明的一種優(yōu)選的方案，步驟I)的MS液體培養(yǎng)基中乙酰丁香酮的含量為100~250 μ Mo
[0010]本發(fā)明中，甘蔗葉圓片在超凈臺上處理的目的是讓葉片失水，加大對葉片的傷害，以達(dá)到提聞轉(zhuǎn)化率的目的。
[0011]上述方法中，作為本發(fā)明的一種優(yōu)選的方案，步驟3)的共培養(yǎng)培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基與2~5mg/L2, 4-二氯苯氧乙酸、I~3mg/L 6-節(jié)氨基嘌呤以及5.5 g/L瓊脂粉的混合培養(yǎng)基，其pH 5.5。優(yōu)選的，在步驟3中浸泡的時(shí)間為10~15min。
[0012]上述方法中，作為本發(fā)明的一種優(yōu)選的方案，步驟4)所述的選擇培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基與2~5 mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸、I~3 mg/L 6-節(jié)氨基嘌呤、250mg/L頭孢霉素、5.5g/L瓊脂粉的混合培養(yǎng)基以及抗性標(biāo)記篩選物質(zhì)，其pH 5.8 ;所述的生根培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基與2-5 mg/L萘乙酸、250mg/L頭孢霉素、5.5 g/L瓊脂粉以及抗性標(biāo)記篩選物質(zhì)的混合培養(yǎng)基，其PH 5.8。在本發(fā)明中步驟4)的培養(yǎng)基中加入抗性標(biāo)記篩選物質(zhì)的目的是讓非轉(zhuǎn)化的細(xì)胞死亡，含有外源基因的細(xì)胞正常生長所述抗性標(biāo)記篩選物質(zhì)為抗生素或除草劑，抗性標(biāo)記篩選物質(zhì)的加入量為:3-5mg/L。
[0013]上述方法中，作為本發(fā)明的一種優(yōu)選的方案，步驟I)中農(nóng)桿菌采用YEB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，具體步驟為:將含有外源基因的農(nóng)桿菌接種于含抗生素的YEB液體培養(yǎng)基中，25~30°C搖床過夜，再按體積百分比1%接種量轉(zhuǎn)接入50mL同樣培養(yǎng)基中培養(yǎng)2~4小時(shí)至0D600為0.5~0.6，收集菌體；然后用5mL含100 μ M AS的MS液體培養(yǎng)基重新懸浮沉淀，將菌液轉(zhuǎn)入50mL含100 μ M AS的MS液體培養(yǎng)基中，28°C搖床上培養(yǎng)至0D600到0.5~0.6。
[0014]上述方法中 ，作為本發(fā)明的一種優(yōu)選的方案，所述外源基因?yàn)椴荻§⒖剐曰颉?br> [0015]優(yōu)選的，在步驟4)中生根誘導(dǎo)的時(shí)間為4周。
[0016]上述方法中，作為本發(fā)明的一種優(yōu)選的方案，步驟5)中移栽所用的基質(zhì)為園土和泥炭土按質(zhì)量比1:1混合。
[0017]先比現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果在于:
1.本發(fā)明以甘蔗葉片直接為轉(zhuǎn)化受體取材容易，通過葉片直接誘導(dǎo)分化成苗能大量減少獲得轉(zhuǎn)基因植株的時(shí)間；在農(nóng)桿菌侵染前期，對外植體進(jìn)行干旱處理，加強(qiáng)外植體的傷害，有效促進(jìn)農(nóng)桿菌的侵染能力，轉(zhuǎn)化效率提高；
2.本發(fā)明所述的方法不受材料限制，節(jié)約時(shí)間，在三個(gè)月內(nèi)就可獲得轉(zhuǎn)基因甘蔗植
株;
3.本發(fā)明和以愈傷組織等其它受體的轉(zhuǎn)基因方法相比，取材容易，也大大縮短了得到轉(zhuǎn)基因甘蔗植株的時(shí)間，在2~3個(gè)月就可以獲得甘蔗植株，更適合大規(guī)模的轉(zhuǎn)基因甘蔗研制；同時(shí)，方法培養(yǎng)時(shí)間短，避免了長期組織培養(yǎng)過程中，外源激素導(dǎo)致變異的影響；
4.本方法采用甘蔗葉圓片直接做位轉(zhuǎn)基因受體，為獲得轉(zhuǎn)基因甘蔗提供新方法；
5.本發(fā)明轉(zhuǎn)化效率高，得到的嵌合體少；而且具有可拓展性，可以適用于大規(guī)模轉(zhuǎn)基因甘蔗的研制，大大減少工作量，降低研究費(fèi)用；
下面結(jié)合具體的實(shí)施方式對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。
