專利名稱：一種鹽水灌溉轉(zhuǎn)基因番茄的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種鹽水灌溉轉(zhuǎn)基因番茄的方法。
背景技術(shù)：
番茄是世界上重要的農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)作物，在全世界廣泛種植，近年來有不斷增長的趨勢。對于番茄的鹽水灌溉已經(jīng)被科學(xué)家廣泛的研究。研究報道，用電導(dǎo)率為1.7，2.3，
3.4and5.0dS nT1 (相當(dāng)于17，24，35和51mM NaCl)的鹽水進(jìn)行灌溉，可以減產(chǎn)0、10、25和50%[Cerda A, Fernandez FG, Caro M.1977.Effect of sodium-chloride in irrigationwater on tomato yield and quality.Agrochimica,21:295-304]。 Cuartero andFernandez-Munoz[Cuartero J and Fernandez-Munoz R.1999.Tomato and salinity.Sci Hortic，78:83-125]研究表明，當(dāng)番茄灌溉大于2.5dS nT1電導(dǎo)率的鹽水時，就會發(fā)生明顯的減產(chǎn)；若電導(dǎo)率增加到3.0dS nT1以上，番茄產(chǎn)量將顯著減少。而且，研究發(fā)現(xiàn)用添加鹽分使得電導(dǎo)率(2，4，6和8dS nT1)不同的營養(yǎng)液并對三個發(fā)育時期的番茄進(jìn)行滴灌，結(jié)果顯示，鹽施加的越晚，番茄耐受鹽脅迫能力越強(qiáng)；在換盆16天后施加4dS nT1的鹽水，最終番茄果實產(chǎn)量并沒有明顯降低[Dalla VF, Barbato R, La RN.et al.2001.Responses to bleaching herbicides by leaf chloroplasts of maize plants grownat different temperatures.J Exp Bot, 52:811-820]。在中國北方進(jìn)行的研究表明，在番爺換盆后30天進(jìn)行鹽水灌溉(1.1 - 4.9dS nT1),對番爺最終果實重量毫無影響[WanSQ, Kang YH, Wang D.et al.2007.Effect of drip irrigation with saline water ontomato(lycopersicon esculentum mill)yield and water use in sem1-humid area.Agr Water Manage, 90:63-74]。盡管如此，至今對番茄鹽敏感的發(fā)育時期，還沒有準(zhǔn)確的界定。同時，幾乎沒有研究對番茄進(jìn)行電導(dǎo)率高于5dS nT1 (相當(dāng)于51mM NaCl)鹽水灌溉的產(chǎn)量評價。在淡水缺乏的地區(qū)，特別是利用海水或者高鹽度地下水的地區(qū)，提高番茄鹽水灌溉的利用率，對番茄 生產(chǎn)具有特殊的意義。對番茄品種“麗春”，進(jìn)行“開花坐果期”、“果實膨大I期”、“果實膨大II期”和“采收期”不同鹽濃度的灌溉，結(jié)果表明，對于34mM NaCl的鹽濃度在全時期內(nèi)澆灌都不會引起番茄減產(chǎn)；對于85mM NaCl鹽濃度在除了開花坐果期澆灌，都不會引起番茄減產(chǎn)；對于171mM NaCl的鹽濃度澆灌，只有在采收期燒灌才不會引起番爺減產(chǎn)[Bao HXGDL, Li YX.2010.Effect of stage-specific salineirrigation on greenhouse tomato production.1rrigation Sci, 28:421-430]。僅在米收期進(jìn)行中高鹽濃度澆灌，才能使番茄保持不減產(chǎn)，這就成為了番茄生產(chǎn)中鹽水灌溉的瓶頸。隨著生物技術(shù)，特別是轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展，通過遺傳轉(zhuǎn)化來提高植株的耐鹽性成為廣泛被接受的方法。