專利名稱：一種降低金線蓮組培污染率的方法及其培養(yǎng)基配方的制作方法
一種降低金線蓮組培污染率的方法及其培養(yǎng)基配方技術領域
本發(fā)明屬于植物組織培養(yǎng)技術領域，具體涉及一種降低金線蓮組培污染率的方法及其培養(yǎng)基配方。
背景技術：
金線蓮(Anoectochilus roxburghii)又名金絲草,為蘭科開唇蘭屬多年生草本植物，是我國傳統(tǒng)名貴中藥，具有清熱涼血、除濕解毒等功效，用于治療糖尿病、腎炎、膀胱炎等癥，在民間享有“藥王”的美稱。浙南、閩臺及兩廣一帶長期用金線蓮煮水、泡茶、煲湯，用于強身健體、滋補調養(yǎng)。現(xiàn)代研究表明金線蓮中含有多糖、黃酮類、強心苷類等多種成分，可增強人體免疫力，提高機體抵抗力、防止疾病的侵襲，增強并改善體質等功效。
金線蓮長期以來依靠采挖收集野生資源，而野生金線蓮繁殖率極低，致使資源蘊藏量迅速下降，部分傳統(tǒng)產區(qū)已無藥可采。金線蓮種苗是其栽培的關鍵環(huán)節(jié)，種苗的優(yōu)劣直接關系到金線蓮的生長發(fā)育、產量和品質。由于金線蓮種子不具胚乳，無發(fā)芽能力，只有在真菌共生下，才能促使其種子萌發(fā)生長，所以生產上主要采用莖段繁育種苗。但是在組培生產過程中由于細菌、真菌等微生物引起的污染問題(污染率一般為20%以上)一直是當前制約金線蓮種苗繁育的主要障礙。污染初期會導致增殖效率的降低，培養(yǎng)材料生長延緩；污染后期會導致組培苗移栽困難和死亡，甚至有的會引起培養(yǎng)材料的遺傳變異。因此尋找一種降低金線蓮組培污染率的方法及其培養(yǎng)基對于提高組培成功率、降低成本、提高經濟效益等都具有重要意義。發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是克服上述背景技術存在的不足，提供一種降低金線蓮組培污染率的方法及其培養(yǎng)基配方的技術方案。
本發(fā)明提供的技術方案是:
一種降低金線蓮組培污染率的培養(yǎng)基配方，其特征在于所述的培養(yǎng)基配方為 1/2MS、香蕉 40 60g/L、活性炭 0.8 1.2g/L、NAA0.8 1.2mg/L、6_BA0.4 0.8mg/L、蔗糖22 30g/L、瓊脂粉5.5 6.5g/L、洋蔥40 60g/L、螃蟹殼粉10 20g/L。
所述的一種降低金線蓮組培污染率的培養(yǎng)基配方，其特征在于所述的培養(yǎng)基配方為 1/2MS、香蕉 50g/L、活性炭 1.0g/L、NAAl.0mg/L、6_BA0.6mg/L、蔗糖 26g/L、瓊脂粉 6.0g/ L、洋蔥50g/L、螃蟹殼粉15g/L。
培養(yǎng)基配方降低金線蓮組培污染率的方法，其特征在于包括以下步驟:
I)接種室消毒:每月內用艾葉和雷公藤對接種室薰蒸一次進行滅菌消毒；每周內用臭氧發(fā)生器對接種室進行一次滅菌消毒；
2)培養(yǎng)室消毒:每 月用艾葉和雷公藤對培養(yǎng)室薰蒸一次進行滅菌消毒；每周用臭氧發(fā)生器對培養(yǎng)室進行一次滅菌消毒；
3)培養(yǎng)基配制:以1/2MS為基礎培養(yǎng)基，按照配方進行配制，混勻后將培養(yǎng)基的PH值調節(jié)至5.8 6.0 ;將配制好的培養(yǎng)基加熱至瓊脂完全溶解，趁熱分裝于干凈的培養(yǎng)瓶中后加蓋；
4)培養(yǎng)基和接種器具滅菌:采用高壓蒸汽法對培養(yǎng)基和接種器具進行滅菌。
