專利名稱：蛇足石杉賴氨酸脫羧酶基因ldc及其編碼的蛋白與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，主要涉及通過合成蛇足石杉cDNA、PCR和重組表達(dá)技術(shù)獲得賴氨酸脫羧酶基因及其編碼產(chǎn)物，屬于藥用植物基因工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
藥用植物有效成分(次生代謝產(chǎn)物)的形成是植物次生代謝途徑中特有基因群的產(chǎn)物。隨著植物功能基因組研究的廣泛與深入，獨(dú)具特色又有廣闊應(yīng)用前景的藥用植物次生代謝合成相關(guān)功能基因的研究逐漸成為研究的熱點(diǎn)，這些基因的克隆將為解析藥用植物有效成分的生物合成途徑及其調(diào)控機(jī)制和解釋藥材品質(zhì)的形成提供理論基礎(chǔ)，同時(shí)為利用生物技術(shù)提高目標(biāo)成分含量或直接生產(chǎn)有效成分或中間體帶來廣闊的應(yīng)用空間。蛇足石杉[Huperzia serrata(Thumb.)Trev.]是石松類石松科石松屬植物,作為傳統(tǒng)中草藥在我國民間已有上千年的用藥歷史，其所含石杉堿甲次生代謝物是一類高效、低毒、可逆且具有選擇性的乙酰膽堿酯酶(AchE)抑制劑，治療重癥肌無力和早老年性癡呆療癥效顯著，是新一代炙手可熱的治療老年癡呆的藥物。目前所知在蛇足石杉石松類生物堿生物合成途徑中，賴氨酸脫羧酶(lysine decarboxylase,LDC)是蛇足石杉石杉堿甲合成途徑的第一個(gè)酶，是植物次生代謝途徑的關(guān)鍵酶之一，對蛇足石杉具有非常重要的生理意義。因此賴氨酸脫羧酶基因的獲得，為用基因工程手段提高蛇足石杉有效部位的含量提供重要基礎(chǔ)。在本次發(fā)明被公布之前，尚未有任何公開或報(bào)道過本專利申請中所提及的蛇足石杉賴氨酸脫羧酶基因及其氨基酸序列。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種蛇足石杉賴氨酸脫羧酶基因(LDC)。本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供該基因編碼的蛋白質(zhì)。本發(fā)明還提供了含有該基因的重組載體和宿主細(xì)胞。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供該基因的應(yīng)用。本發(fā)明所提供的蛇足石杉賴氨酸脫羧酶(LDC)，為以下核苷酸序列之一:(I) SEQ ID N0.1 和 SEQ ID N0.3 的 DNA 序列；(2)在嚴(yán)格條件下與SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.3的DNA序列雜交且編碼具有蛇足石杉賴氨酸脫羧酶活性的蛋白質(zhì)分子的DNA分子；(3)編碼SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.4所示氨基酸序列的核苷酸序列；(4)編碼對SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.4經(jīng)添加、取代、插入或缺失一個(gè)或多個(gè)氨基酸且具有蛇足石杉賴氨酸脫羧酶活性的蛋白質(zhì)的核苷酸序列。本發(fā)明所提供的蛇足石杉賴氨酸脫羧酶(LDC)，其特征在于，是以下氨基酸序列之具有SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.4所示的氨基酸序列；SEQ ID N0.2和 SEQ ID N0.4經(jīng)添加、取代、插入或缺失一個(gè)或多個(gè)氨基酸且具有蛇足石杉賴氨酸脫羧酶活性的序列；含有本發(fā)明的蛇足石杉賴氨酸脫羧酶基因全序列或部分序列的重組載體，如原核類載體，真核類表達(dá)載體及RNAi載體均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍；含有本發(fā)明的蛇足石杉賴氨酸脫羧酶基因全序列或部分序列的宿主細(xì)胞，如含有上述的重組載體的宿主細(xì)胞也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍；所述宿主細(xì)胞為有價(jià)值的活性材料。本發(fā)明的蛇足石杉賴氨酸脫羧酶基因的應(yīng)用，包括用所述的重組載體，如植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞；或者用所述含有該基因的農(nóng)桿菌與植物細(xì)胞共培養(yǎng)，得到轉(zhuǎn)基因的植物發(fā)根系；或者用所述的發(fā)根細(xì)胞再生植株；或者用所述的蛇足石杉賴氨酸脫羧酶基因全序列或部分序列轉(zhuǎn)化獲得轉(zhuǎn)基因生物體。