[0018]
【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1為本發(fā)明的甘蔗葉圓片浸染之后的照片；圖2為本發(fā)明的生根誘導(dǎo)后得到的植株的照片；
圖3為本發(fā)明的方法培育后的甘蔗葉片與正常培育的甘蔗葉片的PPT離體鑒定；其中兩邊的兩只試管是正常培育的葉片，中間的三只試管是本發(fā)明的方法培育后的葉片；
圖4為通過本發(fā)明的方法獲得的甘蔗植株葉片PCR檢測的電泳圖，其中I為mark，5、8、9為本發(fā)明的甘蔗植株葉片PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0020]
【具體實(shí)施方式】
[0021]實(shí)施例1
一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的甘蔗轉(zhuǎn)基因方法，其步驟如下:
O制備含有Bar基因的農(nóng)桿菌LBA4404:LBA4404感受態(tài)細(xì)胞購買于寶生物工程(大連)有限公司，Bar基因來源于商業(yè)載體pCAMBIA3301，將pCAMBIA3301質(zhì)粒按照《分子克隆》的方法，導(dǎo)入到LBA4404細(xì)胞中；
2)培養(yǎng):挑取含有Bar基因的農(nóng)桿菌LBA4404單菌落，接種于5ml含有50 mg/L利福平的YEB液體培養(yǎng)基中，28 °C搖床過夜，再接著將0.5 ml菌液接種于50mL含有50 mg/L利福平的YEB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至0D600為0.5左右，將菌液于4°C、5000rpm離心5min，收集菌體，用5mL含100 μ M AS的MS液體培養(yǎng)基重新懸浮沉淀，將菌液轉(zhuǎn)入50mL的含100 μ MAS的MS液體培養(yǎng)基中，28°C搖床上培養(yǎng)至0D600為0.5，得到農(nóng)桿菌菌液；
3)干旱脅迫:取甘蔗(新臺糖22號，臺糖公司選育)末梢的葉片，用體積百分比70%酒精表面消毒后，用手術(shù)刀片切成30片厚度為0.5cm的圓片，在超凈臺上放置30分鐘； 4)農(nóng)桿菌浸染:將步驟3)處理后的30片甘蔗葉圓片浸入步驟2)制備的農(nóng)桿菌菌液中12后將受體取出，中間輕緩晃動數(shù)次；然后將受體置于無菌濾紙上，吸除殘余的菌液并涼干，隨即轉(zhuǎn)移到由MS培養(yǎng)基、2 mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-0)、2 mg/L6_芐氨基嘌呤(6-BA)、250mg/L頭孢霉素以及5.5 g/L瓊脂粉組成，pH為5.5的共培養(yǎng)培養(yǎng)基上，于25 °C暗培養(yǎng)3天；
5)轉(zhuǎn)基因抗除草劑甘蔗再生與移栽:將步驟4)與浸染后的轉(zhuǎn)化材料移到選由MS培養(yǎng)基、3 mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸(2，4_D)6_BA lmg/L、3mg/L 草丁膦、250mg/L 頭孢霉素、5.0g/L瓊脂粉組成，pH為5.8的擇培養(yǎng)基上進(jìn)行再生；2-3周更換培養(yǎng)基；待苗高為3 cm時(shí)，切取植株接到由MS培養(yǎng)基、3 mg/L NAA,5 mg/L草丁膦、250mg/L頭孢霉素、5.0 g/L瓊脂粉組成，PH為5.8的生根培養(yǎng)基中，進(jìn)行生根誘導(dǎo)；4周后，可見植株高約6 cm，下部出現(xiàn)長約2 cm的根；
6)煉苗、移栽:打開瓶蓋，煉苗I周，洗凈植株根部的培養(yǎng)基后植株移栽到基質(zhì)為園土和泥炭土按質(zhì)量比1:1混合育苗盤中。
[0022]重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)兩組，每組均為30片甘蔗葉圓片，共得到10棵甘蔗植株。
[0023]實(shí)施例2
一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的甘蔗轉(zhuǎn)基因方法，其步驟如下:
I)制備含有Bar基因的農(nóng)桿菌LBA4404:LBA4404感受態(tài)細(xì)胞購買于寶生物工程(大連)有限公司，Bar基因來源于商業(yè)載體pCAMBIA3301，將pCAMBIA3301質(zhì)粒按照《分子克隆》的方法,導(dǎo)入到LBA4404細(xì)胞 中；2)培養(yǎng):挑取含有Bar基因的農(nóng)桿菌LBA4404單菌落，接種于5ml含有50 mg/L利福平的YEB液體培養(yǎng)基中，25 °C搖床過夜，再接著將0.5 ml菌液接種于50mL含有50 mg/L利福平的YEB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至0D600為0.6，將菌液于4°C、5000rpm離心5min，收集菌體，用5mL含100 μ M AS的MS液體培養(yǎng)基重新懸浮沉淀，將菌液轉(zhuǎn)入50mL的含100 μΜ AS的MS液體培養(yǎng)基中，28 °C搖床上培養(yǎng)至0D600為0.6，得到農(nóng)桿菌菌液；
3)干旱脅迫:取甘蔗(新臺糖20號，臺糖公司選育)末梢的葉片，用體積百分比70%酒精表面消毒后，用手術(shù)刀片切成30片厚度為0.5cm的圓片，在超凈臺上放置15分鐘；
4)農(nóng)桿菌浸染:將步驟3)處理后的30片甘蔗葉圓片浸入步驟2)制備的農(nóng)桿菌菌液中10后將受體取出，中間輕緩晃動數(shù)次；然后將受體置于無菌濾紙上，吸除殘余的菌液并涼干，隨即轉(zhuǎn)移到由MS培養(yǎng)基、2 mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-0)、2 mg/L6_芐氨基嘌呤(6-BA)以及5.5 g/L瓊脂粉組成，pH為5.5的共培養(yǎng)培養(yǎng)基上，于25°C暗培養(yǎng)2天；
5)轉(zhuǎn)基因抗除草劑甘蔗再生與移栽:將步驟4)與浸染后的轉(zhuǎn)化材料移到選由MS培養(yǎng)基、6-BA 3mg/L、5 mg/L草丁膦、250mg/L頭孢霉素、5.0 g/L瓊脂粉組成，pH為5.8的擇培養(yǎng)基上進(jìn)行再生；待苗高為2cm時(shí)，切取植株接到由MS培養(yǎng)基、3 mg/L NAA,5 mg/L草丁膦、250mg/L頭孢霉素、5.0 g/L瓊脂粉組成，pH為5.8的生根培養(yǎng)基中，進(jìn)行生根誘導(dǎo)；4周后,可見植株高約6 cm,下部出現(xiàn)長約2 cm的根；
6)煉苗、移栽:打開瓶蓋，煉苗6天，洗凈植株根部的培養(yǎng)基后植株移栽到基質(zhì)為園土和泥炭土按質(zhì)量比1:1混合育苗盤中。
[0024]采用30片甘蔗葉圓片，共得到2棵甘蔗植株。
[0025]實(shí)施例3
一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的甘蔗轉(zhuǎn)基因方法，其步驟如下:
I)制備含有Bar基因的農(nóng)桿菌LB`A4404:LBA4404感受態(tài)細(xì)胞購買于寶生物工程(大連)有限公司，Bar基因來源于商業(yè)載體pCAMBIA3301，將pCAMBIA3301質(zhì)粒按照《分子克隆》的方法,導(dǎo)入到LBA4404細(xì)胞中；
2)培養(yǎng):挑取含有Bar基因的農(nóng)桿菌LBA4404單菌落，接種于5ml含有50 mg/L利福平的YEB液體培養(yǎng)基中，28 °C搖床過夜，再接著將0.5 ml菌液接種于50mL含有50 mg/L利福平的YEB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至0D600為0.5左右，將菌液于4°C、5000rpm離心5min，收集菌體，用5mL含200 μ M AS的MS液體培養(yǎng)基重新懸浮沉淀，將菌液轉(zhuǎn)入50mL的含200 μ MAS的MS液體培養(yǎng)基中，28°C搖床上培養(yǎng)至0D600為0.5，得到農(nóng)桿菌菌液；
3)干旱脅迫:取甘蔗(粵農(nóng)91-600，廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)作物研究所選育)末梢的葉片，用體積百分比70%酒精表面消毒后，用手術(shù)刀片切成30片厚度為0.5cm的圓片，在超凈臺上放置50分鐘；
4)農(nóng)桿菌浸染:將步驟3)制備的外植體浸入步驟2)制備的農(nóng)桿菌菌液中15min后將受體取出，中間輕緩晃動數(shù)次；然后將受體置于無菌濾紙上，吸除殘余的菌液并涼干，隨即轉(zhuǎn)移到由MS培養(yǎng)基、3 mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-0)、1 mg/L6_芐氨基嘌呤(6-BA)以及5.5 g/L瓊脂粉組成，pH為5.5的共培養(yǎng)培養(yǎng)基上，于25°C暗培養(yǎng)4天；
