一種冬蟲夏草子實(shí)體及其培植方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及微生物領(lǐng)域，公開了一種冬蟲夏草子實(shí)體及其培植方法。本發(fā)明所述培植方法將中國被毛孢菌接種在固體培養(yǎng)基上，在避光、14-20℃和45-60%相對濕度的條件下進(jìn)行菌落培養(yǎng)35-55天，然后轉(zhuǎn)至避光、10-15%氧氣濃度、0-10℃和70-90%相對濕度的條件下誘導(dǎo)子實(shí)體至子實(shí)體長出。本發(fā)明將中國被毛孢菌接種于特定的培養(yǎng)基中，并控制中國被毛孢在不同生長階段的濕度和溫度等條件，在低溫、避光和少氧的環(huán)境中培育出真正的冬蟲夏草子實(shí)體，其免疫調(diào)節(jié)作用和活性物質(zhì)含量與野生冬蟲夏草子實(shí)體基本無差別。
【專利說明】一種冬蟲夏草子實(shí)體及其培植方法
[0001]本申請要求于2012年09月20日提交中國專利局、申請?zhí)枮?01210356912.3、發(fā)明名稱為“一種冬蟲夏草子實(shí)體及其培植方法”的中國專利申請的優(yōu)先權(quán)，其全部內(nèi)容通過引用結(jié)合在本申請中。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明涉及微生物領(lǐng)域，具體的說是涉及一種冬蟲夏草子實(shí)體及其培植方法。
【背景技術(shù)】
[0003]冬蟲夏草是冬蟲夏草菌(Cordyceps sinensis)感染并寄生在蝙蝠蛾科昆蟲幼蟲上長出的子座(子實(shí)體)及幼蟲蟲體的復(fù)合體，屬于可食用的真菌，是我國一種傳統(tǒng)的名貴滋補(bǔ)中藥材，有調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)功能、抗腫瘤、抗疲勞等多種功效。
[0004]蝙蝠蛾幼蟲被冬蟲夏草菌(Cordyceps sinensis)感染,菌絲充滿整個(gè)蟲體組織，結(jié)成堅(jiān)硬的假菌核，在冬季低溫干燥土壤內(nèi)保持蟲形不變達(dá)數(shù)月之久(冬蟲)，待夏季溫濕適宜時(shí)從菌核長出棒狀子實(shí)體(子座)并露出地面(夏草)，因此得名冬蟲夏草。野生的冬蟲夏草僅生長在青藏高原海拔3000-5000米的高山草甸、高原草甸等高寒植被中，由于近年來過度采挖使其產(chǎn)量下降，其價(jià)格與20多年前相比已經(jīng)上漲了 1000多倍。因此，我國科研人員一直在進(jìn)行利用冬蟲夏草菌的無性型人工發(fā)酵菌絲和培植子實(shí)體來替代野生冬蟲夏草的產(chǎn)業(yè)化研究(即模擬蟲體營養(yǎng)成分做成培養(yǎng)基接種冬蟲夏草菌的無性型-中國被毛孢菌絲，形成有性型-子實(shí)體)，力圖讓昂貴的冬蟲夏草能夠走進(jìn)尋常百姓家。
[0005]在當(dāng)前階段，冬蟲夏草菌絲體是最常見的冬蟲夏草人工培植產(chǎn)品，如冬蟲夏草菌絲體膠囊和冬蟲夏草菌絲體粉。與冬蟲夏草子實(shí)體相比，冬蟲夏草菌絲體的營養(yǎng)遠(yuǎn)不如子實(shí)體。在一株完整的冬蟲夏草中，80%的營養(yǎng)和活性成分集中在子座(子實(shí)體)中，而僅20%的的營養(yǎng)和活性成分集中在蟲體(菌絲體)中，可見冬蟲夏草子實(shí)體才是冬蟲夏草的精華所在，而人工培植冬蟲夏草子實(shí)體更具有實(shí)際意義。
[0006] 在研究人工培植冬蟲夏草子實(shí)體的起始階段，由于對冬蟲夏草菌的正確無性型沒有明確定論，使得人工培植冬蟲夏草子實(shí)體出現(xiàn)了較為混亂的局面，即凡是認(rèn)為分離自蟲草的菌就是冬蟲夏草菌的無性型，而由這些無性型的菌培植的子實(shí)體就稱為冬蟲夏草子實(shí)體，如申請?zhí)枮?0108486.0的中國專利，其公開了一種“人工培育冬蟲夏草的方法”，從其記載的內(nèi)容上看實(shí)際上是人工培育子實(shí)體，但其培養(yǎng)基中用到了培育蛹蟲草子實(shí)體的典型組分-蠶蛹粉等，且其菌絲的顏色為白色，這與蛹蟲草的無性型-蛹草擬青霉的菌絲顏色是一致的，而且蛹蟲草的生長速度快，培養(yǎng)周期短為40-50天，因此可以推知其培育的并不是冬蟲夏草子實(shí)體，而是蛹蟲草子實(shí)體。上述混亂狀況對相關(guān)藥品和保健品的生產(chǎn)、管理和應(yīng)用帶來極大的影響。