研究表明，通過質(zhì)膜或者液泡膜上Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白的轉(zhuǎn)化，能顯著提高番茄的耐鹽性；同時，科學(xué)家也將許多轉(zhuǎn)錄因子導(dǎo)入番茄，提高番茄的耐鹽性；另外，實驗也證明，對番茄轉(zhuǎn)化抗氧化酶基因，也可以顯著提番茄的耐鹽性。成功將BADH基因轉(zhuǎn)化番茄，證明轉(zhuǎn)基因番茄的耐鹽性明顯提高，可以在1%的NaCl鹽濃度下，完成生活周期[Jia GX, Zhu ZQ, Chang FQ.et al.2002.Transformation of tomato with the BADHgene from atriplex improves salt tolerance.Plant Cell Rep，21:141-146]。同時，對BADH后代的分析也表明，在1%和1.5%的鹽水灌溉條件下，轉(zhuǎn)基因番茄耐鹽性顯著高于野生型番煎[Zhou S，Chen X，Zhang X.et al.2008.1mproved salt tolerance in tobaccoplants by co-transformation of a betaine synthesis gene BADH and a vacuolar Na+/H+antiporter gene SeNHXl.Biotechnol Lett,30:369-376]。迄今為止，所有的轉(zhuǎn)基因番茄耐鹽性，都是呈現(xiàn)在某一發(fā)育階段耐鹽性的提高，并沒有將番茄耐鹽性的提高與最終的果實產(chǎn)量進(jìn)行聯(lián)系比較；同時，研究證明轉(zhuǎn)基因番茄耐鹽性高于野生型番茄，但與正常條件相比，番茄產(chǎn)量上還是有顯著的差異，這也反映出轉(zhuǎn)基因番茄在實際應(yīng)用中還具有很大的局限性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種鹽水灌溉轉(zhuǎn)基因番茄的方法。本發(fā)明所提供的鹽水灌溉轉(zhuǎn)基因番茄的方法，是在以下兩種時期中的任一種或兩種用番茄正常生長需水量的鹽水對所述轉(zhuǎn)基因番茄進(jìn)行灌溉，在除所述兩種時期中的任一種或兩種外的生育期用番茄正常生長需水量的淡水對所述轉(zhuǎn)基因番茄進(jìn)行灌溉:(a)第一穗果實膨大期；(b)第二穗果實膨大期；所述第一穗果實膨大期為第一穗果實直徑達(dá)2cm至第二穗果實直徑達(dá)2cm ;所述第二穗果實膨大期為第二穗果實直徑達(dá)2cm至第一個果實采收；所述轉(zhuǎn)基因番茄為向目的番茄中導(dǎo)入耐鹽基因后得到的表達(dá)所述耐鹽基因的番爺;
所述鹽水為200mM的NaCl水溶液。在上述方法中，所述耐鹽基因可為SeNHXl基因或BADH基因。所述SeNHXl基因為離子區(qū)隔化基因，即編碼鹽角草(Salicornia europaea L.)液泡膜上鈉氫逆向轉(zhuǎn)運蛋白(Na+/H+ exchanger I)的基因；所述BADH基因為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)合成酶基因，即編碼榆錢菠菜(Atriplex hortensis)甜菜堿醒脫氫酶(betaine aldehydedehydrogenase)基因。在本發(fā)明中，所述SeNHXl基因編碼的蛋白的氨基酸序列具體如序列表中序列I所 ;所述BADH基因編碼的蛋白的氣基酸序列具體如序列表中序列3所不。進(jìn)一步，所述SeNHXl基因的核昔酸序列具體如序列表中序列2所不；所述BADH基因的核苷酸序列具體如序列表中序列4所示。其中，序列I由560個氨基酸組成；序列2由1683個核苷酸組成，編碼序列表中序列I所示的蛋白質(zhì)；序列3由500個氨基酸組成；序列4由1503個核苷酸組成，編碼序列表中序列3所示的蛋白質(zhì)。在本發(fā)明中，所述目的番茄具體為番茄“百麗春”。所述鹽水灌溉轉(zhuǎn)基因番茄的方法在種植所述轉(zhuǎn)基因番茄中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。實驗證明，外源SeNHXl基因和BADH基因的導(dǎo)入，將轉(zhuǎn)基因番茄對鹽的耐受性從第IV階段，提高到第III階段。即只要在第III階段之后對番茄進(jìn)行200mM NaCl處理，轉(zhuǎn)基因番茄都可以表現(xiàn)出與對照番茄(利用淡水進(jìn)行澆灌)相似的果數(shù)和果實總重。這說明未來提高番茄耐鹽性的工作，應(yīng)該主要集中在提高番茄在花芽分化期和開花座果期對鹽的耐受性上。當(dāng)遺傳轉(zhuǎn)化結(jié)合灌溉措施，發(fā)現(xiàn)在果實膨大一期或二期進(jìn)行200mM NaCl灌溉，轉(zhuǎn)基因番茄與正常生長番茄相比無顯著減產(chǎn)，該結(jié)果在番茄生產(chǎn)中具有重要的使用價值。