5)轉(zhuǎn)基因抗除草劑甘蔗再生與移栽:將步驟4)與浸染后的轉(zhuǎn)化材料移到選由MS培養(yǎng)基、6-BA 3mg/L、5 mg/L草丁膦、250mg/L頭孢霉素、5.0 g/L瓊脂粉組成,pH為5.8的擇培養(yǎng)基上進(jìn)行再生；待苗高為3 cm時(shí)，切取植株接到由MS培養(yǎng)基、3 mg/L NAA,5 mg/L草丁膦、250mg/L頭孢霉素、5.0 g/L瓊脂粉組成，pH為5.8的生根培養(yǎng)基中，進(jìn)行生根誘導(dǎo)；4周后,可見植株高約6 cm,下部出現(xiàn)長約2 cm的根；
6)煉苗、移栽:打開瓶蓋，煉苗5天，洗凈植株根部的培養(yǎng)基后植株移栽到基質(zhì)為園土和泥炭土按質(zhì)量比1:1混合育苗盤中。
[0026]采用30片甘蔗葉圓片，共得到3棵甘蔗植株。
[0027]實(shí)施例4
一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的甘蔗轉(zhuǎn)基因方法，其步驟如下:
O制備含有Bar基因的農(nóng)桿菌EHA105:EHA105感受態(tài)細(xì)胞本實(shí)驗(yàn)室保存，Bar基因來源于商業(yè)載體PCAMBIA3301，將pCAMBIA3301質(zhì)粒按照《分子克隆》的方法，導(dǎo)入到EHA105細(xì)胞中；
2)培養(yǎng):挑取含有Bar基因的農(nóng)桿菌EHA105菌落，接種于5ml含有50 mg/L利福平的YEB液體培養(yǎng)基中，28°C搖床過夜，再接著將0.5 ml菌液接種于50mL含有50 mg/L利福平的YEB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至0D600為0.5左右，將菌液于4°C、5000rpm離心5min，收集菌體，用50 mL含100 μ M AS的MS液體培養(yǎng)基重新懸浮沉淀，28°C搖床上培養(yǎng)至0D600為
0.5，得到農(nóng)桿菌菌液；
3)干旱脅迫:取甘蔗(粵糖00-236，廣州甘蔗糖業(yè)研究所選育)末梢的葉片，用體積百分比70%酒精表面消毒后，用手術(shù)刀片切成30片厚度為0.5cm的圓片，在超凈臺上放置30分鐘；
4)農(nóng)桿菌浸染:將步驟3)制備的外植體浸入步驟2)制備的農(nóng)桿菌菌液中12后將受體取出，中間輕緩晃動數(shù)次；然后將受體置于無菌濾紙上，吸除殘余的菌液并涼干，隨即轉(zhuǎn)移到由MS培養(yǎng)基、2 mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-0)、2 mg/L6_芐氨基嘌呤(6-BA)以及
5.5 g/L瓊脂粉組成，pH為5.5的共培養(yǎng)培養(yǎng)基上，于25°C暗培養(yǎng)3~5天；
5)轉(zhuǎn)基因抗除草劑甘蔗再生與移栽:將步驟4)與浸染后的轉(zhuǎn)化材料移到選由MS培養(yǎng)基、6-BA 3mg/L、5 mg/L草丁膦、250mg/L頭孢霉素、5.0 g/L瓊脂粉組成,pH為5.8的擇培養(yǎng)基上進(jìn)行再生；待苗高為3 cm時(shí)，切取植株接到由MS培養(yǎng)基、3 mg/L NAA,5 mg/L草丁膦、250mg/L頭孢霉素、5.0 g/L瓊脂粉組成，pH為5.8的生根培養(yǎng)基中，進(jìn)行生根誘導(dǎo)；4周后,可見植株高約6 cm,下部出現(xiàn)長約2 cm的根；
6)煉苗、移栽:打開瓶蓋，煉苗I周，洗凈植株根部的培養(yǎng)基后植株移栽到基質(zhì)為園土和泥炭土按質(zhì)量比1:1混合育苗盤中。
[0028]采用30片甘蔗葉圓片，共得到5棵甘蔗植株。
[0029]實(shí)施例5 一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的甘蔗轉(zhuǎn)基因方法，其步驟如下:
I)制備含有Bar基因的農(nóng)桿菌LBA4404:LBA4404感受態(tài)細(xì)胞購買于寶生物工程(大連)有限公司，Bar基因來源于商業(yè)載體pCAMBIA3301，將pCAMBIA3301質(zhì)粒按照《分子克隆》的方法,導(dǎo)入到LBA4404細(xì)胞中；
2)培養(yǎng):挑取含有Bar基因的農(nóng)桿菌LBA4404單菌落，接種于5 ml含有50 mg/L利福平的YEB液體培養(yǎng)基中，28 °C搖床過夜，再接著將0.5 ml菌液接種于50mL含有50 mg/L利福平的YEB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至0D600為0.5左右，將菌液于4°C、5000rpm離心5min，收集菌體，用5mL含200 μ M AS的MS液體培養(yǎng)基重新懸浮沉淀，將菌液轉(zhuǎn)入50mL的含200 μ MAS的MS液體培養(yǎng)基中，27°C搖床上培養(yǎng)至0D600為0.5，得到農(nóng)桿菌菌液；
