一種轉(zhuǎn)基因豬篩選標(biāo)記基因敲除的方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，本發(fā)明提供了一種轉(zhuǎn)基因豬篩選標(biāo)記基因敲除的方法，利用豬精子特異誘導(dǎo)啟動子啟動Cre/loxP位點(diǎn)特異重組酶系統(tǒng)，建立的自我剪切元件PCN，正常進(jìn)行打靶篩選陽性克隆，進(jìn)行SCNT獲得founder陽性轉(zhuǎn)基因豬后，通過配種，自我剪切敲除標(biāo)記基因。其中剪切元件PCN中：P代表豬精子特異啟動子，C代表Cre酶基因，N代表打靶時(shí)所需的正篩選標(biāo)記neo基因。由于Cre酶是在精子成熟時(shí)特異啟動，因此后代即可獲得敲除篩選標(biāo)記neo基因的豬，因此方便的獲得篩選標(biāo)記基因敲除的豬。
【專利說明】一種轉(zhuǎn)基因豬篩選標(biāo)記基因敲除的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程，具體地說，涉及一種轉(zhuǎn)基因豬篩選標(biāo)記基因敲除的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 在生物學(xué)發(fā)展的過程中，很多方面都有重要的革命性突破。例如：小鼠基因打靶技 術(shù)、小鼠和人的胚胎干細(xì)胞即ES細(xì)胞的分離成功、人類基因組計(jì)劃和小鼠基因組計(jì)劃的完 成，人類的30000多個基因被認(rèn)為是決定人類命運(yùn)的"天書"，展現(xiàn)于人類面前。因此以小鼠 為模型進(jìn)行功能的基因研究為了解人類的基因功能奠定重要的基礎(chǔ)，但是由于小鼠模型的 局限性，不能滿足目前的研究。然而大動物，特別是豬，由于其生理特征與人類相似、及其生 命周期長等特點(diǎn)，目前被認(rèn)為是理想的動物模型。因此，對豬的轉(zhuǎn)基因及其基因打靶技術(shù)就 顯得尤為重要，除了對基礎(chǔ)研究有重要意義外，對應(yīng)用也有很大作用。隨著我國政府對農(nóng)業(yè) 問題的持續(xù)關(guān)注和大力支持，我國農(nóng)業(yè)發(fā)展取得了長足的進(jìn)步，特別是與動物相關(guān)的畜牧 類產(chǎn)業(yè)的飛速發(fā)展，使人民的生活狀況及飲食結(jié)構(gòu)獲得了極大的改善。但是同時(shí)也提出嚴(yán) 峻挑戰(zhàn)，在我國，主要畜牧類品種則嚴(yán)重依賴于進(jìn)口，在主要的畜牧類品種中，奶牛品種依 賴程度達(dá)100%，豬、雞品種依賴程度接近90%，這意味著作為動物農(nóng)業(yè)整個產(chǎn)業(yè)鏈源頭的畜 牧類品種，嚴(yán)重依賴于國際市場。傳統(tǒng)的遺傳育種方法對豬進(jìn)行抗病性、肉品質(zhì)等性狀的改 良難以在短期內(nèi)實(shí)現(xiàn)根本性突破，因此，我們迫切需要一種更加快捷、精確以及有針對性的 基因打靶育種改良方法。隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的快速發(fā)展，轉(zhuǎn)基因植物和動物都有重大突破：抗 病品種培育、高品質(zhì)品種培育、各種疾病模型的建立、動植物反應(yīng)器等等。然而這些成功研 究的背后也藏有重大的隱患：標(biāo)記基因與目的基因共存。標(biāo)記基因即選擇性標(biāo)記基因是指 在遺傳轉(zhuǎn)化中能夠使轉(zhuǎn)化細(xì)胞(或個體)從眾多的非轉(zhuǎn)化細(xì)胞中篩選出來的標(biāo)記基因。它們 通?？梢允罐D(zhuǎn)基因細(xì)胞產(chǎn)生對某種選擇劑具有抗性的產(chǎn)物，從而使轉(zhuǎn)基因細(xì)胞在添加這種 選擇的培養(yǎng)基上正常生長，而非轉(zhuǎn)基因細(xì)胞由于缺乏抗性則表現(xiàn)出對此選擇劑的敏感。由 于轉(zhuǎn)基因效率低，因此必須利用標(biāo)記基因?qū)﹃栃钥寺∵M(jìn)行篩選和富集。但標(biāo)記基因的存在 不僅對鄰近基因及其目的基因表達(dá)產(chǎn)生影響，同時(shí)還將帶來嚴(yán)重的安全性問題。