圖1為番茄外植體轉(zhuǎn)化后的分化與再生。其中，(a)為經(jīng)過4周分化篩選，成功轉(zhuǎn)化的外植體；(b)為生根完畢的番茄組培苗；(c)為培養(yǎng)生根過程中的番茄組培苗。圖2為TO代轉(zhuǎn)SeNHXl基因番茄的分子檢測結(jié)果。其中，(a)為PCR檢測結(jié)果，泳道m(xù)ark為全式金公司提供的Trans2K plus DNA MARKER，從電泳孔往下依次是:5000bp，3000bp,2000bp, 1000bp,750bp 和 500bp ;泳道 positive 為陽性對照(以 pEASY-Se 作為模板)；(b)為RT-PCR檢測結(jié)果。圖3為Tl代轉(zhuǎn)基因番茄real-time PCR分析SeNHXl基因表達(dá)量。圖中每組數(shù)值為3個重復(fù)平均數(shù)，標(biāo)準(zhǔn)誤差線上不同字母為LSD檢驗在P < 0.05水平上差異顯著。圖4為轉(zhuǎn)基因番茄在不同發(fā)育時期鹽處理后莖粗的變化。S1-200，表示僅在第I階段進(jìn)行200mM的NaCl處理，S2/3/4/5-200也同理。Control表示以淡水灌溉的番茄。圖中每組數(shù)值為6個重復(fù)的平均值。圖5為轉(zhuǎn)基因番茄在不同發(fā)育時期鹽處理后株高的變化。S1-200，表示僅在第I階段進(jìn)行200mM的NaCl處理，S2/3-200也同理。Control表示以淡水灌溉的番茄。圖中每組數(shù)值為6個重復(fù)平均數(shù)。圖6為轉(zhuǎn)基因番茄在不同發(fā)育時期鹽處理后光合速率測定。S1-200，表示僅在第I階段進(jìn)行200mM的NaCl處理，S2/3/4/5-200也同理。Control表示以淡水灌溉的番茄。圖中每組數(shù)值為6個重復(fù)平均數(shù) 。圖7為轉(zhuǎn)基因番茄在不同發(fā)育時期鹽處理后呼吸速率測定。S1-200，表示僅在第I階段進(jìn)行200mM的NaCl處理，S2/3/4/5-200也同理。Control表示以淡水灌溉的番茄。圖中每組數(shù)值為6個重復(fù)平均數(shù)。圖8為轉(zhuǎn)基因番茄在不同發(fā)育階段鹽處理后光系統(tǒng)II活性測定。S1-200，表示僅在第I階段進(jìn)行200mM的NaCl處理，S2/3/4/5-200也同理。Control表示以淡水灌溉的番茄。圖中每組數(shù)值為6個重復(fù)平均數(shù)。圖9為轉(zhuǎn)基因番茄在不同發(fā)育階段200mM NaCl處理后最終產(chǎn)量，果數(shù)和果重的測定結(jié)果。其中，Ca)為不同番茄單株果數(shù)采集圖，標(biāo)尺=5cm，對照表示進(jìn)行淡水灌溉的野生型番茄。(b)為最終產(chǎn)量測定結(jié)果。(C)為最終平均果數(shù)測定結(jié)果。(d)為最終平均果重測定結(jié)果。圖中每組數(shù)值為6個重復(fù)平均數(shù)，虛線以上的值為LSD檢驗在P < 0.05水平上無
顯著差異。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。野生型番爺(Lycopersiconesculentum L.) “百 _ 春”(tomato cultivarBailichun):記載在“Zhou S F，Chen X Y, Xue X N.et al.2007.Physiological andgrowth tomato progenies harboring the betaine alhyde dehydrogenase gene to saltstress.J Integr Plant Biol，(2007) 49:628-637” 一文中，公眾可從中國科學(xué)院植物研究
