一種抗昆蟲毒素及其編碼序列以及重組毒素的制備與應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種抗昆蟲毒素及其編碼序列以及重組毒素的制備與應(yīng)用。本發(fā)明通過構(gòu)建cDNA文庫，從中國江蘇少棘蜈蚣毒腺中克隆得到蜈蚣抗昆蟲毒素基因。并通過將密碼子優(yōu)化后全合成的重組蜈蚣抗昆蟲毒素基因Scolotoxin-Ssm2.2與載體pSUMO-Mutant連接得到重組表達(dá)載體pSUMO-M-Scolotoxin-Ssm2.2，將該重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3)，篩選得到高效表達(dá)菌株。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)親和層析，得到具有生物學(xué)活性的多肽——rScolotoxin-Ssm2b。本發(fā)明提供的多肽rScolotoxin-Ssm2b具有昆蟲神經(jīng)毒性和昆蟲致死作用，可用于制備神經(jīng)生物學(xué)研究的工具試劑和生物殺蟲劑，也可用于蜈蚣神經(jīng)毒素空間結(jié)構(gòu)及藥理學(xué)活性等研究。
【專利說明】—種抗昆蟲毒素及其編碼序列以及重組毒素的制備與應(yīng)用
[0001]
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明涉及一種抗昆蟲毒素及其編碼序列以及重組毒素的制備與應(yīng)用，更為具體的說是涉及一種中國江蘇少棘蜈蚣抗昆蟲毒素基因SC0l0t0Xin-Ssm2.2及其編碼的多肽Scolotoxin-Ssm2b和該多肽的重組制備技術(shù)，以及該毒素在神經(jīng)生物學(xué)研究和殺蟲藥物開發(fā)中的應(yīng)用。
[0003]
【背景技術(shù)】 [0004]蜈蟻(centipede)是節(jié)肢動物門Arthropoda唇足綱Chilopoda動物的總稱，全世界約有 3300 種(Edgecombe, G.D., Giribet, G., Ann.Rev.Entomo1.2007.52,151-170.)。蜈蚣科蜈蚣(以下所稱蜈蚣皆指此類)為其中最兇猛的捕食者，主要以昆蟲和小型無脊椎動物為食，大型蜈蚣也能捕食蟾蜍、蛇、以至蝙蝠和大鼠等脊椎動物。蜈蚣通過向獵物注入毒液，直接殺死或麻痹獵物而捕食之。與蜘蛛、蝎等捕食性節(jié)肢動物一樣，在長期的進(jìn)化過程中，蜈蚣毒液系統(tǒng)發(fā)展出了一系列結(jié)構(gòu)獨特、性能高效且特異的毒素。然而，與對蜘蛛和蝎各近百種抗昆蟲毒素的深入研究相比，人們對蜈蚣抗昆蟲毒素的研究相當(dāng)薄弱(E.F.Schwartz等,Pept Sc1.2012.98 (4): 385 - 405.),迄今僅見一例蜈蟲公抗昆蟲毒素基因的重組表達(dá)(中國專利CN 103088030A)。
[0005]最新的研究揭示，蜈蚣毒液中不僅含有高豐度的新型高分子量毒液蛋白/酶類，也含有分子骨架顯著不同于已知毒素的多肽類毒素(E.A.B.Undheim等，Toxicon.57 (2011) 512 - 524),包括多種離子通道毒素(Yang 等，Mol Cell Proteomics.2012; 11 (9):640-50.;Liu 等，J Proteome Res.2012; 11 (12):6197-212.)，因而被學(xué)界視作“新型生物活性分子的豐富來源”。從蜈蚣毒腺中分離獲得新的高效、特異的昆蟲神經(jīng)毒素基因及其多肽，進(jìn)而重組表達(dá)或通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)進(jìn)入相應(yīng)的受體，在開發(fā)新的神經(jīng)生物學(xué)研究試劑和農(nóng)業(yè)與環(huán)境害蟲的生物防治中，具有廣闊的應(yīng)用前景。