[0003] 2009年，本課題組利用體外轉(zhuǎn)錄mRNA瞬時(shí)表達(dá)Cre酶，獲得標(biāo)記基因敲除的轉(zhuǎn)基 因牛。目前為止，還沒有對豬進(jìn)行marker free的相關(guān)研究，由于其重要性，因此標(biāo)記基因 敲除的轉(zhuǎn)基因豬研究顯得尤為重要。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在得問題，本發(fā)明的目的是提供一種轉(zhuǎn)基因豬篩選標(biāo)記基 因敲除的方法。
[0005] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明首先提供了一種轉(zhuǎn)基因豬篩選標(biāo)記基因敲除的方 法，所述方法包括以下步驟：
[0006] 1)構(gòu)建自我剪切元件PCN ;
[0007] 2)構(gòu)建帶有自我剪切元件的打靶載體；
[0008] 3)篩選陽性克隆細(xì)胞；
[0009] 4)體細(xì)胞克隆獲得R)代陽性公豬；
[0010] 5)配種繁殖獲得自動敲除標(biāo)記基因的Fl代個體。
[0011] 進(jìn)一步地，所述自我剪切元件PCN主要包括以下核心元件：P代表豬精子特異啟動 子，這個啟動子在豬精子生成過程中特異表達(dá)；C代表Cre重組酶基因，可以介導(dǎo)同向Ioxp 位點(diǎn)之間任何序列的切割；N代表轉(zhuǎn)基因動物常用的neo篩選標(biāo)記基因。所述自我剪切元 件的最大特點(diǎn)，是在精子階段特異啟動Cre酶進(jìn)行自我剪切，達(dá)到自動敲除標(biāo)記基因的目 的。
[0012] 進(jìn)一步地，所述步驟2)將步驟1)構(gòu)建的自我剪切元件PCN替換于普通的打靶載 體的正篩選基因當(dāng)中，得到帶有自我剪切元件的打靶載體。
[0013] 所述自我剪切元件具有通用性和靈活性，可以用于豬的任何打靶載體當(dāng)中，只要 通過簡單的分子操作即可將常規(guī)的打靶載體改成篩選基因自我剪切的載體。
[0014] 進(jìn)一步地，所述步驟3)將步驟2)得到的帶有自我剪切元件的打靶載體，轉(zhuǎn)染豬胎 兒成纖維細(xì)胞，進(jìn)行正負(fù)篩選獲得打靶成功的陽性克隆細(xì)胞。
[0015] 作為優(yōu)選，所述打祀載體為MSTN-PCN marker free打祀載體。本發(fā)明將以本實(shí)驗(yàn) 室的MSTN (肌肉生成素抑制基因）的打靶載體作為實(shí)施例，用以說明本發(fā)明所述方法。
[0016] 進(jìn)一步地，所述步驟4)將步驟3)篩選得到的陽性克隆細(xì)胞作為核移植供體細(xì)胞， 離體的卵母細(xì)胞為核移植受體細(xì)胞，通過核移植技術(shù)進(jìn)行體細(xì)胞克隆獲得R)代的陽性公 豬。要求陽性公豬，是因?yàn)殛栃怨i才有精子，才能啟動自我剪切元件。
[0017] 進(jìn)一步地，所述步驟5)將步驟4)獲得R)代的陽性公豬進(jìn)行配種繁殖，獲得自動 敲除標(biāo)記基因的Fl代個體。其是利用自我剪切元件特點(diǎn)--精子特異表達(dá)，因此只要通過 簡單的配種即可獲得Fl代標(biāo)記基因敲除的基因打靶豬。
[0018] 本發(fā)明還提供了由前述步驟3)篩選獲得的陽性克隆細(xì)胞，以及所述陽性克隆細(xì)胞 在生產(chǎn)基因敲除克隆豬中的應(yīng)用。
[0019] 本發(fā)明還提供了前述轉(zhuǎn)基因豬篩選標(biāo)記基因敲除的方法在生產(chǎn)基因敲除克隆豬 中的應(yīng)用。
