一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的懷地黃遺傳轉(zhuǎn)化方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于植物生物【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的懷地黃遺傳轉(zhuǎn)化方法。以懷地黃無菌苗初展開葉片去葉脈后剪成的葉盤作為根癌農(nóng)桿菌感染的受體，經(jīng)農(nóng)桿菌侵染、共培養(yǎng)、抗性愈傷誘導(dǎo)、抗性芽分化、抗性芽生根，最終獲得地黃的轉(zhuǎn)基因植株。本發(fā)明方法簡單，培養(yǎng)周期短，轉(zhuǎn)化效率高，成功實現(xiàn)了懷地黃的遺傳轉(zhuǎn)化，為外源基因在懷地黃中穩(wěn)定表達(dá)奠定了基礎(chǔ)，對地黃的遺傳改良和分子生物學(xué)研究有十分重要的意義。
【專利說明】一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的懷地黃遺傳轉(zhuǎn)化方法
[0001]
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明屬于植物生物【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的懷地黃遺傳轉(zhuǎn)化方法。
【背景技術(shù)】
[0003]塊歲iRehmannia glutinosa L.)為玄參科多年生草本植物，以塊根入藥,是著名“四大懷藥”之一。因其用藥歷史悠久、臨床療效確切，已成為構(gòu)建我國現(xiàn)代大中藥產(chǎn)業(yè)鏈重點推薦研究利用的大宗藥材之一(黃璐琦等，中國科技投資，2010，5: 67-69)。目前在河南省焦作地區(qū)種植面積已經(jīng)超過1.5萬公頃，產(chǎn)值數(shù)十億元。然而，由于地黃生產(chǎn)上多以塊根進(jìn)行無性繁殖，更易遭受病原菌和病毒侵襲而發(fā)病。而且，地黃生產(chǎn)上存在非常嚴(yán)重的連作障礙問題，造成地黃產(chǎn)量和品質(zhì)明顯下降，種植過地黃的土地須隔8-10年方可再種。培育脫毒地黃雖然能夠提高地黃的產(chǎn)量，但并沒有改變地黃的遺傳特性，病毒復(fù)侵速度快，2-3代就要更換一次種苗，成本高。這些都在很大程度上影響了地黃生產(chǎn)的穩(wěn)定發(fā)展，也制約了地黃產(chǎn)業(yè)鏈現(xiàn)代化的進(jìn)程。近年來，由于高通量DNA測序技術(shù)的發(fā)展，地黃的基因轉(zhuǎn)錄本不斷被解析，可獲取的與地黃產(chǎn)量形成和活性成分合成調(diào)控的基因信息越來越多。因此，通過遺傳轉(zhuǎn)化的方法對地黃的遺傳特性進(jìn)行修飾，對于獲得產(chǎn)量高、活性成分含量高和抗病蟲能力強(qiáng)的優(yōu)良地黃品種具有較強(qiáng)的現(xiàn)實意義。
[0004]地黃是較早開展組織培養(yǎng)技術(shù)的藥用植物之一，然而，有關(guān)懷地黃遺傳轉(zhuǎn)化的研究卻很少。付建喜等(河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，10: 72-76)報道用發(fā)根農(nóng)桿菌侵染地黃子葉、葉柄和莖，獲得了轉(zhuǎn)基因地黃植株。然而，由于發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植株普遍表現(xiàn)地上部分節(jié)間縮短、地下部分以須根為主(張蔭麟等，中國中藥雜志，1997，5: 274-275)，而且Ri質(zhì)粒改造技術(shù)滯后，限制了其在植物基因組的遺傳修飾方面的應(yīng)用。韓國的Park等(Biotechnology letters, 2002, 7: 547-550)雖然最早報道獲得了根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的地黃轉(zhuǎn)化植株，然而，作為轉(zhuǎn)化受體的地黃種質(zhì)不明，且轉(zhuǎn)化程序較復(fù)雜。臧亞超(河北農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文，2012)雖也獲得了地黃轉(zhuǎn)基因植株，但由于抑菌抗生素濃度過高(氨芐青霉素600 mg/L)，再生芽分化慢，轉(zhuǎn)化效率也很低。