5)外植體接種:
當采用自然生長的金線蓮植株作為外植體時，用自來水洗凈金線蓮，轉入70%乙醇漂洗30s,再用0.1%升萊滅菌IOmin,無菌水反復沖洗5 6次,浙干水分,剪成帶I個節(jié)莖段，接種于準備好的培養(yǎng)基上；
當采用金線蓮組培無菌苗作為外植體時，將金線蓮剪成帶I個節(jié)莖段，接種于準備好的培養(yǎng)基上；
6)組培苗培養(yǎng):將接種好的培養(yǎng)瓶移入培養(yǎng)室，培養(yǎng)條件:溫度24±2°C，光照時間12h/d，光照強度1800 20001x，培養(yǎng)時間四個月。
所述的培養(yǎng)室應定期打掃，每天噴灑75%的酒精除塵，陰雨天開空調除濕，以保持干凈和室內空氣干燥；發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)室有污染的培養(yǎng)瓶應立即滅菌處理，以防擴散。接種前，接種室和超凈工作臺開紫外燈照射消毒30min，然后打開超凈工作臺吹風20min，用新潔爾滅擦拭臺面后使用；污染的培養(yǎng)瓶須經過高溫高壓滅菌后方可使用。
所述步驟4)滅菌時要保證滅菌鍋內部清潔，內部的冷氣排盡，裝填的滅菌物不能堆放過滿，保持滅菌鍋溫度在12rC、105kPa、20min ;培養(yǎng)基滅菌后，先放入緩沖間，抽取樣品放在培養(yǎng)室培養(yǎng)2 3d，若培養(yǎng)基表面和內部均無任何細菌痕跡和真菌菌斑，方可使用； 刀、剪、鑷子等金屬用具在接種前用75%酒精棉球擦拭，再在帶有石英砂的消毒器內高溫消毒5 IOmin,冷卻后使用。
本發(fā)明的有益效果是:所提供降低金線蓮組培污染率的方法及其培養(yǎng)基，設計新穎合理；本發(fā)明中培養(yǎng)基含有1/2MS、香蕉、活性炭、NAA、6-BA、蔗糖、瓊脂粉、洋蔥、螃蟹殼粉。洋蔥中含硫化合物可抑制葡萄球菌屬、鏈球菌屬、弧菌、芽孢桿菌等多種微生物的生長。 螃蟹殼粉中含有豐富的甲殼素和殼聚糖，對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、酵母菌、枯草桿菌、 黑曲霉等有明顯的抑制作用；采用艾葉和雷公藤薰蒸進行滅菌消毒，不但滅菌效果好(金線蓮組培污染率降至5%以下)，而且沒有環(huán)境污染，成本也顯著降低。所提供的培養(yǎng)基配方合理，效果明顯；所提供的方法操作簡單，易于掌握，重復性好，適合大規(guī)模的推廣應用。
具體實施方式
所述用艾葉和雷公藤對接種室和培養(yǎng)室薰蒸，是指艾葉經干燥后(含水率通常小于5%)直接點燃，雷公藤干燥后先用95%酒精浸泡24h，熏蒸時以酒精為助燃劑點燃。按3 個點均勻分布，點燃后密閉熏蒸lh。
采用臭 氧發(fā)生器對培養(yǎng)室、接種室進行滅菌消毒的時間，應根據(jù)臭氧發(fā)生器功率、 室內面積大小選擇決定。
培養(yǎng)基和接種器具滅菌采用高壓蒸汽法為常規(guī)方法。
本發(fā)明所述降低金線蓮組培污染率的培養(yǎng)基配方，包括1/2MS、香蕉40 60g/L、 活性炭 0.8 1.2g/L、ΝΑΑ0.8 1.2mg/L、6_BA0.4 0.8mg/L、蔗糖 22 30g/L、瓊脂粉5.5 6.5g/L、洋蔥40 60g/L、螃蟹殼粉10 20g/L。
優(yōu)選:1/2MS、香蕉50g/L、活性炭 1.0g/L、NAA1.0mg/L、6_BA0.6mg/L、鹿糖 26g/L、瓊脂粉6.0g/L、洋蔥50g/L、螃蟹殼粉15g/L。