[0006]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是提供一種全新的一種抗昆蟲毒素及其編碼序列以及重組毒素的制備與應(yīng)用，并進(jìn)一步得到可以應(yīng)用于神經(jīng)毒性類制劑，特別是殺蟲劑的多肽產(chǎn)物重組蜈蚣抗昆蟲毒素rSC0l0t0Xin-Ssm2b。在這一過程中，我們還同時得到了一種重組表達(dá)載體pSUM0-M-Scolotoxin-Ssm2.2。
[0008]本發(fā)明通過構(gòu)建cDNA文庫和測序的方法，從中國江蘇少棘蜈蚣毒腺中分離獲得了新的蜈蚣抗昆蟲毒素基因Scolotoxin-Ssm〗.2及其編碼的抗昆蟲毒肽SC0l0t0Xin-Ssm2.2b。通過密碼子優(yōu)化合成了重組蜈蚣抗昆蟲毒素基因rScolotoxin-Ssm2.2，在大腸桿菌中表達(dá)、純化得到重組蜈蚣抗昆蟲毒素rSC0l0t0Xin-Ssm2b。進(jìn)而檢測驗證了該重組蜈蚣抗昆蟲毒素的昆蟲神經(jīng)毒性及其在制備神經(jīng)毒性類制劑與殺蟲劑中的應(yīng)用可能，從而達(dá)到了本發(fā)明的發(fā)明目的。
[0009]本發(fā)明所選擇的蜈蟻屬于少棘蜈蟻(5: subspinipes,采自江蘇省南京市。
[0010]本發(fā)明包括以下技術(shù)方案:
一種蜈蚣抗昆蟲毒素多肽，具有SEQ ID NOl的氨基酸序列的多肽、或者其保守性變異多肽、或其活性衍生物。
[0011]該抗昆蟲毒素多肽選自以下組之一:
(a)由SEQID NOl所示的氨基酸序列組成的多肽；
(b)將(a)中的氨基酸序列經(jīng)過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失、添加或修飾而形成的具有相同功能的由(a)衍生的多肽。
[0012]一種多核苷酸，該多核苷酸包含有選自以下組之一的核苷酸序列:
(a)編碼2中的多肽的多核苷酸；也就是說編碼SEQID NOl中的氨基酸序列的核苷酸序列，以及編碼與SEQ ID NOl所示的氨基酸序列具有相同功能的由SEQ ID NOl衍生的多肽；
(b)與多核苷酸(a)互補的多核苷酸。
[0013]所述多核苷酸具有如SEQ ID N02所示的核苷酸序列。
[0014]一種重組蜈蚣抗昆蟲毒素基因rScolotoxin-Ssm2.2，具有如SEQ ID N03所示的核苷酸序列。
[0015]一種重組蜈蚣抗昆蟲毒素基因rScolotoxin-Ssm2.2的表達(dá)純化方法，包括如下步驟:
A，構(gòu)建含有重組蜈蚣抗昆蟲毒素基因rScolotoxin-Ssm2.2或含有重組蜈蚣抗昆蟲毒素基因 rScolotoxin_Ssm2.2 突變體基因的重組質(zhì)粒 pSUM0-M-Scolotoxin_Ssm2.2;
B，將重組質(zhì)粒pSUM0-M-Scolotoxin-Ssm2.2轉(zhuǎn)化至宿主細(xì)胞中，得到含有重組質(zhì)粒的工程菌株；
C，上述工程菌株經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，獲得含有重組蜈蚣抗昆蟲毒素的菌體；
D，將上述菌體清洗、離心、超聲破碎，收集上清液；
D，將上清液反復(fù)通過Ni2+-1DA親和層析柱純化，得到融合蛋白；
E,上述融合蛋白經(jīng)`過SUMO蛋白酶酶切，得到重組蜈蚣抗昆蟲毒素多肽rScolotoxin-Ssm2b。
[0016]本發(fā)明還特別公開了重組表達(dá)載體pSUM0-M-Scolotoxin-Ssm2.2的具體合成方法:
首先，按照大腸桿菌的密碼子偏好將蜈蟻毒素基因Scolotoxin-Ssm2.2的cDNA序列優(yōu)化，在該基因的5’端和3’端分別加入限制性內(nèi)切酶Stu I和Xho I的酶切位點，采用化學(xué)合成法合成了全長的Scolotoxin-Ssm2.2成熟肽結(jié)構(gòu)基因，經(jīng)DNA測序證實合成的基因與設(shè)計的完全一致。