本發(fā)明技術(shù)方案中涉及的概念具體內(nèi)容如下:所說的蛇足石杉賴氨酸脫羧酶基因的DNA分子包括:編碼具有賴氨酸脫羧酶活性的多肽的核苷酸序列，而且所述的核苷酸序列與SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.3中的核苷酸序列有至少70%的同源性；或者所述的核苷酸序列能在40-55°C條件下與SEQ IDN0.1和SEQID N0.3中從核苷酸序列雜交。較佳地，所述的序列編碼具有SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.4所示的氨基酸序列的多肽。更佳地，所述的序列具有SEQ ID N0.1中從核苷酸第1-639位和SEQ ID N0.3中從核苷酸第1-609位的核苷酸序列。本發(fā)明分離出的蛇足石杉賴氨酸脫羧酶基因多肽包括:具有SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.4氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。較佳地，該多肽是具有SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.4序列的多肽。 本發(fā)明中術(shù)語“蛇足石杉賴氨酸脫羧酶(或多肽)”基因(LDC)指:編碼具有蛇足石杉賴氨酸脫羧酶活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID N0.1中第1-639位核苷酸序列及簡并序列，和SEQ ID N0.3中第1-609位核苷酸序列及簡并序列。該簡并序列是指，位于SEQID N0.1序列編碼框第1-639位和SEQ ID N0.3序列編碼框第1_609位核苷酸中，有一個(gè)或多個(gè)密碼子被編碼相同氨基酸的簡并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列。由于密碼子的簡并性，所以與SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.3中核苷酸序列同源性低至約70%的簡并序列也能編碼出SEQ ID N0.2和和SEQ ID N0.4所述的序列。還包括能在中度嚴(yán)謹(jǐn)條件下，更佳的在高度嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.3中的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。還包括與SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.3中的核苷酸序列的同源性至少70%，較佳地至少80%，更佳地至少90%，最佳地至少95%的核苷酸序列。還包括能編碼具有與天然的蛇足石杉賴氨酸脫羧酶相同功能的蛋白的SEQ IDN0.1和SEQ ID N0.3中開放閱讀框序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于):若干個(gè)(通常為，1-90個(gè)，較佳地，1-60個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地，1-10個(gè))核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加數(shù)個(gè)(通常為60個(gè)以內(nèi)，較佳地為30個(gè)以內(nèi)，更佳地為10個(gè)以內(nèi)，最佳地為5個(gè)以內(nèi))核苷酸。本發(fā)明術(shù)語“蛇足石杉賴氨酸脫羧酶蛋白或多肽(LDC) ”指:具有蛇足石杉賴氨酸脫羧酶活性的SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.4序列的多肽。該術(shù)語還包括具有與天然蛇足石杉賴氨酸脫羧酶相同功能的SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.4序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于):若干個(gè)(通常為1-50個(gè)，較佳地1-30個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè))氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)(通常為20個(gè)以內(nèi)，較佳地為10個(gè)以內(nèi)，更佳地為5個(gè)以內(nèi))氨基酸。例如在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時(shí)，通常不會改變蛋白質(zhì)的功能。