3)干旱脅迫:取甘蔗(粵農(nóng)91-600，廣東省農(nóng)業(yè)科作物研究所選育)末梢的葉片誘導(dǎo)出的甘蔗愈傷組織，用消毒后的手術(shù)刀片切成0.2*0.2 cm大小的愈傷顆粒，在超凈臺上放置50分鐘，；
4)農(nóng)桿菌浸染:將步驟3)制備的外植體浸入步驟2)制備的農(nóng)桿菌菌液中15min后將受體取出，中間輕緩晃動數(shù)次；然后將受體置于無菌濾紙上，吸除殘余的菌液并涼干，隨即轉(zhuǎn)移到由MS培養(yǎng)基、I mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-0)、3 mg/L6_芐氨基嘌呤(6-BA)以及5.5 g/L瓊脂粉組成，pH為5.5的共培養(yǎng)培養(yǎng)基上，于25°C暗培養(yǎng)4天；
5)轉(zhuǎn)基因抗除草劑甘蔗再生與移栽:將步驟4)與浸染后的轉(zhuǎn)化材料移到選由MS培養(yǎng)基、6-BA 3mg/L、5 mg/L草丁膦、500mg/L頭孢霉素、5.0 g/L瓊脂粉組成,pH為5.8的擇培養(yǎng)基上進(jìn)行再生；待苗高為3 cm時(shí)，切取植株接到由MS培養(yǎng)基、3 mg/L NAA,5 mg/L草丁膦、250mg/L頭孢霉素、5.0 g/L瓊脂粉組成，pH為5.8的生根培養(yǎng)基中，進(jìn)行生根誘導(dǎo)；4周后,可見植株高約6 cm,下部出現(xiàn)長約2 cm的根；
6)煉苗、移栽:打開瓶蓋，煉苗5天，洗凈植株根部的培養(yǎng)基后植株移栽到基質(zhì)為園土和泥炭土按質(zhì)量比1:1混合育苗盤中。
[0030]采用30片甘蔗葉圓片誘導(dǎo)的愈傷組織，共得到3棵甘蔗植株。
[0031]對比實(shí)施例1:
按照上述實(shí)施例同樣的條件操作，區(qū)別在于用手術(shù)刀片切成30片厚度為0.5cm的圓片后，不進(jìn)行干旱傷害，直接進(jìn)行浸染。重復(fù)實(shí)驗(yàn)兩組，每組均為30片甘蔗葉圓片，三組實(shí)驗(yàn)共得到2棵甘蔗植株。
[0032]參見圖3，兩邊的兩只試管是正常培育的葉片，中間的三只試管是本發(fā)明的方法培育后的葉片；圖3的照片顯示，轉(zhuǎn)基因甘蔗葉片獲得草丁膦抗性，在草丁膦溶液中仍然保持綠色，而對照沒有抗性，受到傷害，變黃。
[0033]參見圖4，圖4，中I為mark，5、8、9為本發(fā)明的甘蔗植株葉片PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；由圖中結(jié)果可以得出擴(kuò)增出的片段大小和載體一致。
[0034]轉(zhuǎn)基因甘蔗檢測
對上述實(shí)施例1-3育苗盤中的再生甘蔗進(jìn)行檢測。
[0035]A)取種植在育苗盤中再生植株葉片，采用微量法提取總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
[0036]B)PCR擴(kuò)增引物是依據(jù)質(zhì)粒表達(dá)載體中Bar序列設(shè)計(jì)，上游序列:5’ -ACCATCGTCAACCACTACAT-3’，下游序列:5’ - AGTCCAGCTGCCAGAAACCC-3’。PCR 反應(yīng)體系:模板 DNA 50 ~100 ng, IOXBuffer 1.5 μ L，10 mmol/L dNTP 0.35 μ L, 10 mmol/L ZG30.35 μ L,IOmmoI/L ZG4 0.35 μ L,25 mmol/L MgCl2 1.0 μ L，Taq 酶(5 U/μ L) 0.2 μ L,補(bǔ)ddH20 至 15yL。反應(yīng)條件:95°C 預(yù)變性 3 min ；95°C 30sec,60°C 40sec,72°C 40sec，35 個(gè)循環(huán)；72°C延伸10 min，4°C保存；
C)質(zhì)量體積比1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。