[0017]其次，通過限制性內(nèi)切酶Stu I和Xho I雙酶切法對載體pSUMO-Mutant進(jìn)行酶切后得到線性化的載體pSUMO-Mutant。[0018]最后，利用DNA連接酶連接上述優(yōu)化改造過的蜈蚣抗昆蟲毒素基因Scolotoxin_Ssm2.2和線性化的載體pSUMO-Mutant,得到重組表達(dá)載體pSUM0-M-Scolotoxin-Ssm2.2。
[0019]本發(fā)明同時還公開了上述步驟C的具體步驟為:將含重組質(zhì)粒的工程菌株接種到LB培養(yǎng)液中，當(dāng)工程菌培養(yǎng)液濃度OD6tltl達(dá)到0.6^1.0時，加入IPTG至終濃度0.5mol/L,于18°C表達(dá)6小時，獲得含有重組蜈蚣抗昆蟲毒素的菌體。
[0020]本發(fā)明進(jìn)一步公開了步驟B中所述的宿主細(xì)胞是大腸桿菌BL21 (DE3)。
[0021]采用這一宿主細(xì)胞后，本發(fā)明所公開的多肽的表達(dá)方法可以描述為:
(1)將重組表達(dá)質(zhì)粒pSUM0-M-Scolotoxin-Ssm2.2轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)；
(2)培養(yǎng)轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌BL21(DE3)；
(3)對培養(yǎng)后的大腸桿菌BL21(DE3)進(jìn)行超聲裂解，收集上清；上清液經(jīng)Ni2+-1DA親和層析柱層析純化，得到重組融合蛋白；
(4)重組融合蛋白經(jīng)SUMO蛋白酶酶切，得到目的多肽rScolotoxin-Ssm2b與標(biāo)簽SUMO蛋白的混合物；
(5)目的多肽rScolotoxin-Ssm2b與標(biāo)簽SUMO蛋白的混合物再次經(jīng)Ni2+-1DA親和柱層析純化，得到重組毒肽rScolotoxin-Ssm2b。
[0022]上述多肽的表達(dá)方法使用重組表達(dá)載體pSUM0-M-Scolotoxin-Ssm2.2作為表達(dá)質(zhì)粒，表達(dá)效率較高， 且優(yōu)化了培養(yǎng)條件和純化分離方式，有效提高了多肽rScolotoxin-Ssm2b 的表達(dá)量。
[0023]本發(fā)明通過鱗翅目、直翅目和蜚蠊目昆蟲注射實驗發(fā)現(xiàn)，一定濃度的多肽rScolotoxin- Ssm2b具有明顯的昆蟲神經(jīng)毒性和殺蟲效果。因此，多肽rScolotoxin_Ssm2b可應(yīng)用于制備神經(jīng)生物學(xué)研究的工具試劑和生物殺蟲劑。
[0024]具體說:重組蜈蚣抗昆蟲毒素rScolotoxin-Ssm2b在制備神經(jīng)毒性類制劑中的應(yīng)用；特別是重組蜈蚣抗昆蟲毒素rScolotoxin-Ssm2b在制備殺蟲劑中的應(yīng)用。
[0025]進(jìn)一步地，本發(fā)明限定了所述重組蜈蚣抗昆蟲毒素rSC0l0t0Xin-Ssm2b中優(yōu)選含有兩對正確連接的共價二硫鍵。
[0026]在本發(fā)明中，“重組蜈蚣抗昆蟲毒素rScolotoxin-Ssm2b”與“重組蜈蚣抗昆蟲毒素”或者“重組蜈蚣抗昆蟲多肽”可以互相替換使用。
[0027]在本發(fā)明中，所用的多肽片段、衍生物或者是類似物等屬于是指基本保持本發(fā)明重組蜈蚣抗昆蟲毒素生物學(xué)功能或者活性的多肽。本發(fā)明的多肽片段、衍生物或類似物可以是(I)有一個或多個保守或非保守性氨基酸殘基(優(yōu)選保守性氨基酸殘基)被取代的多肽，而這樣的取代的氨基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的，或(2)在一個或多個氨基酸殘基中具有取代基團(tuán)的多肽，或(3)成熟多肽與另一個化合物融合所形成的多肽，或(4)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前導(dǎo)序列或分泌序列或用來純化此多肽的序列)。根據(jù)本文所述，這些片段、衍生物和類似物屬于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員公知的范圍。