因此，構(gòu)建轉(zhuǎn)化程序簡單、轉(zhuǎn)化效率高、重復(fù)性好的懷地黃遺傳轉(zhuǎn)化再生體系仍是地黃種質(zhì)遺傳改良中亟需解決的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有地黃遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)的不足，提供一種以懷地黃初展開的葉片為轉(zhuǎn)化外植體受體，通過根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法，把外源基因?qū)霊训攸S受體細(xì)胞，經(jīng)過篩選再生獲得懷地黃轉(zhuǎn)基因植株的方法。
[0006]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下:
一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的懷地黃遺傳轉(zhuǎn)化方法，以懷地黃無菌苗初展開葉片去葉脈后剪成葉盤作為根癌農(nóng)桿菌感染的受體，經(jīng)農(nóng)桿菌侵染、共培養(yǎng)、抗性愈傷誘導(dǎo)、抗性芽分化、抗性芽生根，最終獲得地黃的轉(zhuǎn)基因植株。
[0007]葉盤被農(nóng)桿菌侵染后先接種在無篩選抗生素的培養(yǎng)基上共培養(yǎng)48-72 h，之后接種到含有潮霉素或卡那霉素的篩選培養(yǎng)基上獲得抗性愈傷和抗性芽，再把抗性芽接種到增殖培養(yǎng)基上增殖，在生根培養(yǎng)基上生根，獲得轉(zhuǎn)基因地黃植株。
[0008]優(yōu)選的，懷地黃無菌苗的準(zhǔn)備如下:將田間挖取的直徑約1-2 cm的懷地黃塊根洗凈，依次用酒精和HgCl2消毒，之后無菌水沖洗5-6次；將帶芽眼的部分切成1.5-2 cm小塊放入MS基本培養(yǎng)基中，14 h/d、3000-4000 lux光照，于25 ± I °C下培養(yǎng)，15 d后把再生芽轉(zhuǎn)至新的MS基本培養(yǎng)基，30 d繼代一次。
[0009]優(yōu)選的，根癌農(nóng)桿菌菌株的活化與侵染菌液的制備如下:把鑒定正確的根癌農(nóng)桿菌在YEB固體培養(yǎng)基上劃線活化，于27°C下，暗培養(yǎng)48 h ;挑取單克隆菌落接種到20-30 mLYEB液體培養(yǎng)基中，于27°C下，180 rpm振蕩培養(yǎng)24 h ;取100 μ L上述菌液接種到50 mL的YEB液體培養(yǎng)基中，于27°C下，180 rpm振蕩培養(yǎng)，菌液濃度至OD6tltl=0.4-0.8，于4°C，4000rpm條件下離心10 min收集菌體,棄上清，用侵染培養(yǎng)基懸浮至0D_=0.5獲得侵染菌液待用。
[0010]所述的YEB液體培養(yǎng)基為:YEB基本培養(yǎng)基+卡那霉素50 mg/L+利福霉素50mg/L+蔗糖5 g/L ;所述的YEB固體培養(yǎng)基還含有瓊脂粉15 g/L ;所述的侵染培養(yǎng)基為:MS基本培養(yǎng)基+乙酰丁香酮100 Mmol/L+蔗糖30 g/L。
[0011]所述的YEB基本培養(yǎng)基為:牛肉浸膏5 g/L+胰蛋白胨5 g/L+酵母提取物I g/L+MgSO4.7H20 0.5g/L。
[0012]優(yōu)選的，將懷地黃無菌苗的葉片去掉主脈，剪成長寬約0.5-1.0 cm的葉盤，置于制備好的侵染菌液中浸泡5-10 min，用無菌濾紙吸去葉盤上多余的菌液，接種到無篩選抗生素的培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)，所述的培養(yǎng)基為:MS基本培養(yǎng)基+6-芐氨基嘌呤2.0 mg/L+α-萘乙酸0.lmg/L+乙酰丁香酮100 Mmol/L+鹿糖30 g/L+瓊脂粉9 g/L。
[0013]優(yōu)選的，共培養(yǎng)后的葉盤轉(zhuǎn)接到含抗生素的篩選培養(yǎng)基上，14 h/d,3000-4000lux光照，于25 土 1°C下培養(yǎng)，2周后更換一次培養(yǎng)基，3-4周后把抗性愈傷轉(zhuǎn)接到新的含抗生素的篩選培養(yǎng)基上，2-3周長出抗性芽；所述含抗生素的篩選培養(yǎng)基為:MS基本培養(yǎng)基+6-芐氨基嘌呤2.0 mg/L+α-萘乙酸0.1 mg/L+特美汀200 mg/L+潮霉素10-15 mg/L或卡那霉素50-75 mg/L+鹿糖30g/L+瓊脂粉9 g/L。