有比如，在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸通常也不會改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語還包括蛇足石杉賴氨酸脫羧酶的活性片段和活性衍生物，還包括能夠可操作地連于信號肽、啟動子或者核糖體結(jié)合位點(diǎn)序列所組成的衍生物。本發(fā)明的蛇足石杉賴氨酸脫羧酶多肽的變異形式包括:同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)變異體、在高或低的嚴(yán)謹(jǐn)條件下能與蛇足石杉賴氨酸脫羧酶DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用蛇足石杉賴氨酸脫羧酶多肽的血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明中蛇足石杉賴氨酸脫羧酶保守性變異多肽指:與SEQ ID N0.2和SEQIDN0.4的氨基酸序列相比，有至多10個(gè)，較佳地至多8個(gè)，更佳地至多5個(gè)氨基酸性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替代而形成的多肽。本發(fā)明還包括賴氨酸脫羧酶或多肽的類似物。這些類似物與天然蛇足石杉賴氨酸脫羧酶多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通過各種技術(shù)得到，如通過輻射或暴露于誘導(dǎo)劑而產(chǎn)生隨機(jī)誘變，還可以通過定點(diǎn)誘變法或其他已知分子生物學(xué)的技術(shù)。應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。所述修飾(通常不改變一級結(jié)構(gòu))形式包括:體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙?；螋然?。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進(jìn)一步加工步驟中進(jìn)行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進(jìn)行糖基化修飾的酶(如哺乳動物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。本發(fā)明中，可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體，包括質(zhì)粒，粘粒等。在生產(chǎn)本發(fā)明中的蛇足石杉賴氨酸脫羧酶多肽時(shí)，可以將蛇足石杉賴氨酸脫羧酶基因的核苷酸序列可操作地連 于表達(dá)調(diào)控序列，從而形成蛇足石杉賴氨酸脫羧酶表達(dá)載體。所述“可操作地連于”指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信號肽DNA作為前體表達(dá)并參與多肽的分泌，那么信號肽(分泌前導(dǎo)序列)DNA就是可操作地連于多肽DNA ;如果啟動子控制序列的轉(zhuǎn)錄，那么它是可操作地連于編碼序列。一般，“可操作地連于”意味著相鄰，而對于分泌前導(dǎo)序列則意味著在閱讀框中相鄰。本發(fā)明中宿主細(xì)胞為原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。常用的原核宿主細(xì)胞包括大腸桿菌；常用的真核宿主細(xì)胞包括酵母細(xì)胞、煙草細(xì)胞和其他植物細(xì)胞。本發(fā)明還可用Northern印跡法技術(shù)分析蛇足石杉賴氨酸脫羧酶基因產(chǎn)物的表達(dá)，即分析蛇足石杉賴氨酸脫羧酶的RNA轉(zhuǎn)錄物在細(xì)胞中的存在和數(shù)量。此外，本發(fā)明可用作探針的核酸分子通常具有蛇足石杉賴氨酸脫羧酶基因核苷酸編碼序列的8-100個(gè)連續(xù)核苷酸，較佳地具有15-50個(gè)連續(xù)核苷酸。該探針可用于檢測樣品中是否存在編碼蛇足石杉賴氨酸脫羧酶的核酸分子。本發(fā)明涉及檢測樣品中是否存在蛇足石杉賴氨酸脫羧酶核苷酸序列的方法，它包括用上述的探針與樣品進(jìn)行雜交，然后檢測探針是否發(fā)生了結(jié)合。較佳地，該樣品是PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物，其中PCR擴(kuò)增引物對應(yīng)于蛇足石杉賴氨酸脫羧酶核苷酸編碼序列，并可位于該編碼序列兩側(cè)或中間。引物長度一般為15-50個(gè)核苷酸。此外，根據(jù)本發(fā)明的蛇足石杉賴氨酸脫羧酶核苷酸序列和氨基酸序列，可以在核酸同源性或表達(dá)蛋白質(zhì)的同源性基礎(chǔ)上，篩選蛇足石杉賴氨酸脫羧酶基因或同源蛋白。本發(fā)明的蛇足石杉賴氨酸脫羧酶的基因家族的核苷酸全長序列或其片段通?？