所獲得。T3代轉(zhuǎn)BADH基因番茄T3-8和Τ3-9株系:為將滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)合成酶基因BADH轉(zhuǎn)入野生型番茄“百麗春”后得到的表達(dá)所述BADH基因(核苷酸序列如序列表中序列4所示，編碼序列表中序列3所示的蛋白)的Τ3代轉(zhuǎn)基因番茄。記載在“Zhou S F, Chen X Y，XueX N.et al.2007.Physiological and growth tomato progenies harboring the betainealhyde dehydrogenase gene to salt stress.J Integr Plant Biol,(2007)49:628-637”一文中，公眾可從中國科學(xué)院植物研究所獲得。T4代轉(zhuǎn)BADH基因番茄B4和B9株系:分別為T3代轉(zhuǎn)BADH基因番茄T3-8和T3-9株系的自交后代。pBI121_Se載體，在pBI121載體的酶切位點Xba I和Sma I之間插入了序列表中序列2 (編碼序列表中序列I所示的蛋白質(zhì))所示的SeNHXl基因編碼序列的重組載體。pBI121_Se 載體記載在 “Zhou S，Chen X, Zhang X.et al.2008.1 mproved salt tolerancein tobacco plants by co-transformation of a betaine synthesis gene BADH and avacuolar Na+/H+ antiporter gene SeNHXl.Biotechnol Lett, 30:369-376” 一文中，公眾可從中國科學(xué)院植物研究所獲得。農(nóng)桿菌LBA44O4:記載在 “Zhou S，Chen X, Zhang X.et al.2008.1mproved salttolerance in tobacco plants by co-transformation of a betaine synthesis geneBADH and a vacuolar Na+/H+ antiporter gene SeNHXl.Biotechnol Lett, 30:369-376”一文中，公眾可從中國科學(xué)院植物研究所獲得。實施例1、轉(zhuǎn)SeNHXl基因番茄的獲得一、轉(zhuǎn)SeNHXl基因番茄的獲得及鑒定1、轉(zhuǎn)SeNHXl基因番茄的獲得( I)重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌將pBI121_Se載體用熱擊的方式轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌LBA4404中。對轉(zhuǎn)化后的重組農(nóng)桿菌用引物I和引物2擴(kuò)增SeNHXl基因。引物1:5’ -ATGTTGTCACAATTGAGCTCTCTAT-3’(序列 2 的第 1- 位)引物2:5’-CTATGTTCTGTCTAGCAAATTGTCG-3’(序列 2 的第 1659-1683 位的反向互補(bǔ)序列)將經(jīng)鑒定表明含有SeNHXl基因(序列表中序列2，目的條帶大小為1683bp)的重組農(nóng)桿菌命名為LBA/pBI121-SeNHXl。同時設(shè)置轉(zhuǎn)入空載體pBI121的對照(空載體對照)，所得重組農(nóng)桿菌命名為LBA/pBI 121。( 2 )重組農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化番茄a(bǔ))取無菌培養(yǎng)7天的番茄“百麗春”的子葉作轉(zhuǎn)化外植體。b)將步驟(I)獲得的重組農(nóng)桿菌LBA/pBI 121-SeNHXl或LBA/pBI121的菌液用MS液體培養(yǎng)基稀釋至OD=0.8，用于轉(zhuǎn)化。c)將番爺外植體置于稀釋過的農(nóng)桿菌菌液中，感染8min。
d)取出外植體，置于無菌干燥Whatman濾紙上，吸干殘留菌液。e)將感染過的外植體置于MStl培養(yǎng)基上，黑暗中共培養(yǎng)48h。f)將材料轉(zhuǎn)移至SM培養(yǎng)基中于25±2°C，每天光照12h。每2周換一次培養(yǎng)基。3 4周后，成功轉(zhuǎn)化的外植體就會出現(xiàn)綠色突起和葉狀體，如圖1中(a)所示，而未轉(zhuǎn)化成功的外植體則無法在含有卡那霉素(Kana)的SM培養(yǎng)基上生長。g)待芽長到:T4cm時，將其切下移入SMStl培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根，如圖1中(C)所示，10天左右可看到幼根長出，如圖1中(b)所示。h)待植株根系較發(fā)達(dá)后，于室溫將容器口敞開煉苗3飛天。之后取出植株，洗凈瓊月旨，移栽于溫室或大田土壤中，獲得TO代轉(zhuǎn)基因番茄苗。以上所涉及的各種培養(yǎng)基的配方具體如表I所示。表I重組農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化番茄過程中所涉及的培養(yǎng)基