[0014]優(yōu)選的，將長2-3 cm的抗性芽轉(zhuǎn)接到叢生芽分化培養(yǎng)基中，14 h/d,3000-4000lux光照，于25土1°C下培養(yǎng)，進(jìn)行抗性芽擴(kuò)繁；把長2-3 cm的叢生芽剪下轉(zhuǎn)接入生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根；所述的叢生芽分化培養(yǎng)基為:MS基本培養(yǎng)基+6-芐氨基嘌呤0.2 mg/L+ a -萘乙酸0.0 lmg/L+特美汀200 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂粉9 g/L ;所述的生根培養(yǎng)基為:MS基本培養(yǎng)基+ a -萘乙酸0.0 lmg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂粉9 g/L。
[0015]更為優(yōu)選的，所述方法步驟如下:
(I)懷地黃無菌苗的準(zhǔn)備:將田間挖取的直徑1-2 Cm的懷地黃塊根洗凈，用體積濃度為70%的酒精表面消毒30 S，然后用質(zhì)量濃度為0.1%的HgCl2消毒10-15 min,無菌水沖洗5-6次；將帶芽眼的部分切成1.5-2 cm小塊放入MS基本培養(yǎng)基中，14 h/d,3000-4000 lux光照，于25±1°C下培養(yǎng)，15 d后把再生芽轉(zhuǎn)至新的MS基本培養(yǎng)基，30 d繼代一次；(2)菌株的活化與侵染菌液的制備:把鑒定正確的根癌農(nóng)桿菌在YEB固體培養(yǎng)基上劃線活化，于27°C下，暗培養(yǎng)48 h，挑取單克隆菌落接種到20-30 mL YEB液體培養(yǎng)基中，于27°C下，180 rpm振蕩培養(yǎng)24 h，取100 μ L的菌液接種到50 mL的YEB液體培養(yǎng)基中，于27°C下，180 rpm振蕩培養(yǎng),菌液濃度至OD6qq=0.4-0.8,于4°C,4000 rpm條件下離心10 min收集菌體，棄上清，用侵染培養(yǎng)基懸浮至0D_=0.5待用；
(3)侵染和共培養(yǎng):將懷地黃無菌苗的葉片去掉主脈，剪成長寬約0.5-1.0 cm的小塊即葉盤，置于制備好的侵染菌液中浸泡5-10 min，用無菌濾紙吸去葉盤上多余的菌液，接種到共培養(yǎng)培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)48-72 h ；
(4)外植體的抗性愈傷誘導(dǎo)和再生芽分化:共培養(yǎng)后的葉盤轉(zhuǎn)接到含抗生素的篩選培養(yǎng)基上，14 h/d,3000-4000 lux光照，于25±1°C下培養(yǎng)，3-4周后把抗性愈傷轉(zhuǎn)接到新的篩選培養(yǎng)基上，2-3周長出抗性芽；
(5)再生芽增殖和生根:將長2-3cm的抗性芽轉(zhuǎn)接到叢生芽分化培養(yǎng)基中，14 h/d、3000-4000 lux光照，于25±1°C下培養(yǎng)，進(jìn)行抗性芽擴(kuò)繁；把長2-3 cm的叢生芽剪下轉(zhuǎn)接入生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根。
[0016]對轉(zhuǎn)基因植株的分子鑒定時，取所獲得的抗性再生植株的葉片，采用PCR方法進(jìn)行外源導(dǎo)入基因的檢測或進(jìn)行導(dǎo)入報告基因蛋白質(zhì)產(chǎn)物活性檢測。
[0017]所述的侵染培養(yǎng)基在制備時pH值調(diào)至7.0,各種植物培養(yǎng)基制備時pH值均調(diào)至
5.8，121°C高壓滅菌20 min，但培養(yǎng)基溫度降至50_60°C時，添加特美汀、潮霉素或卡那霉素，混勻分裝后備用。
[0018]本發(fā)明的特點是:以無菌苗的葉片為轉(zhuǎn)化外植體受體，且無菌苗可以連續(xù)繼代，不需要對外植體的表面消毒，簡化了轉(zhuǎn)化程序；遺傳轉(zhuǎn)化可常年進(jìn)行，不受季節(jié)影響；以特美汀為農(nóng)桿菌抑制劑，抑菌效果好，成本低；轉(zhuǎn)化周期短，一般侵染后6-8周可獲得轉(zhuǎn)基因植株；轉(zhuǎn)化效率高，以潮霉素為篩選劑轉(zhuǎn)化率約21%，以卡那霉素為篩選劑轉(zhuǎn)化率可達(dá)24%。