梢杂肞CR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列來設(shè)計(jì)引物，并用市售的cDNA庫或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。一旦獲得了有關(guān)序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。此外，還可通過化學(xué)合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。除了用重組法產(chǎn)生之外，本發(fā)明的蛋白片段還可用固相技術(shù)，通過直接合成肽而加以生產(chǎn)。在體外合成蛋白可以用手工或自動進(jìn)行?？梢苑謩e化學(xué)合成本發(fā)明蛋白的各片段，然后用化學(xué)方法加以連接以產(chǎn)生全長的分子。利用本發(fā)明的蛇足石杉賴氨酸脫羧酶，通過各種常規(guī)篩選方法，可篩選出與蛇足石杉賴氨酸脫羧酶發(fā)生相互作用的物質(zhì)，或者受體、抑制劑或拮抗劑等。本發(fā)明提供的蛇足石杉賴氨酸脫羧酶基因是首次從蛇足石杉中克隆制備的，填補(bǔ)了我國藥用植物蛇足石杉賴氨酸脫羧酶基因的空白。賴氨酸脫羧酶是蛇足石杉中石杉堿甲生物合成途徑的第一個(gè)酶，即入口酶，是植物次生代謝途徑的關(guān)鍵酶之一，故通過賴氨酸脫羧酶基因的轉(zhuǎn)基因技術(shù)將會提高石杉堿甲等石松生物堿類物質(zhì)的含量。蛇足石杉賴氨酸脫羧酶基因可通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)用于提高蛇足石杉石杉堿甲含量的研究和產(chǎn)業(yè)化，尤其可用于中藥材蛇足石杉品質(zhì)的改良，對提高蛇足石杉石松類生物堿產(chǎn)量具有較好的促進(jìn)作用，具有很好的應(yīng)用前景。


圖1:蛇足石杉cDNA的PCR擴(kuò)增電泳圖；圖2:大腸桿菌重組表達(dá)載體pET_32a(+)/LDC構(gòu)建圖；圖3:重組賴氨 酸脫羧酶表達(dá)SDS-PAGE圖；M，蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；1、2、3，重組菌[pET-32a(+)/LDCl]破壁后的上清液和沉淀及全菌；4、5、6，重組菌[pET_32a(+)/LDC2]破壁后的上清液和沉淀及全菌；ct，空載體重組菌；圖4:重組賴氨酸脫羧酶的純化SDS-PAGE圖；M，蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；LDC1:純化的重組蛋白LDCl ；LDC2:純化的重組蛋白LDC2 ；圖5:重組賴氨酸脫羧酶活性TCL檢測圖；1，尸胺標(biāo)準(zhǔn)品；2、3，重組蛋白LDCl和LDC2 ;4、5，滅活的重組蛋白LDCl和LDC2 ;6、7，不添加賴氨酸底物；8，空載體重組菌液；9，賴氨酸標(biāo)準(zhǔn)品。Cad，尸胺。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例，對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。實(shí)施例1、蛇足石杉cDNA的合成1、蛇足石杉總RNA的提取與檢測取蛇足石杉(Huperzia serrata)嫩葉2g,在研缽中用液氮快速研磨成粉末，快速轉(zhuǎn)移至 65°C 預(yù)熱的 IOmL 提取緩沖液中[CTAB (W/V) 2 %，Tris-HCl (pH8.0) IOOmmoI/L，EDTA25mmol/L, NaC12.0mol/L，PVP402 %，亞精胺 0.5g/L，巰基乙醇 2% ]，充分振蕩混勻；用等體積氯仿抽提2次，7500g離心15min。上清液加入1/4體積的IOM LiCl,混合后放置 4 °C 沉淀過夜；7500g 離心 20min,沉淀用 500 u L SSTE[SDS0.5 %, NaClImoI/L,Tris-HCl (pH8.0) 10mmol/L, EDTAlmmol/L],在 65°C溶解 5min。用等體積氯仿抽提，13000g離心5min，上清液加入2倍體積無水乙醇，_70°C放置2h，4°C 13000g離心20min，沉淀室溫干燥IOmin后溶于100 u L DEPC處理的水中，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，用Eppendorf核酸定量儀測定A260、A280比值和濃度。置于_80°C冰箱備用。2、反轉(zhuǎn)錄合成cDNA米用mRNA純化試劑盒(PolyATractmRNA isolation system III,Promega公司)分離mRNA后,采用TaKaRa公司提供的PrimeScript反轉(zhuǎn)錄試劑盒,合成蛇足石杉mRNA第一互補(bǔ)鏈DNA。