以下通過實施例來進一步說明本發(fā)明。
實施例1
I)外植體選取:采用自然生長的金線蓮植株作為外植體，用自來水洗凈金線蓮植株，轉入70%乙醇漂洗30s,再用0.1%升萊滅菌IOmin,無菌水反復沖洗5 6次,浙干水分， 剪成帶I個節(jié)莖段，備用。
2)培養(yǎng)基配制:以1/2MS為基礎培養(yǎng)基，同時添加香蕉60g/L、活性炭1.0g/L、 NAA1.0mg/L、6-BA0.6mg/L、鹿糖 26g/L、瓊脂粉 6.0g/L、洋蔥 50g/L、螃蟹殼粉 15g/L 混勻后將培養(yǎng)基的PH值調節(jié)至6.0。將配制好的培養(yǎng)基加熱至瓊脂完全溶解，趁熱分裝于干凈的培養(yǎng)瓶中后加蓋。
3)培養(yǎng)基和接種器具滅菌:采用高壓蒸汽法對培養(yǎng)基和接種器具進行滅菌。保持滅菌鍋溫度在12rC、105kPa、20min。刀、剪、鑷子等金屬用具在接種前用75%酒精棉球擦拭，再在帶有石英砂的消毒器內高溫消毒lOmin，冷卻后使用。
4)接種:定期(一個月)用艾葉和雷公藤對接種室進行薰蒸，定期(一周)用臭氧發(fā)生器對接種室進行滅菌消毒。接種前，接種室和超凈工作臺開紫外燈照射消毒30min，然后打開超凈工作臺吹風20min，用新潔爾滅擦拭臺面后使用。將處理好的莖段平鋪于培養(yǎng)基上。
5)組培苗培養(yǎng):將接種好的培養(yǎng)瓶移入培養(yǎng)室，培養(yǎng)條件:溫度24°C，光照時間 12h/d，光照強度18001x，培養(yǎng)時間四個月。培養(yǎng)室每天噴灑75%的酒精除塵，保持干凈和室內空氣干燥，定期(一個月)用艾葉和雷公藤對培養(yǎng)室進行薰蒸，定期(一周)用臭氧發(fā)生器對培養(yǎng)室進行滅菌消毒。
實施結果:培養(yǎng)過程中，金線蓮組培苗污染率為4.8%。培養(yǎng)時間四個月后，組培苗平均株高6.8cm，平均發(fā)根數(shù)2.5條，平均葉凈增3.5張。
實施例2
I)外植體選取:采用金線蓮組培無菌苗作為外植體，將金線蓮去葉，莖剪成帶I個節(jié)莖段，備用。
2)培養(yǎng)基配制:以1/2MS為基礎培養(yǎng)基，同時添加香蕉50g/L、活性炭0.8g/L、 NAA1.2mg/L、6-BA0.4mg/L、蔗糖 22g/L、瓊脂粉 5.5g/L、洋蔥 60g/L、螃蟹殼粉 20g/L 混勻后將培養(yǎng)基的PH值調節(jié)至5.8。將配制好的培養(yǎng)基加熱至瓊脂完全溶解，趁熱分裝于干凈的培養(yǎng)瓶中后加蓋。
3)培養(yǎng)基和接種器具滅菌:采用高壓蒸汽法對培養(yǎng)基和接種器具進行滅菌。保持滅菌鍋溫度在12rC、105kPa、20min。刀、剪、鑷子等金屬用具在接種前用75%酒精棉球擦拭，再在帶有石英砂的消毒器內高溫消毒8min，冷卻后使用。
4)接種:定期(一個月)用艾葉和雷公藤對接種室進行薰蒸，定期(一周)用臭氧發(fā)生器對接種室進行滅菌消毒。接種前，接種室和超凈工作臺開紫外燈照射消毒30min，然后打開超凈工作臺吹風20min，用新潔爾滅擦拭臺面后使用。將處理好的莖段平鋪于培養(yǎng)基上。