[0019]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點:
本發(fā)明方法簡單，培養(yǎng)周期短，轉(zhuǎn)化效率高，成功實現(xiàn)了懷地黃的遺傳轉(zhuǎn)化，使外源基因在懷地黃中穩(wěn)定表達(dá)奠定了基礎(chǔ)，對地黃的遺傳改良和分子生物學(xué)研究有十分重要的意義。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0020]圖1為本發(fā)明以懷地黃葉片為外植體通過根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的懷地黃遺傳轉(zhuǎn)化的結(jié)果圖。A為葉片接種出為抗性愈傷誘導(dǎo)；(:為再生芽分化，D為再生芽增殖；E為再生地黃生根；F為轉(zhuǎn)基因地黃盆栽。
[0021]圖2為本發(fā)明轉(zhuǎn)基因懷地黃的PCR檢測圖。圖中M為DL2000分子Marker ;泳道I為陰性對照(未進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化的“溫85-5”植株);泳道2陽性對照(質(zhì)粒載體pCAMBIA1301);泳道3至13為采用實施例1中技術(shù)方案遺傳轉(zhuǎn)化后不同的地黃植株。
[0022]圖3為抗性愈傷與轉(zhuǎn)基因地黃⑶S活性檢測圖。A為⑶S活性檢測實驗；B為抗性愈傷；C-D為分化再生芽；E為再生植株疋為再生植株葉片；1為未轉(zhuǎn)化野生型地黃葉片GUS染色結(jié)果?！揪唧w實施方式】
[0023]以下以具體實施例來說明本發(fā)明的技術(shù)方案，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于此: 以下所用的MS基本培養(yǎng)基、乙酰丁香酮、6-芐氨基嘌呤和α-萘乙酸均為為Sigma公
司產(chǎn)品，潮霉素為Merk公司產(chǎn)品，胰蛋白胨和酵母提取物為Oxoid公司產(chǎn)品，特美汀為上海塵前生物科技有限公司產(chǎn)品，卡那霉素、利福霉素、瓊脂粉、X-gluc均為上海生工生物工程公司產(chǎn)品，其它試劑均為國產(chǎn)分析純。PCR擴(kuò)增特異引物由上海生工生物工程公司合成。根癌農(nóng)桿菌LBA4404、載體pCAMBIA1301和pBil21均由福建農(nóng)林大學(xué)作物遺傳育種與綜合利用教育部重點實驗室提供。
[0024]實施例1
農(nóng)桿菌介導(dǎo)的懷地黃遺傳轉(zhuǎn)化方法，步驟如下:
I)將田間挖取的懷地黃優(yōu)良品種“溫85-5”的塊根洗凈，自來水沖洗12 h，用70%的酒精表面消毒30 s,無菌水沖洗3次,然后用0.1%的HgCl2消毒10 min,無菌水沖洗6次，置于無菌濾紙上晾干。將帶芽眼的部分切成長1.5 cm小塊放入MS基本培養(yǎng)基中，14 h/d、4000 lux光照，于25±1°C下培養(yǎng)，15 d后把再生芽轉(zhuǎn)至新的MS基本培養(yǎng)基，30 d繼代一次。
[0025]2)把含載體pCAMBIA1301的根癌農(nóng)桿菌LBA4404在YEB固體培養(yǎng)基上劃線活化，于27°C下，暗培養(yǎng)48 h，挑取單克隆菌落接種到20 mL YEB液體培養(yǎng)基中，于27°C下，180rpm振蕩培養(yǎng)24 h，取100 μ L的菌液接種到50 mL的YEB液體培養(yǎng)基中，于27°C下，180rpm振蕩培養(yǎng),菌液濃度至0D_=0.5,于4°C, 4000 rpm條件下離心10 min收集菌體,棄上清，用無菌的侵染培養(yǎng)基懸浮菌體至OD6tltl=0.5待用；所述的YEB液體培養(yǎng)基為:YEB基本培養(yǎng)基+卡那霉素50 mg/L+利福 霉素50mg/L+蔗糖5 g/L ;所述的YEB固體培養(yǎng)基還含有瓊脂粉15 g/L ;所述的侵染培養(yǎng)基為:MS基本培養(yǎng)基+乙酰丁香酮100 Mmol/L+蔗糖30 g/L0
[0026]3)將懷地黃無菌苗的葉片去掉主脈，剪成長寬0.5X0.5 cm的小塊，置于制備好的侵染菌液中浸泡5 min，用無菌濾紙吸去葉盤上多余的菌液，接種到無篩選抗生素的培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)48 h ;無篩選抗生素的培養(yǎng)基為:MS基本培養(yǎng)基+6-芐氨基嘌呤2.0 mg/L+α-萘乙酸0.lmg/L+乙酰丁香酮100 Mmol/L+鹿糖30 g/L+瓊脂粉9 g/L。