[0007]隨著研究的不斷深入，有明確證據(jù)表明，冬蟲夏草菌的正確無性型為中國被毛孢[Hirsutella sinensis X.J.Liu, Y.L.Gu0.],但是,只有極少的報(bào)道記載了利用中國被毛孢在培養(yǎng)基上培植冬蟲夏草子實(shí)體的內(nèi)容，如文獻(xiàn)《人工培養(yǎng)冬蟲夏草研究》(俞永信，菌物研究，2004年第2卷第2期，42-46頁)，不過該文獻(xiàn)在培養(yǎng)基的組成和培養(yǎng)條件上不夠明確，而且子實(shí)體的數(shù)量僅為I根/CFU，長度最長也只有5cm左右，產(chǎn)量較低不利于廣泛應(yīng)用。因此，提供一種利用中國被毛孢培植產(chǎn)量較高的冬蟲夏草子實(shí)體的方法就具有重要的實(shí)際意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種能夠利用中國被毛孢人工培植出冬蟲夏草子實(shí)體的方法，使得該方法能夠提高子實(shí)體的數(shù)量和長度。
[0009]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案:
[0010]一種冬蟲夏草子實(shí)體的培植方法，將中國被毛孢菌接種在固體培養(yǎng)基上，在避光、14-20°C和45-60%相對濕度的條件下進(jìn)行菌落培養(yǎng)至菌落直徑為3-4cm，然后轉(zhuǎn)至避光、10-15%氧氣濃度、0-10°C和70-90%相對濕度的條件下誘導(dǎo)子實(shí)體至子實(shí)體長出，所述固體培養(yǎng)基由葡萄糖、蛋白胨、酵母浸出粉、水解乳蛋白、無水硫酸鎂、磷酸二氫鉀、瓊脂和水組成，質(zhì)量比依次為28~32: 8~12: 4~6: 4~6: 0.4~0.6: 0.8~1.2: 18~22: 800 ~1200。
[0011]本發(fā)明所述培植方法采用的中國被毛孢菌可以通過市售獲得，或利用本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)手段從野生的冬蟲夏草上分離獲得。其中，本發(fā)明所述固體培養(yǎng)基中葡萄糖、蛋白胨、酵母浸出粉、水解乳蛋白、無水硫酸鎂、磷酸二氫鉀、瓊脂和水的質(zhì)量比優(yōu)選為30: 10: 5: 5: 0.5: I: 20: 1000。
[0012]由于野生冬蟲夏草的生長環(huán)境特殊，對人工培植冬蟲夏草子實(shí)體的環(huán)境要求十分嚴(yán)格，光照、溫度、濕度、氧氣濃度等均需要達(dá)到合適條件才可能培植出冬蟲夏草子實(shí)體，而且冬蟲夏草子實(shí)體不能在一般的真菌培養(yǎng)基上生長，其所能適應(yīng)的培養(yǎng)基范圍極為狹窄，以上多種影響因素使得人工培植冬蟲夏草子實(shí)體成為一個(gè)難題，而一般的有限次試驗(yàn)根本無法將上述培植條件調(diào)整到一個(gè)合適的范圍，這些問題使得現(xiàn)有技術(shù)中尚無利用中國被毛孢菌成功培植出冬蟲夏草子實(shí)體的報(bào)道。`
[0013]針對以上難題， 申請人:在對野生冬蟲夏草生長特性深入研究的基礎(chǔ)上，經(jīng)過創(chuàng)造性的勞動(dòng)，提供了一種能夠利用中國被毛孢菌成功培植出冬蟲夏草子實(shí)體的方法，本發(fā)明所述培植方法分為菌落培養(yǎng)和子實(shí)體誘導(dǎo)兩個(gè)階段。
[0014]菌落的生長程度直接關(guān)系著子實(shí)體的長出與否，菌落過大會(huì)消耗掉過多的培養(yǎng)基營養(yǎng)，子實(shí)體營養(yǎng)不足就不會(huì)長出；而菌落過小，則不容易長出子實(shí)體。因此，本發(fā)明培養(yǎng)菌落的時(shí)間為35-55天，優(yōu)選為40-50天，更優(yōu)選為45天。同時(shí)，所述菌落培養(yǎng)的溫度優(yōu)選為17-19°C，更優(yōu)選為18°C，所述菌落培養(yǎng)的相對濕度優(yōu)選為50-60%，更優(yōu)選為55%。