5)組培苗培養(yǎng):將接種好的培養(yǎng)瓶 移入培養(yǎng)室，培養(yǎng)條件:溫度24°C，光照時間 12h/d，光照強度20001x，培養(yǎng)時間四個月。培養(yǎng)室每天噴灑75%的酒精除塵，保持干凈和室內空氣干燥，定期(一個月)用艾葉和雷公藤對培養(yǎng)室進行薰蒸，定期(一周)用臭氧發(fā)生器對培養(yǎng)室進行滅菌消毒。
實施結果:培養(yǎng)過程中，金線蓮組培苗污染率為3.2%。培養(yǎng)時間四個月后，組培苗平均株高6.3cm，平均發(fā)根數(shù)2.6條，平均葉凈增3.4張。
實施例3
I)外植體選取:采用金線蓮組培無菌苗作為外植體，剪取金線蓮帶I個節(jié)的頂芽， 備用。
2)培養(yǎng)基配制:以1/2MS為基礎培養(yǎng)基，同時添加香蕉50g/L、活性炭1.2g/L、 NAA0.8mg/L、6-BA0.8mg/L、鹿糖 30g/L、瓊脂粉 6.5g/L、洋蔥 60g/L、螃蟹殼粉 20g/L 混勻后將培養(yǎng)基的PH值調節(jié)至5.8。將配制好的培養(yǎng)基加熱至瓊脂完全溶解，趁熱分裝于干凈的培養(yǎng)瓶中后加蓋。
3)培養(yǎng)基和接種器具滅菌:采用高壓蒸汽法對培養(yǎng)基和接種器具進行滅菌。保持滅菌鍋溫度在12rC、105kPa、20min。刀、剪、鑷子等金屬用具在接種前用75%酒精棉球擦拭，再在帶有石英砂的消毒器內高溫消毒8min，冷卻后使用。
4)接種:定期(一個月)用艾葉和雷公藤對接種室進行薰蒸，定期(一周)用臭氧發(fā)生器對接種室進行滅菌消毒。接種前，接種室和超凈工作臺開紫外燈照射消毒30min，然后打開超凈工作臺吹風20min,用新潔爾滅擦拭臺面后使用。將處理好的金線蓮帶I個節(jié)的頂芽插入培養(yǎng)基中。
5)組培苗培養(yǎng):將接種好的培養(yǎng)瓶移入培養(yǎng)室，培養(yǎng)條件:溫度24°C，光照時間 12h/d，光照強度20001x，培養(yǎng)時間3個半月。培養(yǎng)室每天噴灑75%的酒精除塵，保持干凈和室內空氣干燥，定期(一個月)用艾葉和雷公藤對培養(yǎng)室進行薰蒸，定期(一周)用臭氧發(fā)生器對培養(yǎng)室進行滅菌消毒。
實施結果:培養(yǎng)過程中，金線蓮組培苗污染率為3.4%。培養(yǎng)時間3個半月后，組培苗平均株高6.6cm，平均發(fā)根數(shù)2.3條，平均葉凈增 3.1張。
權利要求
1.一種降低金線蓮組培污染率的培養(yǎng)基配方，其特征在于所述的培養(yǎng)基配方為 1/2MS、香蕉 40 60g/L、活性炭 O. 8 I. 2g/L、NAA0. 8 I. 2mg/L、6_BA0. 4 O. 8mg/L、蔗糖22 30g/L、瓊脂粉5. 5 6. 5g/L、洋蔥40 60g/L、螃蟹殼粉10 20g/L。
2.如權利要求I所述的一種降低金線蓮組培污染率的培養(yǎng)基配方，其特征在于所述的培養(yǎng)基配方為 1/2MS、香蕉 50g/L、活性炭 I. 0g/L、NAAl. 0mg/L、6_BA0. 6mg/L、鹿糖 26g/L、瓊脂粉6. Og/L、洋蔥50g/L、螃蟹殼粉15g/L。
