黑胸?cái)⊙挎邨U菌伴孢晶體毒素蛋白、截短片段及其重組表達(dá)載體和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了黑胸?cái)⊙挎邨U菌伴孢晶體毒素蛋白（Bb?toxin）、截短片段及其重組表達(dá)載體和應(yīng)用，黑胸?cái)⊙挎邨U菌伴孢晶體毒素蛋白的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.4所示，其截短片段如SEQ?ID?NO.8所示，家蠶幼蟲添食截短片段后家蠶存活率明顯下降（約30%），表明該基因編碼的是一個(gè)可導(dǎo)致鱗翅目昆蟲家蠶致死的毒性蛋白，能夠用于制備抗鱗翅目害蟲的生物農(nóng)藥殺蟲劑，具有廣泛的應(yīng)用前景。
【專利說明】黑胸?cái)⊙挎邨U菌伴孢晶體毒素蛋白、截短片段及其重組表達(dá)載體和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物化學(xué)領(lǐng)域，具體涉黑胸?cái)⊙挎邨U菌伴孢晶體毒素蛋白(Bbtoxin)和黑胸?cái)⊙挎邨U菌伴孢晶體毒素蛋白截短片段，還涉及含黑胸?cái)⊙挎邨U菌伴孢晶體毒素蛋白的重組表達(dá)載體和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]蘇云金芽孢桿菌伴孢晶體毒素蛋白(Bt Cry)對(duì)鱗翅目(L印idoptera)、雙翅目(Diptera)、鞘翅目(Coleoptera)、膜翅目(Hymenoptera)等多種昆蟲具有殺蟲活性。Bt Cry基因?qū)霟煵莺头巡⒈憩F(xiàn)出抗蟲特性后，又相繼獲得抗蟲轉(zhuǎn)基因的玉米、水稻、馬鈴薯、甘藍(lán)、棉花、楊樹等。以我國(guó)的轉(zhuǎn)基因棉花為例，每年帶來的直接經(jīng)濟(jì)效益達(dá)150億元，每畝增收節(jié)支150元左右，減少化學(xué)農(nóng)藥用量2000-3000萬公斤。但長(zhǎng)期使用Bt Cry轉(zhuǎn)基因作物也導(dǎo)致抗性昆蟲的相繼產(chǎn)生，如棉鈴蟲(Helicoverpa armigeraHubner)、小菜蛾(Plutellaxylostella)和粉紋夜蛾(Trichoplusia ni)等。早在2007年,科研工作者采用兩種不同類型的Bt Cry協(xié)同組合使用來應(yīng)對(duì)抗性昆蟲的蔓延，這種方式雖然在一定程度上可以延緩Bt Cry抗性昆蟲的產(chǎn)生,但沒有從根本上解決問題,還會(huì)出現(xiàn)對(duì)Bt Cry更高抵抗性的害蟲，最終促使Bt Cry應(yīng)用于作物防蟲的價(jià)值消失，有可能導(dǎo)致農(nóng)業(yè)昆蟲災(zāi)害的新一輪大爆發(fā)。因此，從其它物種的基因組中鑒定新的與抗蟲害相關(guān)的基因，應(yīng)用于作物的分子育種，緩解或替代害蟲對(duì)轉(zhuǎn)Bt作物的抗性是當(dāng)前農(nóng)業(yè)迫切需要解決的科學(xué)問題。
[0003]黑胸?cái)⊙挎邨U菌(Bacillus bombyseptieus,簡(jiǎn)稱Bb)是一種分布極其廣泛的革蘭氏陽性細(xì)菌，對(duì)昆蟲具有強(qiáng)烈致病性，但對(duì)其致病機(jī)制研究報(bào)道較少。16s rRNA進(jìn)化分析表明Bb與Bt在進(jìn)化上具有較近的親緣關(guān)系；參與Bt致病的相關(guān)基因都不同程度地被Bb誘導(dǎo)表達(dá)且其表達(dá)模式與Bt類似，暗示Bb可能具有類似于Bt的致病機(jī)制；另外，Bb類似于Bt，在形成芽孢的同時(shí)也能產(chǎn)生蛋白性質(zhì)的伴孢晶體毒素，而Bb感染后在中腸上形成孔洞，暗示Bb伴孢毒素蛋白具有類似于Bt Cry的重要的生物學(xué)功能。