權(quán)利要求
1.一種鹽水灌溉轉(zhuǎn)基因番茄的方法，是在以下兩種時期中的任一種或兩種用番茄正常生長需水量的鹽水對所述轉(zhuǎn)基因番茄進(jìn)行灌溉，在除所述兩種時期中的任一種或兩種外的生育期用番茄正常生長需水量的淡水對所述轉(zhuǎn)基因番茄進(jìn)行灌溉: (a)第一穗果實膨大期； (b)第二穗果實膨大期； 所述第一穗果實膨大期為第一穗果實直徑達(dá)2cm至第二穗果實直徑達(dá)2cm ;所述第二穗果實膨大期為第二穗果實直徑達(dá)2cm至第一個果實采收； 所述轉(zhuǎn)基因番茄為向目的番茄中導(dǎo)入耐鹽基因后得到的表達(dá)所述耐鹽基因的番茄； 所述鹽水為200mM的NaCl水溶液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述耐鹽基因為SeNHXl基因，或BADH基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于:所述SeNHXl基因編碼的蛋白的氨基酸序列如序列表中序列I所不；所述BADH基因編碼的蛋白的氣基酸序列如序列表中序列3所/Jn o
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于:所述SeNHXl基因的編碼序列如序列表中序列2所示；所述BADH基因的編碼序列如序列表中序列4所示。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于:所述目的番茄為番茄百麗春。
6.權(quán)利要求1-5中任一所述的方法在種植轉(zhuǎn)基因番爺中的應(yīng)用；所述轉(zhuǎn)基因番爺為向目的番茄中導(dǎo)入耐鹽基因后得到的表達(dá)所述耐鹽基因的番茄。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于:所述耐鹽基因為SeNHXl基因，或BADH基因。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于:所述SeNHXl基因編碼的蛋白的氨基酸序列如序列表中序列I所不；所述BADH基因編碼的蛋白的氣基酸序列如序列表中序列3所/Jn o
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于:所述SeNHXl基因的編碼序列如序列表中序列2所示；所述BADH基因的編碼序列如序列表中序列4所示。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于:所述目的番茄為番茄百麗春。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種鹽水灌溉轉(zhuǎn)基因番茄的方法。該方法是在以下兩種時期中的任一種或兩種用番茄正常生長需水量的鹽水對所述轉(zhuǎn)基因番茄進(jìn)行灌溉，在其他生育期用番茄正常生長需水量的淡水對所述轉(zhuǎn)基因番茄進(jìn)行灌溉(a)第一穗果實膨大期，第一穗果實直徑達(dá)2cm至第二穗果實直徑達(dá)2cm；(b)第二穗果實膨大期，果實直徑達(dá)2cm至第一個果實采收；所述轉(zhuǎn)基因番茄為向目的番茄中導(dǎo)入耐鹽基因后得到的表達(dá)所述耐鹽基因的番茄；所述鹽水為200mM的NaCl水溶液。本發(fā)明將遺傳轉(zhuǎn)化結(jié)合灌溉措施，結(jié)果顯示在果實膨大一期或二期進(jìn)行200mM NaCl灌溉，轉(zhuǎn)基因番茄與正常生長番茄相比無顯著減產(chǎn)，這在番茄生產(chǎn)中具重要使用價值。
文檔編號A01G1/00GK103070004SQ20131005168
公開日2013年5月1日 申請日期2013年2月17日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月17日
發(fā)明者李銀心, 陳顯揚, 賀希格, 臺方 申請人:中國科學(xué)院植物研究所