3.一種利用權利要求I或2所述的培養(yǎng)基配方降低金線蓮組培污染率的方法，其特征在于包括以下步驟1)接種室消毒每月用艾葉和雷公藤對接種室薰蒸一次進行滅菌消毒；每周用臭氧發(fā)生器對接種室進行一次滅菌消毒；2)培養(yǎng)室消毒每月用艾葉和雷公藤對培養(yǎng)室薰蒸一次進行滅菌消毒；每月用臭氧發(fā)生器對培養(yǎng)室進行一次滅菌消毒；3)培養(yǎng)基配制以1/2MS為基礎培養(yǎng)基，按照配方進行配制，混勻后將培養(yǎng)基的PH值調節(jié)至5. 8 6. O ;將配制好的培養(yǎng)基加熱至瓊脂完全溶解,趁熱分裝于干凈的培養(yǎng)瓶中后加蓋；4)培養(yǎng)基和接種器具滅菌采用高壓蒸汽法對培養(yǎng)基和接種器具進行滅菌。5)外植體接種當采用自然生長的金線蓮植株作為外植體時，用自來水洗凈金線蓮，轉入70%乙醇漂洗30s,再用O. 1%升萊滅菌IOmin,無菌水反復沖洗5 6次,浙干水分,剪成帶I個節(jié)莖段, 接種于準備好的培養(yǎng)基上；當采用金線蓮組培無菌苗作為外植體時，將金線蓮剪成帶I個節(jié)莖段，接種于準備好的培養(yǎng)基上；6)組培苗培養(yǎng)將接種好的培養(yǎng)瓶移入培養(yǎng)室，培養(yǎng)條件溫度24±2°C，光照時間 12h/d，光照強度1800 20001x，培養(yǎng)時間四個月。
4.根據(jù)權利要求3所述的一種降低金線蓮組培污染率的方法，其特征在于接種前，接種室和超凈工作臺開紫外燈照射消毒30min，然后打開超凈工作臺吹風20min，用新潔爾滅擦拭臺面后使用；污染的培養(yǎng)瓶須經過高溫高壓滅菌后方可使用。
5.根據(jù)權利要求4所述的一種降低金線蓮組培污染率的方法，其特征在于所述的培養(yǎng)室應定期打掃，每天噴灑75%的酒精除塵，陰雨天開空調除濕，以保持干凈和室內空氣干燥；發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)室有污染的培養(yǎng)瓶應立即滅菌處理，以防擴散。
6.根據(jù)權利要求5所述的一種降低金線蓮組培污染率的方法，其特征在于所述步驟 4)滅菌時要保證滅菌鍋內部清潔，內部的冷氣排盡，裝填的滅菌物不能堆放過滿，保持滅菌鍋溫度在12rC、105kPa、20min ;培養(yǎng)基滅菌后，先放入緩沖間，抽取樣品放在培養(yǎng)室培養(yǎng) 2 3d，若培養(yǎng)基表面和內部均無任何細菌痕跡和真菌菌斑，方可使用；刀、剪、鑷子等金屬用具在接種前用75%酒精棉球擦拭，再在帶有石英砂的消毒器內高溫消毒5 lOmin，冷卻后使用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種降低金線蓮組培污染率的方法及其培養(yǎng)基配方。技術方案是一種降低金線蓮組培污染率的培養(yǎng)基配方，其特征在于所述的培養(yǎng)基配方為1/2MS、香蕉40～60g/L、活性炭0.8～1.2g/L、NAA0.8～1.2mg/L、6-BA0.4～0.8mg/L、蔗糖22～30g/L、瓊脂粉5.5～6.5g/L、洋蔥40～60g/L、螃蟹殼粉10～20g/L。培養(yǎng)基配方降低金線蓮組培污染率的方法，其特征在于包括以下步驟1)接種室消毒；2)培養(yǎng)室消毒3)培養(yǎng)基配制；4)培養(yǎng)基和接種器具滅菌；5)外植體接種；6)組培苗培養(yǎng)。
文檔編號A01H4/00GK103250644SQ20131018474
公開日2013年8月21日 申請日期2013年5月16日 優(yōu)先權日2013年5月16日
發(fā)明者邵清松, 胡潤淮, 王瑩, 季宗富, 易浩君 申請人:浙江農林大學, 杭州韻和生物科技有限公司, 杭州語萊農業(yè)科技有限公司