實(shí)施例2、賴氨酸脫羧酶基因的克隆從NCBI中搜索賴氨酸脫羧酶基因相關(guān)的核苷酸序列和EST序列，通過比對分析，利用vector NTI軟件設(shè)計(jì)一對擴(kuò)增引物L(fēng)DC-F (ATGGAAGCGTTCATT GATCCG)和LDC-R(TTATACCAGACGITCAATCTCCC)。以蛇足石杉的cDNA為模板，按照以下體系[IOXEx PCRbuffer5.0uL, dNTP ( 2.5mM) 4.0 y L，引物 LDC-F 和 LDC-R(IOpmol)各 1.0y L, Ex Taq 聚合Bl0.25 u L，cDNA4.0uL,補(bǔ)加ddH20至終體積50.0uL]擴(kuò)增LDC基因；反應(yīng)程序:94°C預(yù)變性 5min ;94°C變性 30s，52°C退火 30s，72。。延伸 lmin,30 個(gè)循環(huán)；72°C終延伸 10min,4°C保存。擴(kuò)增結(jié)果于I %瓊脂糖凝膠電泳檢測(圖1)。利用TaKaRa公司的Agarose Gel DNAFragment Recovery Kit Ver.2.0純化PCR產(chǎn)物,然后克隆至pMD 19-T載體，篩選陽性克隆子提取質(zhì)粒送TaKaRa公司測序，獲得蛇足石杉賴氨酸脫羧酶相關(guān)基因序列。利用VectorNTI軟件分析，發(fā)現(xiàn)兩序列均具有完整開放閱讀框，長度分別為639bp和609bp，分別可編碼212個(gè)和202個(gè)氨基酸，將兩基因分別命名為LDCl和LDC2。實(shí)施例3、賴氨酸脫羧酶基因的原核表達(dá)1、原核表達(dá)載體的構(gòu)建[45]分另Ij以T載體中的LDCl和LDC2為模板，利用引物Pl(CATGCCATGGAAGCGTTCATTGATCCG)和 P2(CCGCTCGAGTTATACCAGACGTTCAATCTC)進(jìn)行 PCR反應(yīng)，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測和純化后，用限制性內(nèi)切酶Nco I和Xho I于37°C酶切2h，采用回收試劑盒(Takara公司，中國)純化酶切產(chǎn)物；同時(shí)利用Nco I和Xho I在37°C酶切pET-32a(+)載體2h，利用試劑盒回收大片段。將回收的兩個(gè)片段混合，在DNA連接酶作用下于16°C反應(yīng)12h，連接產(chǎn)物利用CaCl2法轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)，在氨芐和氯霉素抗性平板上進(jìn)行抗性篩選，并對克隆子進(jìn)行全菌PCR檢測，將陽性克隆子接入LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，提取重組質(zhì)粒，進(jìn)行Nco I和Xho I雙酶切分析，瓊脂糖凝膠電泳鑒定完全酶切后存在兩個(gè)片段，表明表達(dá)載體構(gòu)建成功。分別命名為:pET-32a(+) /LDCl 和 pET_32a (+)/LDC2 (圖 2)。2、賴氨酸脫羧酶基因的表達(dá)將篩選獲得的陽性克隆子接種到含有氨芐青霉素(終濃度100 U g/mL)和氯霉素(終濃度170 u g/mL)的LB液體培養(yǎng)基中，37°C 150r/min培養(yǎng)3_4h后利用分光光度計(jì)檢測菌體密度，0D_約為1.0時(shí)添加IPTG (終濃度260 u g/mL)誘導(dǎo)表達(dá)，繼續(xù)培養(yǎng)4h，取ImL菌液于1.5mL離心管中，離心收集菌體，用ImL的PBS(50mM pH7.0)洗滌和重懸菌體，重懸菌液分2份，其中一份加入2 ii L溶菌酶(lOOmg/mL)，室溫靜置IOmin后在液氮中反復(fù)凍融3次，12000rpm離心IOmin,分別收集上清液和沉淀。分別在上清、沉淀、全菌中加入等體積的2Xloading buffer,沸水浴3min,短暫離心后使用12%的SDS-PAGE電泳檢測分析(圖3)。由圖3可知，與空載體重組菌株[pET-32a(+)]比較，重組菌[pET_32a(+)/LDC1]和重組菌[pET-32a(+)/LDC2]均多出一條蛋白條帶，表明LDCl和LDC2基因均獲得表達(dá)；重組菌經(jīng)過破壁處理分成上清液和沉淀兩部分，其中上清部分目的蛋白表達(dá)量低于沉淀部分，表明LDCl和LDC2可溶性表達(dá)量比較低(見圖3中的泳道I和4)。實(shí)施例4、重組賴氨酸脫羧酶的純化和活性鑒定1、重組賴氨酸脫羧酶的純化大量培養(yǎng) 重組菌株，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，收集菌體，PBS反復(fù)洗滌3次，使用N1-NTASefinoseTM Resin蛋白純化試劑盒(上海生工)中的binding buffer重懸菌體,溶菌酶酶解，冰浴超聲破碎細(xì)胞，12000rpm離心30min收集上清；根據(jù)融合蛋白上的His-Tag采用N1-NTA純化柱純化重組賴氨酸脫羧酶，分管收集純化液，12%的SDS-PAGE電泳檢測純化效果(圖4泳道LDCl和LDC2)。