[0020] 本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明提供了簡單、高效的去除轉(zhuǎn)基因豬篩選標(biāo)記基因 方法即marker free。其原理是利用豬精子特異誘導(dǎo)啟動子啟動Cre/loxP位點(diǎn)特異重組 酶系統(tǒng)，建立的自我剪切元件PCN。其中P代表豬精子特異啟動子，C代表Cre酶基因，N代 表打靶時(shí)所需的正篩選標(biāo)記neo基因。正常進(jìn)行打靶篩選陽性克隆，進(jìn)行SCNT獲得founder 陽性轉(zhuǎn)基因豬后，通過配種由于Cre酶是在精子成熟時(shí)特異啟動，自我剪切敲除標(biāo)記基因。 因此后代即可獲得去除篩選標(biāo)記neo基因的豬，因此方便的獲得敲除標(biāo)記基因的豬。本發(fā) 明解決豬標(biāo)記基因敲除的問題，對于大動物轉(zhuǎn)基因未來的應(yīng)用及其基礎(chǔ)研究打下重要的基 礎(chǔ)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0021] 圖1為自我剪切元件PCN ;
[0022] 圖2為含有PCN元件的MSTN打靶載體；
[0023] 圖3為打靶陽性克隆PCR鑒定結(jié)果；
[0024] 圖4為打靶陽性R)代公豬PCR檢測結(jié)果；
[0025] 圖5為Fl代小豬標(biāo)記基因敲除PCR檢測結(jié)果。

【具體實(shí)施方式】
[0026] 以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
[0027] 以下實(shí)施例中載體設(shè)計(jì)由本課題組完成，豬精子特異啟動子由美國猶他大學(xué)進(jìn)行 基因合成，序列測定由北京華大基因完成。Taq酶、T4DNA連接酶、內(nèi)切酶均購自北京NEB公 司，體細(xì)胞克隆所用試劑均購自Sigma公司。酶切、連接、回收、轉(zhuǎn)化、PCR擴(kuò)增等常規(guī)實(shí)驗(yàn) 操作步驟詳見《分子克隆(第三版)》。
[0028] 實(shí)施例1自我剪切元件PCN的構(gòu)建
[0029] 將豬精子特異啟動子構(gòu)建到pUC57克隆載體（由美國猶他大學(xué)提供）中，進(jìn)行基 因合成，命名為PGENEl載體(此步驟由美國猶他大學(xué)進(jìn)行)，用Sall+Agel酶雙切，體系為 50ul :載體2ul、酶各2ul、10xbuffer4加5ul、無菌水31ul，37度酶切2h，跑膠回收得到 931bp的目的片段，測序(核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示);再將pACN載體（由美國猶他大 學(xué)提供）用Sall+Agel酶雙切，體系為50ul :載體2ul、酶各2ul、10xbuffer4加5ul、無菌 水31ul，37度酶切2h，跑膠回收得到5805bp的目的片段；將上述回收的兩個片段連接，體 系IOul :回收小片段6ul、大片段2ul、10xbuffer加 lul、T4連接酶lul，16度過夜連接。轉(zhuǎn) 化、搖菌、小體質(zhì)粒、酶切鑒定陽性的PPCN載體(核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示)，備用。
[0030] 實(shí)施例2MSTN :marker free打祀載體構(gòu)建
[0031] 2、將上述構(gòu)建正確的pPCN載體用Nhel+Notl酶切雙切，體系為50ul :載體2ul、 酶各2ul、10xbuffer4加5ul、無菌水31ul，37度酶切2h，跑膠回收3620bp的目的片段； 同時(shí)實(shí)驗(yàn)室原來的PMSTN打靶載體用Nhel+Notl雙酶切體系為50ul :載體2ul、酶各2ul、 IOxbuffer4加5ul、無菌水31ul，37度酶切2h，跑膠回收目的14580片段獲得骨架片段，體 系IOul :回收小片段6ul、大片段2ul、10xbuffer加 lul、T4連接酶lul，16度過夜連接。轉(zhuǎn) 化、搖菌、小體質(zhì)粒、酶且鑒定陽性的最終marker free的打祀載體pMSTN-PCNl載體(核苷 酸序列如SEQ ID No. 3所示)，用于下步實(shí)驗(yàn)(載體結(jié)構(gòu)詳見圖2)。實(shí)施例3打靶陽性細(xì)胞 克隆的獲得
[0032] 1、長白胎兒成纖維細(xì)胞建立
[0033] 1)取妊娠 30d的長白豬，處死后取輸卵管子宮、包扎出口、2h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。