[0015]本發(fā)明模擬冬蟲夏草生長的高原環(huán)境，在誘導(dǎo)子實(shí)體階段，降低氧氣濃度為10-15%,并降溫至10°C以下，提高空氣相對濕度，只有這種環(huán)境才能促使冬蟲夏草子實(shí)體的長出，作為優(yōu)選，本發(fā)明誘導(dǎo)子實(shí)體的氧氣濃度為12%，所述誘導(dǎo)子實(shí)體的溫度為4-6°C，更優(yōu)選為5°C，所述誘導(dǎo)子實(shí)體的相對濕度為75-85%，更優(yōu)選為80%。為了保證所誘導(dǎo)的冬蟲夏草子實(shí)體粗壯、飽滿，本發(fā)明優(yōu)選誘導(dǎo)子實(shí)體的時(shí)間為5-6個(gè)月，此時(shí)獲得子實(shí)體長度在3_8cm0
[0016]利用本發(fā)明所述培植方法多次培育冬蟲夏草子實(shí)體，結(jié)果顯示平均每個(gè)試管斜面培養(yǎng)基上能夠培育出3-8根子實(shí)體，產(chǎn)量為0.4-1.1根/cm2。
[0017]在單菌落培植試驗(yàn)中，按照本發(fā)明所述培植方法進(jìn)行培植，可以獲得2-8根子實(shí)體，長度在4-8cm，與現(xiàn)有的單菌落獲得I根子實(shí)體、子實(shí)體最長長度5cm的結(jié)果相比有很大的提聞。
[0018]此外，本發(fā)明還提供一種由本發(fā)明所述培植方法培育的子實(shí)體。本發(fā)明所培育出的冬蟲夏草子實(shí)體的外形、顏色與野生的冬蟲夏草子實(shí)體完全一致，為淺棕色或棕色，并且還對所培植的冬蟲夏草子實(shí)體進(jìn)行了 ITS特異性PCR擴(kuò)增并測序，測序比對結(jié)果為冬蟲夏草[Cordyceps sinensis (BerK.)Sacc],表明本發(fā)明所述培植方法培育出的子實(shí)體為真正的冬蟲夏草子實(shí)體。
[0019]由以上技術(shù)方案可知，本發(fā)明將中國被毛孢菌接種于特定的培養(yǎng)基中，并控制中國被毛孢在不同生長階段的濕度和溫度等條件，在低溫、避光和少氧的環(huán)境中培育出真正的冬蟲夏草子實(shí)體，其免疫調(diào)節(jié)作用和活性物質(zhì)含量與野生冬蟲夏草子實(shí)體基本無差別。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0020]圖1所示為本發(fā)明所述冬蟲夏草子實(shí)體DNA序列的BLAST對比圖。
【具體實(shí)施方式】
[0021]本發(fā)明實(shí)施例公開了一種冬蟲夏草子實(shí)體及其制備方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動(dòng)對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們 都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的產(chǎn)品及方法已經(jīng)通過較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
【發(fā)明內(nèi)容】
、精神和范圍內(nèi)對本文所述的產(chǎn)品及方法進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。
[0022]為了進(jìn)一步理解本發(fā)明，下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明提供的一種冬蟲夏草子實(shí)體及其制備方法進(jìn)行詳細(xì)說明。
[0023]實(shí)施例1:本發(fā)明所述培植方法培育冬蟲夏草子實(shí)體
[0024]1、培植方法
[0025]稱取葡萄糖3g,蛋白胨Ig,酵母浸出粉0.5g,水解乳蛋白0.5g,無水MgSO4 0.05g,KH2PO4 0.lg，瓊脂2g，水100ml，配制成4支直徑為3cm的試管固體培養(yǎng)基并滅菌備用。同時(shí)分離自野生的冬蟲夏草，經(jīng)過純化，培養(yǎng)得到冬蟲夏草的無性型中國被毛孢。
[0026]把中國被毛孢菌種切成4 X 4mm大小的小塊接在各固體斜面培養(yǎng)基上，然后放入18°C、相對濕度為55%的的環(huán)境下培養(yǎng)45天。
[0027]將菌落轉(zhuǎn)至無光照、氧氣濃度為12%的誘導(dǎo)容器中，其相對濕度控制在80%，溫度控制在5°C，培養(yǎng)6個(gè)月4支試管共獲得28根子實(shí)體，子實(shí)體長度在4~8cm，為簇生或單生，淺棕色或棕色，產(chǎn)量約為I根/cm2 (單支試管培養(yǎng)基面積為7.06cm2)。
[0028]2、單菌落培植試驗(yàn)
