專利名稱：石杉堿甲的單克隆抗體制備方法及其酶聯(lián)免疫檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及免疫化學(xué)及分析生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及石杉堿甲的單克隆抗體制備方法及其酶聯(lián)免疫檢測試劑盒。
背景技術(shù)：
石杉堿甲(huperzine A, HupA),是從石杉科石杉屬植物蛇足石杉[Huperzinaserrata(Thumb. )Trev]的酹性部分中提取的一種新型石松類天然生物堿。作為第二代乙酰膽堿酯酶(acetylcholinesterase, AChE)抑制劑,具有高效、高選擇性、可逆性等特點(diǎn)。目前石杉堿甲主要用于阿爾茲海默病(alzheimer’s disease, AD)的治療,可顯著改善記憶功能損傷和行為與心境障礙。國內(nèi)外學(xué)者研究證實(shí)，石杉堿甲對血管性癡呆(vascular dementia, VD)、智力低下、精神分裂癥、重癥肌無力等患者有一定的治療作用。石杉屬植物以石杉堿甲作為藥用成分的定量指標(biāo)，目前最常用的檢測方法有薄層掃描法(TLCS)、紫外分光光度法(UV)、核磁共振波譜法(NMR)、高效液相色譜法(HPLC)及其聯(lián)用技術(shù)等，但存在對實(shí)驗(yàn)室和儀器化程度要求高，將待測成分從樣品中分離提取并去除共存雜質(zhì)干擾的前處理過程十分復(fù)雜，需經(jīng)提取、分離、純化和衍生等復(fù)雜的樣品前處理，并且操作費(fèi)時，分析成分昂貴，不利于推廣使用，難以適應(yīng)批量樣品的快速篩選和檢測。因而尋求一種快速、簡便、靈敏并且經(jīng)濟(jì)實(shí)用的分析方法為當(dāng)前研究的方向。免疫分析法是利用抗原與抗體的特異性結(jié)合反應(yīng)為基礎(chǔ)的分析技術(shù)，以抗體為核心試劑，具有高選擇性、高靈敏度、穩(wěn)定性強(qiáng)及簡單方便經(jīng)濟(jì)等特點(diǎn)。國內(nèi)外已發(fā)明各種快速檢測試劑盒且技術(shù)成熟，可用于微量樣品的檢測。目前國內(nèi)外所采用的基本上都是酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-1 inked immunosorbentassay, ELISA),它有常規(guī)理化分析技術(shù)無可比擬的選擇性和很高的靈敏度，適合復(fù)雜物質(zhì)的分析。國內(nèi)外有報道采用雜交瘤技術(shù)制備中藥中有效成分的單克隆抗體，建立以單克隆抗體為基礎(chǔ)的免疫分析方法，可用于大規(guī)模生產(chǎn)的中藥質(zhì)量控制，中藥活性成分的體內(nèi)藥物分析，以及鑒定中藥原料并檢測其農(nóng)藥殘留情況。該技術(shù)已被應(yīng)用于甘草酸、靈芝多糖、柴胡皂苷、人參皂苷等中藥有效成分，目前基于抗原抗體反應(yīng)的酶聯(lián)免疫分析法逐漸成為藥用植物和中藥質(zhì)量控制的一個重要工具。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種石杉堿甲含量檢測的酶聯(lián)免疫吸附測定方法，利用制備的石杉堿甲人工抗原免疫動物，將免疫小鼠的皮細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，制備抗石杉堿甲的單克隆抗體，采用間接競爭酶聯(lián)免疫檢測試劑盒檢測石杉堿甲的含量，方法簡便易行。本發(fā)明的技術(shù)方案為提供一種石杉堿甲單克隆抗體的制備方法，包括以下步驟步驟I利用戊二醛法合成石杉堿甲人工抗原，所述石杉堿甲人工抗原的結(jié)構(gòu)如結(jié)構(gòu)式I所示
權(quán)利要求
1.一種石杉堿甲單克隆抗體的制備方法，其特征在于，包括以下步驟 步驟I利用戊二醛法合成石杉堿甲人工抗原，所述石杉堿甲人工抗原的結(jié)構(gòu)如結(jié)構(gòu)式I所示
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的石杉堿甲單克隆抗體的制備方法，其特征在于，所述步驟I具體為將半抗原石杉堿甲與戊二醛攪拌反應(yīng)2h ;另取含BSA的0. OlM pH 7. 2磷酸鹽緩沖溶液PBS與上述溶液繼續(xù)攪拌2-3h ;加入硼氫化鈉繼續(xù)攪拌Ih ;然后用蒸餾水或0. OlM pH7.2的PBS透析4-5天；離心得到上清液，即得免疫原；所述的半抗原石杉堿甲與BSA的質(zhì)量比為3 8。