[0028]本發(fā)明多核苷酸可以是DNA形式或者是RNA形式。
[0029]“編碼多肽的多核苷酸”可以是包括編碼此多肽的多核苷酸，也可以是還包括你附加編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。[0030]本發(fā)明所公開的抗昆蟲毒素是一個全新的多肽，同時其在殺蟲劑以及神經(jīng)毒性制劑中的用途具有極大的應(yīng)用前景，可以用于制備神經(jīng)生物學(xué)研究的工具試劑或生物殺蟲劑，也可用于蜈蚣神經(jīng)毒素空間結(jié)構(gòu)及藥理學(xué)活性等研究。
[0031]【專利附圖】

【附圖說明】
圖1少棘蜈蟻抗昆蟲毒素基因Scolotoxin_Ssm2.2的DNA序列測定圖譜。
[0032]圖2 重組蜈蚣抗昆蟲毒素合成基因Scolotoxin-Ssm2.2與天然Scolotoxin-Ssm2.2基因及其編碼的氨基酸序列比對圖；其中
第一行為少棘蜈蚣天然毒素基因Sc0l0t0Xin-Ssm2.2的DNA序列，為了方便標(biāo)示，僅給出與人工設(shè)計序列不同的堿基，其余未標(biāo)出部分與第二行中的堿基相同；第二行為重組蜈蚣抗昆蟲毒素合成基因rScolotoxin-Ssm2.2的DNA序列；第三行為對應(yīng)的重組蜈蚣抗昆蟲毒素rScolotoxin_Ssm2b的多妝序列。
[0033]圖3重組蜈蟻抗昆蟲毒素合成基因rScolotoxin_Ssm2.2的DNA序列測定圖譜。
[0034]圖4表達(dá)載體pSUMO-Mutant的物理圖譜和多克隆位點示意圖。
[0035]圖5重組表達(dá)載體pSUM0-M-Scolotoxin_Ssm2.2的構(gòu)建流程。
[0036]圖6重組表達(dá)載體pSUM0-M-Scolotoxin_Ssm2.2的質(zhì)粒DNA瓊脂糖凝膠電泳圖。
[0037]圖中M:分子量標(biāo)記；1:重組質(zhì)粒Xhol/Xbal酶切結(jié)果。
[0038]圖7經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)的工程菌表達(dá)融合蛋白的SDS-PAGE分析圖譜
圖中M:分子量標(biāo)記；1:未誘導(dǎo)菌總蛋白；2、3:誘導(dǎo)菌總蛋白；4:誘導(dǎo)菌超聲沉淀；5:誘導(dǎo)菌超聲上清。
`[0039]圖8重組融合蛋白與目標(biāo)多肽rScolotoxin_Ssm2b分離的SDS-PAGE分析圖譜 圖中M:分子量標(biāo)記；1:超聲上清；2:鎳柱純化上樣流出液；3:鎳柱純化洗脫液；4:酶
切混合液；5:酶切液再過柱的流出液(目標(biāo)肽)；6:酶切液再過柱的洗脫液(標(biāo)簽蛋白)。
[0040]
【具體實施方式】
[0041]以下結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步說明本發(fā)明的技術(shù)方案。應(yīng)理解，以下實施例只用于說明本發(fā)明而不以任何形式限制本發(fā)明。
[0042]實施例1:蜈蚣毒腺總RNA的提取與毒素cDNA克隆及序列測定