[0029]挑取I中的中國被毛孢菌落，把切成4X4mm大小的菌塊接在固體斜面培養(yǎng)基上，按I中方法進(jìn)行培植，單個(gè)菌落可獲得8根子實(shí)體，子實(shí)體長度在4~8cm，這與文獻(xiàn)《人工培養(yǎng)冬蟲夏草研究》公布的數(shù)據(jù)相比(詳見【背景技術(shù)】最后一段)有很大的提高，表明本發(fā)明所述培植方法能夠提高冬蟲夏草子實(shí)體的數(shù)量和長度。[0030]實(shí)施例2:本發(fā)明所述冬蟲夏草子實(shí)體的ITS序列分析
[0031]真菌18S、5.8S和28S rDNA基因組成一個(gè)轉(zhuǎn)錄單元，三者高度保守，其間的間隔區(qū)為內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(Internal Transcribed Spacer, ITS),真菌rDNA ITS序列(內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū))在進(jìn)化上具有保守性，對此序列的檢測有助于分析其遺傳關(guān)系。
[0032]提取實(shí)施例1子實(shí)體部位的DNA，進(jìn)行ITS特異性PCR擴(kuò)增，并進(jìn)行測序和在Genbank中進(jìn)行BLAST對比，測序結(jié)果為586個(gè)堿基，序列見SEQ ID NO: LBLAST對比結(jié)果為冬蟲夏草[Cordyceps sinensis (BerK.) Sacc], BLAST 對比圖見圖1。
[0033]實(shí)施例3:本發(fā)明所述培植方法培育冬蟲夏草子實(shí)體
[0034]1、培植方法
[0035]稱取葡萄糖2.67g,蛋白胨1.0Og,酵母浸出粉0.50g,水解乳蛋白0.50g,無水MgSO4 0.05g, KH2PO4 0.10g，瓊脂1.83g，水100ml，配制成4支直徑為3cm的試管固體培養(yǎng)基并滅菌備用。同時(shí)分離自野生的冬蟲夏草，經(jīng)過純化，培養(yǎng)得到冬蟲夏草的無性型中國被毛孢。
[0036]把中國被毛孢菌種切成4X4mm大小的小塊接在固體斜面培養(yǎng)基上，然后放入14°C、相對濕度為45%的的環(huán)境下培養(yǎng)55天。
[0037]將菌落轉(zhuǎn)至無 光照、氧氣濃度為15%的誘導(dǎo)容器中，其相對濕度控制在70%，溫度控制在0°C，培養(yǎng)5個(gè)月4支試管共獲得20根子實(shí)體，子實(shí)體長度在4~8cm，為簇生或單生，淺棕色或棕色，產(chǎn)量約為0.7根/cm2 (單支試管培養(yǎng)基面積為7.06cm2)
[0038]2、單菌落培植試驗(yàn)
[0039]挑取I中的中國被毛孢菌落，把切成4X4mm大小的菌塊接在固體斜面培養(yǎng)基上，按I中方法進(jìn)行培植，單個(gè)菌落可獲得5根子實(shí)體，子實(shí)體長度在4~8cm，這與文獻(xiàn)《人工培養(yǎng)冬蟲夏草研究》公布的數(shù)據(jù)相比(詳見【背景技術(shù)】最后一段)有很大的提高，表明本發(fā)明所述培植方法能夠提高冬蟲夏草子實(shí)體的數(shù)量和長度。
[0040]此外，將本實(shí)施例培育出的冬蟲夏草子實(shí)體按照實(shí)施例2的方法進(jìn)行檢測，其序列的 BLAST 對比結(jié)果為冬蟲夏草[Cordyceps sinensis (BerK.) Sacc]。
[0041]實(shí)施例4:本發(fā)明所述培植方法培育冬蟲夏草子實(shí)體
[0042]1、培植方法
[0043]稱取葡萄糖3.51,蛋白胨1.0Og,酵母浸出粉0.50g,水解乳蛋白0.5g,無水MgSO4
0.05g，KH2PO4 0.10g，瓊脂2.25g，水100ml，配制成4支直徑為3cm的試管固體培養(yǎng)基并滅菌備用。同時(shí)分離自野生的冬蟲夏草，經(jīng)過純化，培養(yǎng)得到冬蟲夏草的無性型中國被毛孢。
[0044]把中國被毛孢菌種切成4 X 4mm大小的小塊接在各固體斜面培養(yǎng)基上，然后放入20°C、相對濕度為60%的的環(huán)境下培養(yǎng)35天。
[0045]將菌落轉(zhuǎn)至無光照、氧氣濃度為10%的誘導(dǎo)容器中，其相對濕度控制在90%，溫度控制在10°C，培養(yǎng)6個(gè)月4支試管共獲得12根子實(shí)體，子實(shí)體長度在3~8cm，為簇生或單生，淺棕色或棕色，產(chǎn)量約為0.4根/cm2 (單支試管培養(yǎng)基面積為7.06cm2)