[0027]4)共培養(yǎng)后的葉盤轉(zhuǎn)接到含12 mg/L潮霉素的篩選培養(yǎng)基上(圖1A)，14 h/d、4000lux光照，于25±1°C下培養(yǎng)，4周后長出抗性愈傷(圖1B)。單獨把抗性愈傷轉(zhuǎn)接到新的篩選培養(yǎng)基上，3周后長出抗性芽(圖1C);所述篩選培養(yǎng)基為:MS基本培養(yǎng)基+6-芐氨基嘌呤2.0 mg/L+a-萘乙酸0.1 mg/L+特美汀200 mg/L+潮霉素12 mg/L +蔗糖30g/L+瓊脂粉9 g/L。
[0028]5)將長2 cm的抗性芽轉(zhuǎn)接到叢生芽分化培養(yǎng)基中，14 h/d、4000 lux光照，于25±1°C下培養(yǎng)3周，進(jìn)行抗性芽擴(kuò)繁(圖1D)。把長2 cm的叢生芽剪下轉(zhuǎn)接入生根培養(yǎng)基中10d，誘導(dǎo)生根(圖1E)。待根伸長2 cm時把組培瓶口打開，添加I cm深的無菌水煉苗I周左右，移栽到營養(yǎng)土中在溫室里繼續(xù)生長(圖1F);所述的叢生芽分化培養(yǎng)基為:MS基本培養(yǎng)基+6-芐氨基嘌呤0.2 mg/L+a-萘乙酸0.0 lmg/L+特美汀200 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂粉9 g/L ;所述的生根培養(yǎng)基為:MS基本培養(yǎng)基+ a -萘乙酸0.0 lmg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂粉9 g/L。[0029]6)取所獲得的抗性再生植株的葉片，采用CTAB法提取葉片的基因組DNA，用潮霉素標(biāo)記基因特異引物 5’ -ATCGAAATTGCCGTCAACC-3’ / 5’ -ACAGCGTCTCCGACCTGAT-3’ 進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果11個抗性植株中有9個擴(kuò)增出794 bp的特異片段(圖2)。⑶S染色參照J(rèn)efferson 等(The EMBO journal, 1987，13: 3901-3907)的方法進(jìn)行，并做適當(dāng)修改。將抗性愈傷、再生芽和幼苗浸沒在葡萄糖苷酶(GUS)染色液[50 mmol/L磷酸鈉緩沖液(pH7.0), 0.5 mmol /L 鐵氰化鉀,0.5 mmol/L 亞鐵氰化鉀，10 mmol /T, EDTA-Na2,0.1%(ν/ν)Triton X-100，10 mmol/L X-gluc]中，37°C暗培養(yǎng) 24 h，分別用 50%、70% 和 100% 乙醇去除葉綠素，顯微鏡下觀察，結(jié)果愈傷、芽和葉片顯示藍(lán)色，證實已經(jīng)獲得了地黃轉(zhuǎn)基因植株(圖3)。
[0030]實施例2
重復(fù)實施例1，有以下不同點:步驟3)中葉盤置于制備好的侵染菌液中浸泡10 min，步驟4)中篩選培養(yǎng)基中潮霉素的濃度為15 mg/L。
[0031]實施例3
重復(fù)實施例1，有以下不同點:步驟2)農(nóng)桿菌包含的質(zhì)粒載體為pBil21，步驟4)篩選培養(yǎng)基中以卡那霉素為篩選劑，濃度為50 mg/L ο
[0032]實施例4
重復(fù)實施例1，有以下不同點:步驟2)農(nóng)桿菌包含的質(zhì)粒載體為pBil21，步驟3)葉盤置于制備好的侵染菌液中 浸泡10 min，步驟4)篩選培養(yǎng)基中以卡那霉素為篩選劑，濃度為75 mg/Lο
【權(quán)利要求】
1.一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的懷地黃遺傳轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，以懷地黃無菌苗初展開葉片去葉脈后剪成的葉盤作為根癌農(nóng)桿菌感染的受體，經(jīng)農(nóng)桿菌侵染、共培養(yǎng)、抗性愈傷誘導(dǎo)、抗性芽分化、抗性芽生根，最終獲得地黃的轉(zhuǎn)基因植株。