[0034] 從子宮內(nèi)取出胎兒，用含抗生素的DPBS清洗胎兒，轉(zhuǎn)移到超凈工作臺內(nèi)，用眼科 剪去除胎兒頭部、四肢、內(nèi)臟、用DPBS沖洗。
[0035] 2)在直徑IOOmrn細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi)用眼科剪將剩余部分盡量剪碎。
[0036] 3)加入少許血清，將Iml槍頭尖端用剪刀剪斷，留下直徑約為40mm以上部分，接上 Iml槍，將組織塊轉(zhuǎn)移到3個T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶的底壁，用彎頭吸管將組織塊均勻鋪開。
[0037] 4)將鋪有組織塊的一面向上，各加入5ml細(xì)胞培養(yǎng)液，放入C02培養(yǎng)箱，39°C、 5%C02、100%濕度培養(yǎng)。
[0038] 5)待培養(yǎng)6_8h后，將鋪有組織塊的一面翻轉(zhuǎn)，使細(xì)胞培養(yǎng)液浸沒組織塊。
[0039] 6)培養(yǎng)5天左右觀察組織塊周圍是否有細(xì)胞爬出。
[0040] 7)待細(xì)胞生長至80%匯合時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)或進(jìn)行冷凍保存。
[0041] 2、打靶載體電轉(zhuǎn)化
[0042] 將實(shí)施例1中構(gòu)建好的pMSTN-PCNl打靶載體，電轉(zhuǎn)長白胎兒成纖維細(xì)胞。根據(jù)文 獻(xiàn)資料以及之前的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，我們設(shè)置了從320V-450V電壓梯度以及2個不同的脈沖頻率： 5ms和7ms來檢測其對細(xì)胞轉(zhuǎn)染率和生長形態(tài)的影響。由圖2的照片看來，隨著電壓增大， 細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率越高，呈現(xiàn)出越高比例的表達(dá)綠色熒光的細(xì)胞。而與此同時(shí)電壓越高，對細(xì) 胞的損傷越大，電激后死亡的細(xì)胞越多。綜合各種因素，我們決定采用400V，7ms的參數(shù)對 豬胎兒成纖維細(xì)胞進(jìn)行電激轉(zhuǎn)染。
[0043] 3、打靶陽性克隆PCR鑒定
[0044] 通過正負(fù)篩選，獲得了 17個克隆，然后部分細(xì)胞凍存、部分細(xì)胞細(xì)胞提取基因組 進(jìn)行PCR鑒定（PCR分子鑒定圖如圖3所示)，發(fā)現(xiàn)其中擴(kuò)出2. 6kb片段的為打靶陽性克隆， 其中1、2、3、4、12、13、14號克隆為打靶陽性克隆，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
[0045] 實(shí)施例4MSTN敲除豬核移植胚胎及克隆豬的制備
[0046] 1、豬卵母細(xì)胞體外成熟
[0047] 從屠宰場取卵巢，放入28°C -35°C，含青霉素和硫酸鏈霉素的生理鹽水中，2h內(nèi)運(yùn) 回實(shí)驗(yàn)室用配有18號針頭的20mL注射器抽吸卵巢上3-6mm的卵泡。將抽取液放于50mL 離心管中，37°C水浴靜置15min去上清，加入PVA-TL-HEPES重懸沉淀，再靜置15min，重復(fù) 一次，將重懸液放入直徑60_的塑料培養(yǎng)皿中，在體式顯微鏡下，用口吸管挑選卵丘包裹2 層以上，致密，而且胞質(zhì)均勻的卵丘細(xì)胞-卵母細(xì)胞復(fù)合體（Cumulus-Oocyte-complexes， COCs)，用成熟培養(yǎng)液洗滌3遍轉(zhuǎn)入在培養(yǎng)箱中至少已經(jīng)平衡4h的培養(yǎng)液滴內(nèi)（每100 μ L 液滴放25枚)。每一直徑35mm的塑料培養(yǎng)皿中做4個液滴，用胚胎級礦物油覆蓋。將COCs 先在成熟培養(yǎng)液中培養(yǎng)20±2h，然后轉(zhuǎn)移到無 hCG以及eCG的成熟液中繼續(xù)培養(yǎng)20±2h。