活體解剖分離蜈蚣毒腺并立即投入液氮中。于液氮中磨碎毒腺后，用Trizol Reagent(Invitrogen)試劑盒提取總 RNA,按 SMART? cDNA Library Construction Kit 說明書操作進(jìn)行cDNA第一鏈合成，LD- PCR擴(kuò)增合成第二鏈，蛋白酶K消化、SfiI酶切和柱回收cDNA,與載體λ TriplEx2連接、包裝。帶有插入片斷的載體通過電轉(zhuǎn)化導(dǎo)入萬.co7i DHlOB感受態(tài)細(xì)胞，SOC培養(yǎng)基37°C IhlOOrpm恢復(fù)，涂于帶有誘導(dǎo)劑IPTG和X-Gal顯色劑的瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)過夜。挑取白斑，PCR快速鑒定插入片斷大小。檢驗合格的cDNA文庫大規(guī)模培養(yǎng)，標(biāo)準(zhǔn)堿裂解法提取模板，ABI 3730測序儀測序，獲得中國江蘇少棘蜈蚣毒素基因Scolotoxin-Ssm2.2cDNA序列，測序結(jié)果參見附圖1。
[0043]實施例組2
實施例2-1重組表達(dá)載體pSUM0-M-Scolotoxin-Ssm2.2的構(gòu)建 (I) Scolotoxin-Ssm2.2基因的優(yōu)化與合成按照大腸桿菌的密碼子偏好將蜈蚣毒素基因Sc0l0t0Xin-Ssm2.2的cDNA序列優(yōu)化，并在該基因的5’端和3’端分別加上限制性內(nèi)切酶Stu I和Xho I的酶切位點，合成出全長的Scolotoxin-Ssm〗.2成熟肽結(jié)構(gòu)基因，其核苷酸序列與天然毒素的核苷酸序列比對參見附圖2。
[0044](2)重組表達(dá)載體 pSUMO-M-Scolotoxin-Ssm2.2 的構(gòu)建:
將合成的Scolotoxin-Ssm2.2DNA經(jīng)限制酶Stu 1、XhoI雙酶切后連接到表達(dá)載體pSUMO- Mutant中，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，測序。結(jié)果正確，說明克隆成功，得到重組 表達(dá)載體pSUM0-M-Scolotoxin-Ssm2.2，重組基因序列參見附圖3。
[0045]實施例2-2重組蜈蟻抗昆蟲毒素rScolotoxin_Ssm2b的高效原核表達(dá)
(I)重組蜈蚣抗昆蟲毒素融合蛋白的表達(dá)
制備大腸桿菌BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞，將測序正確的重組表達(dá)載體pSUMO-M-Scolotoxin-Ssm2.2利用熱休克法(42°C熱激45秒)轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21 (DE3)中，得到含有重組質(zhì)粒的工程菌株，其構(gòu)建基礎(chǔ)及構(gòu)建流程參考圖4與圖5，構(gòu)建結(jié)果檢測參見圖6。
[0046]挑取工程菌株單菌落接種于Kan + LB液體豐富培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)過夜。次日取該過夜菌按1: 100體積比接種于新鮮的Kan+LB豐富培養(yǎng)基中，37°C劇烈振蕩放大培養(yǎng)至OD6c?約為0.6，加入IPTG至終濃度為0.5mmol/L，于18°C誘導(dǎo)表達(dá)6h。誘導(dǎo)結(jié)束后，4°C、10, OOOrpm 離心 IOmin,收菌。
[0047]所得菌體用預(yù)冷的PBS緩沖液(pH7.4)洗滌菌體一次，離心，再用預(yù)冷的LysisBuffer (50mmol/L NaH2P04，300mmol/LNaCl，10mmol/L 咪唑，pH 8.0)以 1: 10 的比例重懸。以200W功率在冰浴中超聲20 min破碎細(xì)菌細(xì)胞。超聲結(jié)束后，用4°C、12，OOOg離心20min,收集含重組融合蛋白的上清。含空載質(zhì)粒pSUMO-M的對照菌株BL21 (DE3)同樣處理，收集含標(biāo)簽蛋白的上清。SDS-PAGE電泳檢測到該基因的表達(dá)產(chǎn)物占全菌蛋白的27.66%，電泳結(jié)果見附圖7。
[0048](2)重組蜈!I公抗昆蟲毒素rScolotoxin_Ssm2b的制備 (2.1)重組蜈蚣抗昆蟲毒素融合蛋白的親和層析