2.如權(quán)利要求1所述的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的懷地黃遺傳轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，葉盤被農(nóng)桿菌侵染后先接種在無篩選抗生素的培養(yǎng)基上共培養(yǎng)48-72 h，之后接種到含有潮霉素或卡那霉素的篩選培養(yǎng)基上獲得抗性愈傷和抗性芽，再把抗性芽接種到增殖培養(yǎng)基上增殖，在生根培養(yǎng)基上生根，獲得轉(zhuǎn)基因地黃植株。
3.如權(quán)利要求2所述的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的懷地黃遺傳轉(zhuǎn)化方法,其特征在于,懷地黃無菌苗的準(zhǔn)備如下:將田間挖取的直徑1-2 cm的懷地黃塊根洗凈，依次用酒精和HgCl2消毒，之后用無菌水沖洗5-6次；將帶芽眼的部分切成長1.5-2 cm小塊放入MS基本培養(yǎng)基中，14h/d,3000-4000 lux光照，于25±1°C下培養(yǎng)，15 d后把再生芽轉(zhuǎn)至新的MS基本培養(yǎng)基，30d繼代一次。
4.如權(quán)利要求2所述的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的懷地黃遺傳轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，根癌農(nóng)桿菌菌株的活化與侵染菌液的制備如下:把鑒定正確的根癌農(nóng)桿菌在YEB固體培養(yǎng)基上劃線活化，于27°C下，暗培養(yǎng)48 h ;挑取單克隆菌落接種到20-30 mL的YEB液體培養(yǎng)基中，于27°C下，180 rpm振蕩培養(yǎng)24 h;取100 yL上述菌液接種到50 mL的YEB液體培養(yǎng)基中，于27 °C下，180 rpm振蕩培養(yǎng)，菌液濃度至OD600=0.4-0.8,于4。。, 4000 rpm條件下離心10 min收集菌體，棄上清，用侵染培養(yǎng)基懸浮至0D_=0.5獲得侵染菌液待用。
5.如權(quán)利要求4所述的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的懷地黃遺傳轉(zhuǎn)化方法,其特征在于，所述的YEB液體培養(yǎng)基為:YEB基本培養(yǎng)基+卡那霉素50 mg/L+利福霉素50 mg/L+鹿糖5 g/L ;所述的YEB固體培養(yǎng)基還含有瓊脂粉15 g/L ;所述的侵染培養(yǎng)基為:MS基本培養(yǎng)基+乙酰丁香酮100 Mmol/L+鹿糖 30 g/L。
6.如權(quán)利要求5所述.的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的懷地黃遺傳轉(zhuǎn)化方法,其特征在于,將懷地黃無菌苗的葉片去掉主脈，剪成長寬約0.5-1.0 cm的葉盤，置于制備好的侵染菌液中浸泡5-10min，用無菌濾紙吸去葉盤上多余的菌液，接種到無篩選抗生素的培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)，所述的培養(yǎng)基為:MS基本培養(yǎng)基+6-芐氨基嘌呤2.0 mg/L+ α -萘乙酸0.1 mg/L+乙酰丁香酮100Mmol/L+蔗糖 30 g/L+瓊脂粉 9 g/L。
7.如權(quán)利要求6所述的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的懷地黃遺傳轉(zhuǎn)化方法,其特征在于，共培養(yǎng)48-72h后的葉盤轉(zhuǎn)接到含抗生素的篩選培養(yǎng)基上，14 h/d,3000-4000 lux光照，于25± 1°C下培養(yǎng)，2周后更換一次培養(yǎng)基，3-4周后把長出的抗性愈傷轉(zhuǎn)接到新的篩選培養(yǎng)基上，2-3周長出抗性芽；所述含抗生素的篩選培養(yǎng)基為:MS基本培養(yǎng)基+6-芐氨基嘌呤2.0 mg/L+α-萘乙酸0.1 mg/L+特美汀200 mg/L+潮霉素10-15 mg/L或卡那霉素50-75 mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂粉9 g/L。