[0048] 2、體細(xì)胞準(zhǔn)備
[0049] 利用血清饑餓法，將實(shí)例3中獲得的打靶陽性細(xì)胞待其生長至80%匯合時(shí)，進(jìn)行血 清饑餓處理，即把培養(yǎng)液中的FBS (Gibco, Life Technologies)濃度從20%降至0. 5%繼續(xù) 培養(yǎng)2-5d，按常規(guī)方法消化，離心洗滌，最后加 ImL顯微操作液重懸細(xì)胞沉淀備用。
[0050] 3、受體卵母細(xì)胞去核及供體細(xì)胞核移植
[0051] 利用盲吸法進(jìn)行成熟卵母細(xì)胞去核，即成熟40-44h豬卵母細(xì)胞，脫卵丘后選擇胞 質(zhì)均勻，卵周隙清晰，胞膜完整的卵母細(xì)胞放入無 Ca2+、Mg2+、HEPES緩沖NCSU-23備用轉(zhuǎn)移 到顯微操作液滴內(nèi)：核移植前Ih做好，直徑60mm細(xì)胞培養(yǎng)皿蓋中央(液滴50-80μ l，2-3mm 寬，8-10mm長，石蠟油覆蓋)，作用15-30min，把供體細(xì)胞以及成熟卵母細(xì)胞同時(shí)轉(zhuǎn)入其中 于39%、5%C02、100%濕度平衡15min，安裝顯微固定管以及去核/注射針，調(diào)節(jié)好操作系統(tǒng) 位置，在裝配有顯微操作儀及恒溫臺的倒置顯微鏡下，40 X用固定管（內(nèi)徑25-35 μ m，外徑 100-120 μ m)吸持卵母細(xì)胞用內(nèi)徑15-25 μ m的去核/注射針撥動卵母細(xì)胞，使第一極體處 于鐘表1點(diǎn)鐘位置200 X下，從鐘表3點(diǎn)處將去核/注射針刺過透明帶，吸出第一極體及其 附近少許細(xì)胞質(zhì)退出去核/注射針，將第一極體以及少許胞質(zhì)吐出挑選直徑15-20 μ m，折 光性強(qiáng)，圓形，光滑的體細(xì)胞，200 X下用去核/注射針吸取一個供體細(xì)胞，從去核進(jìn)針處將 體細(xì)胞注射到透明帶下的卵周隙內(nèi)用注射針點(diǎn)壓透明帶，使供體細(xì)胞與受體卵胞質(zhì)的細(xì)胞 膜彼此緊密接觸每批25-30個卵母細(xì)胞，構(gòu)建完成后，結(jié)束后將供體細(xì)胞-卵胞質(zhì)構(gòu)成的細(xì) 胞對（重構(gòu)卵)轉(zhuǎn)移到NCSU-23+4mg/ml BSA中，39°C、5%C02、100%濕度培養(yǎng)箱中修復(fù)l-2h。
[0052] 4、融合與激活
[0053] 將恢復(fù)好的重構(gòu)卵分批轉(zhuǎn)移到融合液中平衡3min，用融合/激活液洗滌3遍后，每 批5個放入已經(jīng)鋪滿融合液的融合槽內(nèi)，用拉制的且尖端很細(xì)的實(shí)心玻璃針撥動重組卵， 使供體細(xì)胞-受體卵細(xì)胞膜接觸面與電極平行用ECM2001融合儀施加一個30 μ s，2. Okv/ cm的直流電脈沖誘導(dǎo)融合同時(shí)激活，用NCSU-23%+4mg/ml BSA洗滌5遍，立即轉(zhuǎn)入礦物油覆 蓋的胚胎培養(yǎng)液中、39°C、5%C02、100%濕度培養(yǎng)0. 5h?Ih后取出，在體視顯微鏡下判定融 合。
[0054] 5、胚胎培養(yǎng)
[0055] 在開始顯微操作前至少4h預(yù)先做好培養(yǎng)液滴，在超凈臺內(nèi)取35mm細(xì)菌培養(yǎng)皿，做 6-8個30 μ L大的液滴，小心加入2. 5-3ml礦物油覆蓋，做好標(biāo)記后放入CO2培養(yǎng)箱內(nèi)平衡將 上述融合的重構(gòu)胚用胚胎培養(yǎng)液洗滌5遍后轉(zhuǎn)入，每個30 μ L的液滴培養(yǎng)8-10個重構(gòu)胚， 培養(yǎng)48h和168h時(shí)記錄卵裂和囊胚形成結(jié)果。
[0056] 6、胚胎移植