因此，對(duì)Bb伴孢晶體毒素蛋白的鑒定和全長(zhǎng)序列克隆，將在對(duì)闡明Bb毒素蛋白致病性和致病機(jī)理產(chǎn)生重要的理論價(jià)值和實(shí)踐意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于提供黑胸?cái)⊙挎邨U菌伴孢晶體毒素蛋白截短片段，本發(fā)明的目的之二在于提供上述截短片段的編碼基因；本發(fā)明的目的之三在于提供黑胸?cái)⊙挎邨U菌伴孢晶體毒素蛋白；本發(fā)明的目的之四在于提供黑胸?cái)⊙挎邨U菌伴孢晶體毒素蛋白的編碼基因；本發(fā)明的目的之五在于提供含有所述編碼基因的重組表達(dá)載體；本發(fā)明的目的之六在于提供含有所述重組表達(dá)載體的工程菌；本發(fā)明的目的之七在于提供黑胸?cái)⊙挎邨U菌伴孢晶體毒素蛋白截短片段或黑胸?cái)⊙挎邨U菌伴孢晶體毒素蛋白的應(yīng)用。[0005]1.黑胸?cái)⊙挎邨U菌伴孢晶體毒素蛋白截短片段，所述截短片段的氨基酸序列如SEQ ID N0.8 所示。
[0006]2.所述黑胸?cái)⊙挎邨U菌伴孢晶體毒素蛋白截短片段的編碼基因。
[0007]優(yōu)選的，所述的編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.7所示。
[0008]3.黑胸?cái)⊙挎邨U菌伴孢晶體毒素蛋白，氨基酸序列如SEQ ID N0.4所示。
[0009]4.所述黑胸?cái)⊙挎邨U菌伴孢晶體毒素蛋白的編碼基因。
[0010]優(yōu)選的，所述的編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0011]5.含有所述編碼基因的重組表達(dá)載體。
[0012]優(yōu)選的，所述重組表達(dá)載體是將SEQ ID N0.7所示的核苷酸連入pET28a載體的Nde I和Xho I酶切位點(diǎn)處。
[0013]6.含有所述重組表達(dá)載體的工程菌，優(yōu)選的工程菌為大腸桿菌BL21。
[0014]7.所述黑胸?cái)⊙挎邨U菌伴孢晶體毒素蛋白截短片段或所述黑胸?cái)⊙挎邨U菌伴孢晶體毒素蛋白在制備抗鱗翅目害蟲的生物農(nóng)藥殺蟲劑中的應(yīng)用。
[0015]優(yōu)選的，所述鱗翅目害蟲為家蠶。
[0016]本發(fā)明的有益效果在于:本發(fā)明從病原微生物黑胸?cái)⊙挎邨U菌中分離到一個(gè)導(dǎo)致家蠶幼蟲致死的伴孢晶體毒素蛋白，并克隆到編碼該蛋白的基因，還獲得一個(gè)具有活性的伴孢晶體毒素蛋白截短片段，家蠶幼蟲經(jīng)口添食該截短片段后可導(dǎo)致家蠶死亡，因此伴孢晶體毒素蛋白及其截短片段是除Bt Cry伴孢晶體毒素蛋白外唯一一個(gè)經(jīng)口飼養(yǎng)家蠶可導(dǎo)致家蠶死亡的伴孢晶體毒素蛋白，這將為抗鱗翅目害蟲的生物農(nóng)藥殺蟲劑提供新的靶標(biāo)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果更加清楚，本發(fā)明提供如下附圖:
[0018]圖1為分離純化獲得的黑胸?cái)⊙挎邨U菌伴孢晶體毒素蛋白(M:標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker ；1:純化獲得的黑胸?cái)⊙挎邨U菌伴孢晶體毒素蛋白)。
[0019]圖2為黑胸?cái)⊙挎邨U菌伴孢晶體毒素蛋白與不同類型的Bt Cry毒素蛋白進(jìn)化分析(Bt CrylAa (Genbank:AAA22353.1) ；Bt Cry2Aa (Genbank:AAA22335.1)；Bt Cry3Aa (Genbank:AAA22336.1) ；Bt Cry4Aa (Genbank:CAA68485.1)；Bt Cry5Aa (Genbank:AAA67694.1) ；Bt Cry6Aa (Genbank:AAA22357.1)；Bt Cry7Aa (Genbank:AAA2235I.I) ； B t Cry8Aa (Genbank:AAA2111 7.1)；Bt Cry9Aa (Genbank:CAA41122.1 ) ；Bt CrylOAa (Genbank:AAA22614.1 )；Bt CryllAa (Genbank:AAA22352.1) ；Bt Cryl2Aa (Genbank:AAA22355.1)；Bt Cryl3Aa (Genbank:AAA22356.1 ) ； Bt Cryl4Aa ( Genbank:AAA215163.1)；Bt Cry 15Aa (Genbank:AAA22333.1) ；Bt Cry16Aa (Genbank:CAA63860.1) ；BtCryl7Aa (Genbank:CAA67841.1) ；Bt Cryl8Aa (Genbank:CAA67506.1) ；Bt Cryl9Aa(Genbank:CAA68875.1) ;Bt Cry20Aa (Genbank:AAB93476.1))。