8.如權(quán)利要求2所述的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的懷地黃遺傳轉(zhuǎn)化方法,其特征在于,將長2-3cm的抗性芽轉(zhuǎn)接到叢生芽分化培養(yǎng)基中，14 h/d,3000-4000 lux光照，于25±1°C下培養(yǎng)，進(jìn)行抗性芽擴(kuò)繁；把長2-3 cm的叢生芽剪下轉(zhuǎn)接入生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根；所述的叢生芽分化培養(yǎng)基為:MS基本培養(yǎng)基+6-芐氨基嘌呤0.2 mg/L+ α -萘乙酸0.01 mg/L+特美汀200mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂粉9 g/L ;所述的生根培養(yǎng)基為:MS基本培養(yǎng)基+ α -萘乙酸0.01mg/L+ 鹿糖 30 g/L+ 瓊脂粉 9 g/L。
9.如權(quán)利要求1-8任一所述的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的懷地黃遺傳轉(zhuǎn)化方法,其特征在于,所述方法步驟如下: (1)懷地黃無菌苗的準(zhǔn)備:將田間挖取的直徑約1-2cm的懷地黃塊根洗凈，用體積濃度為70%的酒精表面消毒30 S，然后用質(zhì)量濃度為0.1%的HgCl2消毒10-15 min，無菌水沖洗5-6次；將帶芽眼的部分切成1.5-2 cm小塊放入MS基本培養(yǎng)基中，14 h/d,3000-4000lux光照，于25±1°C下培養(yǎng)，15 d后把再生芽轉(zhuǎn)至新的MS基本培養(yǎng)基，30 d繼代一次； (2)菌株的活化與侵染菌液的制備:把鑒定正確的根癌農(nóng)桿菌在YEB固體培養(yǎng)基上劃線活化，于27°C下，暗培養(yǎng)48 h，挑取單克隆菌落接種到20-30 mL YEB液體培養(yǎng)基中，于27°C下，180 rpm振蕩培養(yǎng)24 h，取100 μ L的菌液接種到50 mL的YEB液體培養(yǎng)基中，于27°C下，180 rpm振蕩培養(yǎng),菌液濃度至OD6qq=0.4-0.8,于4°C,4000 rpm條件下離心10 min收集菌體，棄上清，用侵染培養(yǎng)基懸浮至0D_=0.5待用； (3)侵染和共培養(yǎng):將懷地黃無菌苗的葉片去掉主脈，剪成長寬約0.5-1.0 cm的小塊即葉盤，置于制備好的侵染菌液中浸泡5-10 min，用無菌濾紙吸去葉盤上多余的菌液，接種到無篩選抗生素的培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)48-72 h； (4)外植體的抗性愈傷誘導(dǎo)和再生芽分化:共培養(yǎng)后的葉盤轉(zhuǎn)接到含抗生素的篩選培養(yǎng)基上，14 h/d,3000-4000 lux光照，于25±1°C下培養(yǎng)，2周后更換一次培養(yǎng)基，3-4周后把抗性愈傷轉(zhuǎn)接到新的篩選培養(yǎng)基上，2-3周長出抗性芽； (5)再生芽增殖和生根:將長2-3cm的抗性芽轉(zhuǎn)接到叢生芽分化培養(yǎng)基中，14 h/d、3000-4000 lux光照，于25±1°C下培養(yǎng)，進(jìn)行抗性芽擴(kuò)繁；把長2-3 cm的叢生芽剪下轉(zhuǎn)接入生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根。
10.如權(quán)利要求9所述的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的懷地黃遺傳轉(zhuǎn)化方法,其特征在于,所述的侵染培養(yǎng)基在制備時pH值調(diào)至7.0，各種 植物培養(yǎng)基制備時pH值均調(diào)至5.8，121°C高壓滅菌20min，等培養(yǎng)基溫度降至50-60°C時，添加特美汀、潮霉素或卡那霉素，混勻分裝后備用。
【文檔編號】A01H4/00GK103468739SQ201310448326
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2013年9月27日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月27日
【發(fā)明者】王豐青, 張重義, 魏荷, 陳新建, 孫紅正, 高致明, 李娟 , 杜家方, 周艷 申請人:河南農(nóng)業(yè)大學(xué)