2、重組賴氨酸脫羧酶活性鑒定在磷酸鉀緩沖液(100mM，pH8.0)中配制酶反應(yīng)體系，使各試劑終濃度分別為:磷酸吡哆醛(PALP)0.20mM、賴氨酸10.0mM、重組賴氨酸脫羧酶1.00mg/mL。將反應(yīng)體系置于37°C水浴鍋中至反應(yīng)混合液出現(xiàn)渾濁時(shí)停止反應(yīng)。薄層層析(TLC)檢測:向反應(yīng)液中加入I滴濃鹽酸，然后加入少量氯仿劇烈震蕩混勻，IOOOOrpm離心IOmin棄去不溶物，氮吹儀40°C吹干，干燥后的殘?jiān)肐M的HCl溶解，取溶解液利用丹磺酰氯進(jìn)行衍生反應(yīng)；同時(shí)對賴氨酸和尸胺標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行丹磺酰氯衍生。經(jīng)過衍生后萃取濃縮衍生物進(jìn)行TLC檢測，采用全自動點(diǎn)樣儀(CAMAG ATS4)點(diǎn)樣、全自動展開儀(CAMAGADC2)展開(展開劑為氯仿、乙醚、三乙胺，配比為8: I: 2)，然后使用TLCVisualizer (CAMAG)進(jìn)行檢測成像。由圖可知，重組蛋白LDCl和LDC2均能催化賴氨酸脫羧基生成尸胺(圖5中泳道2和3);水煮滅活的重組蛋白(圖5中泳道4和5)和不加底物賴氨酸的反應(yīng)體系(圖5中泳道6和7)以及空載體重組菌液反應(yīng)體系(圖5中泳道8)中均不產(chǎn)生尸胺。結(jié)果表明重組蛋白LDCl和LDC2均具有賴氨酸脫羧酶活性，更證明我們從蛇足石杉中克隆的兩個(gè)基因LDCl和LDC2是賴氨酸脫羧酶基因。應(yīng)當(dāng)理解的是，對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說，可以根據(jù)上述說明加以改進(jìn)或變換，而所有這些改進(jìn)和變換都應(yīng)屬于本發(fā)明所附權(quán)利要求的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種蛇足石杉賴氨酸脫羧酶基因LDC，其特征在于，它是下列核苷酸序列之一:(1)SEQ ID N0.1 和 SEQ ID N0.3 的 DNA 序列； (2)在嚴(yán)格條件下與SEQID N0.1和SEQ ID N0.3的DNA序列雜交且編碼具有 蛇足石杉賴氨酸脫羧酶活性的蛋白質(zhì)分子的DNA分子； (3)編碼SEQID N0.2和SEQ ID N0.4所示氨基酸序列的核苷酸序列； (4)編碼對SEQID N0.2和SEQ ID N0.4經(jīng)添加、取代、插入或缺失一個(gè)或多個(gè)氨基酸且具有蛇足石杉賴氨酸脫羧酶活性的蛋白質(zhì)的核苷酸序列。
2.權(quán)利要求1所述的蛇足石杉賴氨酸脫羧酶基因LDC編碼蛋白，其特征在于，是以下氨基酸序列之一: (1)具有SEQID N0.2和S EQ ID N0.4所示的氨基酸序列； (2)SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.4經(jīng)添加、取代、插入或缺失一個(gè)或多個(gè)氨基酸 且具有蛇足石杉賴氨酸脫羧酶活性的序列。
3.重組載體，其特征在于:含有權(quán)利要求1所述的蛇足石杉賴氨酸脫羧酶基因全部或部分序列。
4.宿主細(xì)胞，其特征在于:含有權(quán)利要求1所述的蛇足石杉賴氨酸脫羧酶基因全部或部分序列。
5.權(quán)利要求1所述的蛇足石杉賴氨酸脫羧酶基因LDC和權(quán)利要求2所述的氨基酸序列在蛇足石杉育種中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種蛇足石杉賴氨酸脫羧酶基因LDC及其編碼的蛋白與應(yīng)用，該基因?yàn)槭状螐纳咦闶嫉腸DNA中獲得，填補(bǔ)了我國傳統(tǒng)中藥材蛇足石杉中分子克隆出賴氨酸脫羧酶基因的空白。本發(fā)明所提供的賴氨酸脫羧酶基因具有SEQ ID NO.1和SEQID NO.3所示的核苷酸序列或者添加、取代、插入或者缺失一個(gè)或多個(gè)核苷酸的同源序列或其等位基因及其衍生的核苷酸序列。所述基因編碼的蛋白質(zhì)具有SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列或者添加、取代、插入或者缺失一個(gè)或多個(gè)氨基酸的同源序列。本發(fā)明提供的賴氨酸脫羧酶基因有可能通過生物技術(shù)提高蛇足石杉中生物堿類活性成分石杉堿甲的含量，或者進(jìn)行品種選育，具有較好的應(yīng)用前景。
文檔編號A01H5/00GK103184227SQ201310051788
公開日2013年7月3日 申請日期2013年2月2日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月2日
發(fā)明者彭清忠, 杜次, 朱越, 李菁 申請人:吉首大學(xué)