[0046]2、單菌落培植試驗(yàn)
[0047]挑取I中的中國被毛孢菌落，把切成4X4mm大小的菌塊接在固體斜面培養(yǎng)基上，按I中方法進(jìn)行培植，單個(gè)菌落可獲得2根子實(shí)體，子實(shí)體長度在4~8cm，這與文獻(xiàn)《人工培養(yǎng)冬蟲夏草研究》公布的數(shù)據(jù)相比(詳見【背景技術(shù)】最后一段)有很大的提高，表明本發(fā)明所述培植方法能夠提高冬蟲夏草子實(shí)體的數(shù)量和長度。
[0048]此外，將本實(shí)施例培育出的冬蟲夏草子實(shí)體按照實(shí)施例2的方法進(jìn)行檢測，其序列的 BLAST 對比結(jié)果為冬蟲夏草[Cordyceps sinensis (BerK.) Sacc]。[0049]以上實(shí)施例的說明只是用于幫助理解本發(fā)明的方法及其核心思想。應(yīng)當(dāng)指出，對于本【技術(shù)領(lǐng)域】的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對本發(fā)明進(jìn)行若干改進(jìn)和修飾，這些改進(jìn)和修飾也落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種冬蟲夏草子實(shí)體的培植方法，其特征在于，將中國被毛孢菌接種在固體培養(yǎng)基上，在避光、14-20°c和45-60%相對濕度的條件下進(jìn)行菌落培養(yǎng)35-55天，然后轉(zhuǎn)至避光、10-15%氧氣濃度、0-10°C和70-90%相對濕度的條件下誘導(dǎo)子實(shí)體至子實(shí)體長出，所述固體培養(yǎng)基由葡萄糖、蛋白胨、酵母浸出粉、水解乳蛋白、無水硫酸鎂、磷酸二氫鉀、瓊脂和水組成，質(zhì)量比依次為28~32: 8~12: 4~6: 4~6: 0.4~0.6: 0.8~1.2: 18~22: 800 ~1200。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述培植方法，其特征在于，所述固體培養(yǎng)基中葡萄糖、蛋白胨、酵母浸出粉、水解乳蛋白、無水硫酸鎂、磷酸二氫鉀、瓊脂和水的質(zhì)量比為30: 10: 5: 5: 0.5: 1: 20: 1000。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述培植方法，其特征在于，所述菌落培養(yǎng)的溫度為17-19°C。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述培植方法，其特征在于，所述菌落培養(yǎng)的相對濕度為50-60%。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述培植方法，其特征在于，所述誘導(dǎo)子實(shí)體的溫度為4-6°C。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述培植方法，其特征在于，所述誘導(dǎo)子實(shí)體的相對濕度為75-85%。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述培植方法，其特征在于，所述誘導(dǎo)子實(shí)體的氧氣濃度為10-15%。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述培植方法，其特征在于，所述誘導(dǎo)子實(shí)體的時(shí)間為5-6個(gè)月。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述培植方法，其特征在于，所述菌落培養(yǎng)的時(shí)間為40-50天。
【文檔編號】A01G1/04GK103650910SQ201310432723
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年9月22日 優(yōu)先權(quán)日:2012年9月20日
【發(fā)明者】朱新燕, 梁關(guān)海, 梁蕾, 朱志鋼, 李文佳, 謝俊杰, 蔣均才, 華獻(xiàn)春 申請人:乳源南嶺好山好水冬蟲夏草有限公司, 宜昌山城水都冬蟲夏草有限公司