[0020]圖3為黑胸?cái)⊙挎邨U菌伴孢晶體毒素蛋白在BL21中誘導(dǎo)表達(dá)電泳檢測(cè)(1:對(duì)照沉淀；2:對(duì)照上清；3:16°C誘導(dǎo)20h沉淀；4:16°C誘導(dǎo)20h上清；5:37°C誘導(dǎo)4h沉淀；6:37°C誘導(dǎo)4h上清)。[0021]圖4為黑胸?cái)⊙挎邨U菌伴孢晶體毒素蛋白截短片段在BL21中誘導(dǎo)表達(dá)電泳檢測(cè)(1:對(duì)照沉淀；2:對(duì)照上清；3:16°C誘導(dǎo)20h沉淀；4:16°C誘導(dǎo)20h上清；5:37°C誘導(dǎo)4h沉淀；6:37°C誘導(dǎo)4h上清)。
[0022]圖5為SDS-PAGE電泳檢測(cè)Ni柱親和層析純化獲得黑胸?cái)⊙挎邨U菌伴孢晶體毒素蛋白截短片段。
[0023]圖6為家蠶添食黑胸?cái)⊙挎邨U菌伴孢晶體毒素蛋白截短片段結(jié)果(A:存活率統(tǒng)計(jì)結(jié)果，其中I為添食等體積PBS的家蠶存活率；2為添食黑胸?cái)⊙挎邨U菌伴孢晶體毒素蛋白截短片段的家蠶存活率:添食PBS后家蠶存活照；C:添食黑胸?cái)⊙挎邨U菌伴孢晶體毒素蛋白截短后家蠶死亡照片)。
【具體實(shí)施方式】
[0024]下面將結(jié)合附圖，對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版，J-薩姆布魯克等著)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0025]實(shí)施例l、Bb toxin的分離純化、活化和質(zhì)譜鑒定
[0026]根據(jù)蘇云金芽孢桿菌伴孢晶體毒素蛋白(Bt CrylAc)的分離純化方法來純化黑胸?cái)⊙挎邨U菌伴孢晶體毒素蛋白(Bb toxin),具體為:將Bb菌接種于含有5mL LB培養(yǎng)基(胰蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，NaCl 1%, pH7.2)的試管中，30°C，250r/min搖床培養(yǎng)過夜；以1%的體積接種于LB培養(yǎng)基中，300C，250r/min培養(yǎng)大約34_38h，從34h開始，取樣進(jìn)行油鏡觀察伴孢晶體和芽孢 的產(chǎn)生；將菌液于4°C，7000rpm離心15分鐘；用預(yù)冷的IM NaCl洗滌，以除去培養(yǎng)基中的雜蛋白，4°C，8000rpm離心15分鐘(重復(fù)2次);用預(yù)冷的滅菌水洗滌2次；沉淀中加入IOOmL裂解液(50mM Na2CO3, 25mM EDTA，高溫滅菌后加5%-巰基乙醇，用NaOH調(diào)pH到9.5)，冰浴搖床輕搖12小時(shí)；然后在4°C，8000rpm離心30分鐘，取上清倒入干凈的離心管中，加入7mL4M的醋酸鈉-醋酸緩沖液(pH4.5)，用乙酸調(diào)pH至4.5 ;將離心管靜置于冰上4小時(shí)使蛋白完全沉淀；再在4°C，12000rpm離心30分鐘，取沉淀洗滌兩次，以除去巰基乙醇；將所得的沉淀在4°C下溶于50mM Na2CO3 (pH9.5)，攪拌至完全溶解；用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(碧云天)測(cè)定純化獲得Bb toxin蛋白濃度和SDS-PAGE電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖1所示。電泳檢測(cè)結(jié)果顯示大約在40KD處獲得了單一條帶的蛋白，命名為黑胸?cái)⊙挎邨U菌伴孢晶體毒素蛋白，簡(jiǎn)稱Bb toxin，然后將其分裝保存于-80°C。