采用Biologic LP層析系統(tǒng)將上清液以0.5 ml/min流速上樣至Ni2+-1DA BindingBuffer (20 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 5 mM imidazole, 6 M guanidine-HCl, pH8.0)預(yù)平衡的 Ni2+-1DA Sepharose CL-6B 親和層析柱(0.8 cmX 2 cm);用 Ni2+-1DA BindingBuffer以0.5 ml/min流速沖洗，至流出液OD28tl值到達(dá)基線，收樣留以電泳，參看附圖8 中的第一泳道；用 Ni2+-1DA Washing Buffer (20 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 20 mMimidazole, pH8.0)以0.5 ml/min流速沖洗,至流出液OD28c!值到達(dá)基線，收樣留以電泳，參看附圖 8 中的第二泳道；用 Ni2+-1DA Elution Buffer (20 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl,250 mM imidazole, pH8.0)以0.5 ml/min流速沖洗,至流出液OD28c!值到達(dá)基線，收樣。通過上述親和層析步驟對上述重組融合蛋白作進(jìn)一步純化，收集，多次純化后產(chǎn)品參看附圖8中的第三泳道。對照樣品同樣處理獲得純化后的標(biāo)簽蛋白——SUMO蛋白。
[0049](2.2)重組蜈蚣抗昆蟲毒素rScolotoxin-Ssm2b的制備
取上述收集的重組融合蛋白按20:1 (V/V)比例加入SUMO蛋白酶，30°C切割半小時，混合液參看附圖8中第四泳道，獲得目標(biāo)多肽一重組蜈蚣抗昆蟲毒素rScolotoxin- Ssm2b多肽(附圖8中的第五泳道)及SUMO標(biāo)簽蛋白的混合物(見附圖8中的第六泳道)。對照樣品同樣處理，僅含標(biāo)簽SUMO蛋白。
[0050]實施例3重組蜈蚣抗昆蟲毒素rScolotoxin-Ssm2b對鱗翅目模式昆蟲家蠶的毒性鑒定
基本方案:體腔注射法。本實施例中通過對鱗翅目模式昆蟲家蠶幼蟲的體腔注射實驗鑒定由蜈蟻抗昆蟲毒素基因Scolotoxin_Ssm2.2編碼的多肽rScolotoxin_Ssm2b的昆蟲神
經(jīng)毒性。
[0051]實驗步驟:實驗對象為鱗翅目模式昆蟲家蠶多化性品種大造(由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所張國政研究員提供)的五齡幼蟲，每組30頭，重復(fù)3次。待測藥品為過濾除菌的rScolotoxin_Ssm2b多肽與SUMO標(biāo)簽蛋白的混合物,其中的多肽rScolotoxin_Ssm2b的工作濃度為10 ug/ml，對照試劑為同樣處理的SUMO標(biāo)簽蛋白。從蠶體第8和第9腹節(jié)右側(cè)的節(jié)間膜處注入試藥10 μ I后，觀察并記載蟲體的活動狀況，統(tǒng)計死亡數(shù)量，計算死亡率。
[0052]結(jié)果分析:注入毒液后10秒內(nèi)，蠶體即劇烈扭轉(zhuǎn)、痙攣，迅速吐液，持續(xù)數(shù)分鐘后，家蠶頭胸伸出、軀體收縮、肛門拖糞、腹足失去抓握力而側(cè)翻倒地、軟癱至死。其中的多數(shù)個體于2小時內(nèi)中毒死亡；24小時3個給藥組的死亡率皆達(dá)100% (表1)。而注射SUMO標(biāo)簽蛋白的對照組家蠶僅在注射后數(shù)分鐘內(nèi)靜伏，I小時后全部恢復(fù)正常爬動，無任何中毒癥狀；24小時內(nèi)也無一死亡。由此可得，多肽rScolotoxin_Ssm2b對鱗翅目模式昆蟲家蠶具有顯著的神經(jīng)毒性及致死作用，可用于制備神經(jīng)生物學(xué)研究的工具試劑及生物殺蟲劑。
[0053]表1 rScolotoxin_Ssm2b對家蠶幼蟲的神經(jīng)毒性與致死性