[0057] 用公豬試情或者觀察壓背反應(yīng)，挑選自然發(fā)情母豬，一般在構(gòu)建克隆胚的當(dāng)天將 在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12-30h的1-2細(xì)胞克隆胚取出，裝入2. 5ml細(xì)管內(nèi)。用滅菌的錫箔紙 包裝好，做好標(biāo)記，放到恒溫運(yùn)輸箱中運(yùn)到豬移植地點(diǎn)，用40-60ml (lmg/100kg體重）生理 鹽水溶解1-1. 5mg硫噴妥鈉和地西泮，耳靜脈注射20ml，待受體豬初步麻倒后，將其抬到手 術(shù)架上仰臥(青年后備母豬）或者側(cè)臥(經(jīng)產(chǎn)母豬)保定對后備母豬：在腹部下面第1對和第 2對乳頭之間，腹中線局部15X IOcm2面積內(nèi)清潔刮毛后先碘酒消毒，后酒精棉脫碘(對經(jīng) 產(chǎn)母豬：在腹部肷窩部15 X 10cm2的范圍內(nèi)清潔，刮毛碘酒消毒后酒精脫碘）在準(zhǔn)備動刀切 開腹中線之前，把前面余下的麻醉藥再酌情注射20-30ml，沿腹中線切開一個長約8-lOcm 的口，打開腹腔，探進(jìn)去一只手，取出卵巢后用潤濕的滅菌脫脂紗布蓋上(而對經(jīng)產(chǎn)母豬：沿 側(cè)腹部做一個與腹中線面垂直的長約IOcm的切口）在手術(shù)人員即將取出卵巢，調(diào)整好輸 卵管傘之際，將裝在吸管內(nèi)的胚胎取出放在熱臺上，體視顯微鏡下將胚胎裝入移植管內(nèi)，手 術(shù)人員和胚胎移植人員相互協(xié)調(diào)，將移植管從輸卵管傘部探入輸卵管至少5cm大致到了壺 腹-峽部結(jié)合處，一邊推動注射器，以便外撤移植管移植后體視鏡下觀察胚胎是否仍滯留 在移植管內(nèi)，確認(rèn)沒有后，開始卵巢回位，術(shù)口縫合胚胎移植后第IOd肌肉注射800IU hCG， 13d 注射 500IU PMSG。
[0058] 7、囊胚細(xì)胞計(jì)數(shù)
[0059] 取出重構(gòu)胚囊胚，在含3. 7%多聚甲醛的DPBS中洗滌3遍后再固定IOmin將固定后 的囊胚轉(zhuǎn)移到含IOu g/ml Hoechst33342 (bisbenzimide)的DPBS中避光的暗盒中室溫孵 育IOmin染色結(jié)束后，將囊胚轉(zhuǎn)移到載玻片上，盡量少帶液體，盡快用9 : 1的凡士林/石 蠟油在其四角點(diǎn)四個柱，蓋上蓋玻片，在實(shí)體顯微鏡下小心按壓蓋玻片，使卵受壓后稍微膨 大但不至于破碎為宜，用指甲油封片，Nikon E800顯微鏡，紫外光激發(fā)下觀察、照相、計(jì)數(shù)。
[0060] 實(shí)施例5R)代公豬陽性鑒定
[0061] FO代豬組織基因組DNA的提?。?br> [0062] 將豬場出生的公豬(來源于實(shí)例3中的陽性細(xì)胞克隆）取少量尾巴組織塊，剪碎或 細(xì)胞沉淀放入I. 5ml離心管中，加 700 μ I DNA抽提緩沖液，20 μ 1蛋白酶K (20mg/ml)，混 勻56°C水浴消化18h以上，直至組織塊或細(xì)胞沉淀完全消失，間歇搖動以獲得更好的效果， 加入700 μ I Tris-飽和酚，溫和搖動12min，12000rpm離心12min。將上層液相轉(zhuǎn)移至另一 新的離心管中，重復(fù)上一步驟，將上層液相轉(zhuǎn)移至另一新的離心管中，加入700μ 1酚：仿 (1 : 1)，溫和搖動12min，12000rpm離心12min。將上層液相轉(zhuǎn)移至另一新的離心管中，力口 入700μ 1氯仿，溫和搖動12min，12000rpm離心12min。將上層液相轉(zhuǎn)移至另一新的離心 管中，加2倍體積無水乙醇，顛倒混勻后，12000rpm離心lOmin。棄上清，用70%乙醇洗沉 淀和管壁，傾棄乙醇，浙盡殘液，室溫下敞口放置20?30min，使乙醇完全揮發(fā)，加適量(約 100 μ 1)TE緩沖液，于56°C水浴中溶解DNA，0. 7%瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA濃度，測 量260/280nm波長下檢測基因組DNA的濃度和純度，將其調(diào)整至適當(dāng)濃度，-20°C保存，同時(shí) 進(jìn)行PCR鑒定打靶陽性公豬。進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA，假如擴(kuò)出2. 6kb條帶 的既為陽性。檢測結(jié)果如圖4所示，其中其中3,4,6,8,9,11，12,14,15,16,17,18,19, 20號 代公豬為陽性。用于后面實(shí)驗(yàn)。