[0037] 上述實(shí)施方式僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，不能以此來限定本發(fā)明保護(hù)的范圍，本領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明的基礎(chǔ)上所做的任何非實(shí)質(zhì)性的變化及替換均屬于本發(fā)明所要求保護(hù)的范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的甘蔗轉(zhuǎn)基因方法，其步驟如下: 1)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化:將含有外源基因的農(nóng)桿菌培養(yǎng)至對數(shù)生長期，收集菌體，重懸于含乙酰丁香酮的MS液體培養(yǎng)基中，得到轉(zhuǎn)化菌液； 2)干旱脅迫:酒精表面消毒后切成厚度為0.3~0.5cm的甘蔗葉圓片，在超凈臺上放置15~50分鐘； 3)浸染:將步驟2)處理后的甘蔗葉片浸泡在步驟I)制備的轉(zhuǎn)化菌液中，將液體吸干后再將甘蔗葉圓片置于共培養(yǎng)培養(yǎng)基上，于25~30°C暗培養(yǎng)3~4天； 4)生根誘導(dǎo):將上述經(jīng)過浸染后的甘蔗葉圓片置于選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)，進(jìn)行再生；待苗高為2~3cm時(shí)，切取植株接到生根培養(yǎng)基進(jìn)行生根誘導(dǎo)，得到生根的植株； 5)煉苗、移栽:將生根的植株煉苗、移栽，得到轉(zhuǎn)基因甘蔗植株。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟I)的MS液體培養(yǎng)基中乙酰丁香酮的含量為100~250 μ M。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟3)的共培養(yǎng)培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基與2-5mg/L2，4-二氯苯氧乙酸、l-3mg/L 6-芐氨基嘌呤以及5.5 g/L瓊脂粉的混合培養(yǎng)基，其 pH 5.5。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟4)所述的選擇培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基與2~5 mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸、I~3 mg/L 6-節(jié)氨基嘌呤、250mg/L頭孢霉素、5.5 g/L瓊脂粉的混合培養(yǎng)基以及抗性標(biāo)記篩選物質(zhì)，其pH 5.8 ;所述的生根培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基與2~5 mg/L萘乙酸、250~500mg/L頭孢霉素、5.5 g/L瓊脂粉以及抗性標(biāo)記篩選物質(zhì)的混合培養(yǎng)基，其pH 5 .8。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于:所述抗性標(biāo)記篩選物質(zhì)為抗生素或除草劑。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟I)中農(nóng)桿菌采用YEB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，具體步驟為:將含有外源基因的農(nóng)桿菌接種于含抗生素的YEB液體培養(yǎng)基中，25~30°C搖床過夜，再按體積百分比1%接種量轉(zhuǎn)接入50mL同樣培養(yǎng)基中培養(yǎng)2~4小時(shí)至0D600為0.5~0.6，收集菌體；然后用5mL含100 μ M AS的MS液體培養(yǎng)基重新懸浮沉淀，將菌液轉(zhuǎn)入50mL含100 μ M AS的MS液體培養(yǎng)基中，28°C搖床上培養(yǎng)至0D600到0.5~0.6。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于:所述外源基因?yàn)椴荻§⒖剐曰颉?br> 8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟5)中移栽所用的基質(zhì)為園土和泥炭土按質(zhì)量比1:1混合。
【文檔編號】A01H4/00GK103740751SQ201310714150
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2013年12月19日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月19日
【發(fā)明者】王繼華, 鄭錦榮, 曹干, 張劍亮, 張小蘭, 王麗, 呂冰 申請人:廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所