【權(quán)利要求】
1.一種抗昆蟲毒素多肽，其特征是:具有SEQ ID NOl的氨基酸序列的多肽、或者其保守性變異多肽、或其活性衍生物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗昆蟲毒素多肽，其特征在于:該抗昆蟲毒素多肽選自以下組之一: (a)由SEQID NOl所示的氨基酸序列組成的多肽； (b)將(a)中的氨基酸序列經(jīng)過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失、添加或修飾而形成的具有相同功能的由(a)衍生的多肽。
3.—種多核苷酸,該多核苷酸包含有選自以下組之一的核苷酸序列: Ca)編碼權(quán)利要求2的多肽的多核苷酸； (b)與多核苷酸(a)互補的多核苷酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的多核苷酸，其特征是所述多核苷酸具有如SEQID N02所示的核苷酸序列。
5.一種重組蜈蚣抗昆蟲毒素基因rScolotoxin-Ssm2.2，其特征是具有如SEQ ID N03所示的核苷酸序列。
6.一種重組蜈蚣抗昆蟲毒素基因rScolotoxin-Ssm2.2的表達(dá)純化方法，其特征是包括如下步驟: A，構(gòu)建含有重組蜈蚣抗昆蟲毒素基因rScolotoxin-Ssm2.2或含有重組蜈蚣抗昆蟲毒素基因 rScolotoxin_Ssm2.2 突變體基因的重組質(zhì)粒 pSUMO-M-Scolotoxin- Ssm2.2; B，將重組質(zhì)粒pSUM0-M-Scolotoxin-Ssm2.2轉(zhuǎn)化至宿主細(xì)胞中，得到含有重組質(zhì)粒的工程菌株； C，上述工程菌株經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，獲得含有重組蜈蚣抗昆蟲毒素的菌體； D，將上述菌體清洗、離心、超聲破碎，收集上清液； D，將上清液反復(fù)通過Ni2+-1DA親和層析柱純化，得到融合蛋白； E,上述融合蛋白經(jīng)過SUMO蛋白酶酶切，得到重組蜈蚣抗昆蟲毒素rScolotoxin-Ssm2b0
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的重組蜈蚣抗昆蟲毒素基因rScolotoxin-Ssm〗.2的表達(dá)純化方法，其特征是選自以下任一或任意幾個優(yōu)選條件: (1)所述步驟C的具體步驟為:將重組質(zhì)粒的工程菌株接種到LB培養(yǎng)液中，當(dāng)工程菌培養(yǎng)液濃度OD6tltl達(dá)到0.6^1.0時，加入IPTG至終濃度0.5mol/L,于18°C表達(dá)6小時，獲得含有重組蜈蚣抗昆蟲毒素的菌體； (2)步驟B中所述的宿主細(xì)胞是大腸桿菌BL21(DE3)。
8.根據(jù)權(quán)利要求6至7中任意一項所述的重組蜈蚣抗昆蟲毒素rScolotoxin-Ssm2.2基因的表達(dá)純化方法得到的重組蜈蚣抗昆蟲毒素rScolotoxin-Ssm2b。
9.重組蜈蚣抗昆蟲毒素rScolotoxin-Ssm2b在制備神經(jīng)毒性類制劑中的應(yīng)用；特別是重組蜈蚣抗昆蟲毒素rScolotoxin-Ssm2b在制備殺蟲劑中的應(yīng)用。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的重組蜈蚣抗昆蟲毒素rScolotoxin-Ssm2b在制備神經(jīng)毒性類制劑中的應(yīng)用，其特征是所述重組蜈蚣抗昆蟲毒素rScolotoxin-Ssm2b中含有兩對正確連接的共價二硫鍵。
【文檔編號】A01N47/44GK103724411SQ201310443624
【公開日】2014年4月16日 申請日期:2013年9月26日 優(yōu)先權(quán)日:2013年6月21日
【發(fā)明者】華衛(wèi)建 申請人:江蘇教育學(xué)院