[0063] 實(shí)施例6F1代豬陽性鑒定
[0064] 將實(shí)施例5中的R)代陽性公豬與野生型母豬配種然后獲得Fl代小豬，然后提取 基因組和PCR鑒定。如果標(biāo)記基因被敲除，會擴(kuò)出600bp條帶，檢測結(jié)果如圖5所示(檢測 方法同實(shí)施例5)。Fl代個體為標(biāo)記基因敲除，及證明本設(shè)計(jì)可以方便，通用的獲得標(biāo)記基 因敲除的基因打靶豬。
[0065] 雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在 本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進(jìn)，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因 此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
【權(quán)利要求】
1. 一種轉(zhuǎn)基因豬篩選標(biāo)記基因敲除的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟： 1) 構(gòu)建自我剪切元件PCN; 2) 構(gòu)建帶有自我剪切元件的打靶載體； 3) 篩選陽性克隆細(xì)胞； 4) 體細(xì)胞克隆獲得代陽性公豬； 5) 配種繁殖獲得自動敲除標(biāo)記基因的F1代個體。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述自我剪切元件PCN包括豬精子特異啟 動子、Cre重組酶基因和轉(zhuǎn)基因動物常用的neo篩選標(biāo)記基因。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟2)將步驟1)構(gòu)建的自我剪切元 件PCN替換于普通的打靶載體的正篩選基因當(dāng)中，得到帶有自我剪切元件的打靶載體。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟3)將步驟2)得到的帶有自我剪 切元件的打靶載體，轉(zhuǎn)染豬胎兒成纖維細(xì)胞，進(jìn)行正負(fù)篩選獲得打靶成功的陽性克隆細(xì)胞。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述打靶載體為MSTN-PCN marker free打祀載體。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟4)將步驟3)篩選得到的陽性克 隆細(xì)胞作為核移植供體細(xì)胞，離體的卵母細(xì)胞為核移植受體細(xì)胞，通過核移植技術(shù)進(jìn)行體 細(xì)胞克隆獲得代的陽性公豬。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟5)將步驟4)獲得R)代的陽性 公豬進(jìn)行配種繁殖，獲得自動敲除標(biāo)記基因的F1代個體。
8. 由權(quán)利要求1或4所述的步驟3)篩選獲得的陽性克隆細(xì)胞。
9. 權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)所述的方法在生產(chǎn)基因敲除克隆豬中的應(yīng)用。
10. 權(quán)利要求8所述的陽性克隆細(xì)胞在生產(chǎn)基因敲除克隆豬中的應(yīng)用。
【文檔編號】A61D19/00GK104419719SQ201310392856
【公開日】2015年3月18日 申請日期:2013年9月2日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月2日
【發(fā)明者】李寧, 孫照霖, 康倩倩, 吳森, 李秋艷, 溫嘯, 趙蕊 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)