3.如權(quán)利要求I所述的石杉堿甲單克隆抗體的制備方法，其特征在于，所述步驟2具體為 步驟21將步驟I所得石杉堿甲人工抗原即免疫原與弗氏完全佐劑或弗氏不完全佐劑等體積乳化后，皮下、肌肉多點(diǎn)免疫Balb/c小鼠，每兩周加強(qiáng)免疫一次，免疫4-6次，檢測其效價； 步驟22將效價高的小鼠脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞在PEG下融合，獲得陽性雜交瘤細(xì)胞，并采用有限稀釋法進(jìn)行陽性雜交瘤細(xì)胞的亞克隆； 步驟23采用小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)法生產(chǎn)單克隆抗體，將陽性雜交瘤細(xì)胞注入預(yù)先腹腔注射液體石蠟的小鼠腹腔內(nèi)，7-10天，腹腔下圍穿刺回收腹水； 步驟24采用辛酸硫酸銨沉淀法、免疫親和層析法(protein G層析柱)純化抗體，檢測抗體效價和純度。
4.一種石杉堿甲酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其特征在于，包括96孔酶標(biāo)板、石杉堿甲包被抗原、包被緩沖液、封閉液、石杉堿甲標(biāo)準(zhǔn)溶液、抗石杉堿甲單克隆抗體、酶結(jié)合物工作液、顯色劑、洗滌液、終止液； 所述石杉堿甲包被抗原的結(jié)構(gòu)如結(jié)構(gòu)式I所示 所述結(jié)構(gòu)式I中，R為BSA、OVA、KLH、HSA, BSA是牛血清白蛋白，OVA是卵清蛋白，KLH是鑰孔血藍(lán)素，HSA是人血清白蛋白； 所抗石杉堿甲單克隆抗體由權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的石杉堿甲單克隆抗體的制備方法制得。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的石杉堿甲酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其特征在于， 所述包被緩沖液為PH 9. 6的碳酸鹽緩沖液； 所述封閉液為質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為5%的脫脂奶粉； 所述酶結(jié)合物工作液為辣根過氧化物標(biāo)記的羊抗鼠稀釋液； 所述顯色劑包括顯色A液和顯色B液，所述顯色A液為四甲基聯(lián)苯胺，顯色B液為磷酸-檸檬酸緩沖液； 所述洗滌液為0. OlM pH 7. 2-7. 4的磷酸鹽吐溫緩沖液； 所述終止液為2M的硫酸溶液。
全文摘要
本發(fā)明涉及免疫化學(xué)及分析生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及石杉堿甲的單克隆抗體制備方法及其酶聯(lián)免疫檢測試劑盒。本發(fā)明的目的是提供一種石杉堿甲含量的ELISA檢測和分析方法，利用制備的石杉堿甲人工抗原免疫動物，將免疫小鼠的皮細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，制備抗石杉堿甲的單克隆抗體，制備石杉堿甲的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒檢測石杉堿甲的含量。本發(fā)明有益效果本發(fā)明特異性強(qiáng)，樣品前處理簡便，靈敏度高，便于進(jìn)行現(xiàn)場監(jiān)測。所需儀器設(shè)備簡單，檢測成本低、時間短、過程簡化，樣品量少，實(shí)用性強(qiáng)，可以滿足中醫(yī)藥開發(fā)利用及其有關(guān)研究單位批量檢測相關(guān)植物體內(nèi)石杉堿甲含量的需要。
文檔編號C07K16/16GK102977210SQ201210462298
公開日2013年3月20日 申請日期2012年11月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月16日
發(fā)明者余宇燕, 吳水生, 滕海英, 鄒艷輝 申請人:福建中醫(yī)藥大學(xué)