[0027]將Bb toxin與胰蛋白酶(購自Sigma)以質(zhì)量比為25:1混合，在37°C下溫育6小時(shí)；然后加入1/10體積4M醋酸鈉-醋酸緩沖液(pH=4.5)，4°C冰箱靜置15分鐘，12000rpm離心10分鐘，取沉淀，加入雙蒸水振蕩溶解，重復(fù)該步驟三次；所得的沉淀用50mM Na2CO3(pH=10)溶解，得到有活性的Bb toxin毒素蛋白單體；用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒和SDS-PAGE電泳明確其的純度，蛋白濃度為0.278ug/l.! L。
[0028]將純化獲得的Bb toxin毒素蛋白用酸溶膠原蛋白(acid-soluble collagen,ASC)酶解，酶解后樣品重溶在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%三氟乙酸(TFA)中，與基質(zhì)(8mg/mL甲位己基桂醛HCA，50%醋酸-硝酸纖維素CAN，0.1%TFA)混合點(diǎn)靶，采用AB SCIEX T0F/T0Ftm5800質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)譜鑒定；質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集:先用MS反射模式得到一級(jí)圖譜，一級(jí)MS激光總shots750次，然后用interpretation方法自動(dòng)選擇母離子做二級(jí),二級(jí)MS/MS激光總shots2500次,碰撞能量2KV，并運(yùn)用Dynamic Exit算法進(jìn)行MSMS數(shù)據(jù)采集；利用ProteinPilot4.0對(duì)Bb基因組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，結(jié)果如表1所示。由表1可知，最終比對(duì)到一個(gè)基因編號(hào)為Bb001019的蛋白，即Bb toxin。
[0029]表1Bb toxin質(zhì)譜鑒定比對(duì)Bb基因組數(shù)據(jù)庫結(jié)果
[0030]
【權(quán)利要求】
1.黑胸?cái)⊙挎邨U菌伴孢晶體毒素蛋白截短片段，其特征在于:所述截短片段的氨基酸序列如SEQ ID N0.8所示。
2.權(quán)利要求1所述黑胸?cái)⊙挎邨U菌伴孢晶體毒素蛋白截短片段的編碼基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的編碼基因，其特征在于:核苷酸序列如SEQID N0.7所示。
4.黑胸?cái)⊙挎邨U菌伴孢晶體毒素蛋白，其特征在于:氨基酸序列如SEQID N0.4所示。
5.權(quán)利要求4所述黑胸?cái)⊙挎邨U菌伴孢晶體毒素蛋白的編碼基因。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的編碼基因，其特征在于:核苷酸序列如SEQID N0.1所示。
7.含有權(quán)利要求3所述編碼基因的重組表達(dá)載體。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的重組表達(dá)載體，其特征在于:是將SEQID N0.7所示的核苷酸連入pET28a載體的Nde I和Xho I酶切位點(diǎn)而得。
9.含有權(quán)利要求7或8所述重組表達(dá)載體的工程菌。
10.權(quán)利要求1所述黑胸?cái)⊙挎邨U菌伴孢晶體毒素蛋白截短片段或權(quán)利要求4所述黑胸?cái)⊙挎?桿菌伴孢晶體毒素蛋白在制備抗鱗翅目害蟲的生物農(nóng)藥殺蟲劑中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A01P7/04GK103626853SQ201310624109
【公開日】2014年3月12日 申請(qǐng)日期:2013年11月28日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月28日
【發(fā)明者】程廷才, 林平, 金盛凱, 常懷譜, 夏慶友 申請(qǐng)人:西南大學(xué)