通過(guò)抑制干擾素-γ和腫瘤壞死因子-α來(lái)改善組織再生的方法和組合物的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了用于通過(guò)抑制如TNF-α和IFN-γ等數(shù)種促炎性細(xì)胞因子的效應(yīng)而改善組織再生的方法、組合物和裝置。本發(fā)明的組合物和裝置通常將包含能夠降低TNF-α和/或IFN-γ的水平的一種或多種抗炎劑。根據(jù)本發(fā)明的改善組織再生的方法將通常具有以下步驟：將本發(fā)明的組合物或裝置應(yīng)用于需要該組合物或裝置的位點(diǎn)。此外，本發(fā)明還公開(kāi)了用于形成本發(fā)明的組合物和裝置的方法，以及包含可有效抑制或降低TNF-α和/或IFN-γ的水平的一種或多種抗炎劑的藥物組合物。
【專(zhuān)利說(shuō)明】通過(guò)抑制干擾素-Y和腫瘤壞死因子-α來(lái)改善組織再生
的方法和組合物
[0001 ] 關(guān)于聯(lián)邦贊助的研發(fā)的聲明
[0002]本發(fā)明是在由國(guó)家衛(wèi)生局(NIH)的國(guó)家牙科與顱面科研究所頒發(fā)的第R01DE017449, R01DE019932和R01DE019413號(hào)經(jīng)費(fèi)的政府支持下進(jìn)行的。
[0003]相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0004]本申請(qǐng)要求提交于2011年4月25日的臨時(shí)申請(qǐng)61/478894號(hào)所公開(kāi)的發(fā)明的權(quán)利,本文通過(guò)援引并入其全部?jī)?nèi)容。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0005]本發(fā)明屬于再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。更具體而言，本發(fā)明屬于采集和分析光學(xué)相干層析圖像以檢測(cè)視神經(jīng)疾病的方法。
【背景技術(shù)】
[0006]再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域?qū)で笮迯?fù)、替換由損傷或疾病所損害的組織和器官或者使其再生。為此，基于細(xì)胞的再生醫(yī)學(xué)被認(rèn)為是可滿足組織再生的許多挑戰(zhàn)的具有前景的方向。在基于細(xì)胞的再生醫(yī)學(xué)中，干細(xì)胞已作為具有前景的細(xì)胞源而出現(xiàn)。迄今，經(jīng)培養(yǎng)物擴(kuò)展的骨原細(xì)胞與組織工程化用支架的聯(lián)合使用已取得了一些成功(26-28)。然而，基于細(xì)胞的組織再生的主要挑戰(zhàn)在于要形成大量的與身體的功能性需求相匹配的高品質(zhì)組織結(jié)構(gòu)體(29，30)。目前的方法 尚未克服該領(lǐng)域的這一難題。
[0007]有鑒于此，仍然亟需改善的用于組織工程化的組合物和方法，尤其是允許形成顯著量的滿足身體的功能性需求的高品質(zhì)組織結(jié)構(gòu)體的方法和組合物。
[0008]另外，還需要進(jìn)一步澄清免疫應(yīng)答在基于細(xì)胞的組織再生中的作用。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0009]圖1:顯示了 T細(xì)胞調(diào)節(jié)了 BMMSC (骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞)介導(dǎo)的體內(nèi)骨形成。(A)評(píng)估基于BMMSC的組織再生的圖表，(B)當(dāng)利用羥基磷灰石/磷酸三鈣(HA/TCP，40mg/每植入物)作為載體將來(lái)自同窩生仔畜的BMMSC(4X106細(xì)胞)經(jīng)皮下植入C57BL6小鼠時(shí)，其在植入后8周時(shí)無(wú)法使骨再生。H&E染色顯示出在BMMSC植入物中的HA/TCP顆粒(HA)周?chē)慕Y(jié)締組織。(C)在相同的植入條件下，在植入后8周，BMMSC在免疫受損的小鼠中形成了顯著量的骨(B)、骨髓(BM)和HA/TCP(HA)周?chē)慕Y(jié)締組織(CT)。(D~F)在BMMSC植入前2天經(jīng)尾靜脈輸注泛T (Pan T) (D)、CD4+(E)和CD4+CD25_(F)細(xì)胞(I X IO6)阻斷了免疫受損的小鼠中BMMSC介導(dǎo)的骨形成。H&E染色顯示出在BMMSC植入物中圍繞HA/TCP顆粒(HA)周?chē)慕Y(jié)締組織(CT)。(G)在BMMSC植入之前2天，經(jīng)尾靜脈輸注⑶4+⑶25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs，IXlO6)未顯示出對(duì)免疫受損的小鼠中的骨(B)和骨髓(Baf)形成的抑制效應(yīng)。(H)圖J半定量分析表明了免疫受損的小鼠(C:對(duì)照)和經(jīng)Treg輸注的免疫受損小鼠(G =Tregs)中的BMMSC植入物中顯著的骨形成。然而，在C57BL6小鼠(B:C57BL6)、經(jīng)泛T細(xì)胞輸注的免疫受損小鼠(D:泛T)、經(jīng)CD4+細(xì)胞輸注的免疫受損小鼠(E:CD4+)和經(jīng)⑶4+CD25_細(xì)胞輸注的免疫受損小鼠(F:CD4+⑶25_)中的BMMSC植入物中不存在骨形成。(I)當(dāng)BMMSC經(jīng)皮下植入C57BL6小鼠時(shí)，在植入后的4天至14天，經(jīng)ELISA分析證實(shí)，BMMSC植入物中的IFN-Y的表達(dá)急劇升高，并且TNF-α的表達(dá)也增加。然而，BMMSC植入物中的IL-4、IL-6和IL-17A水平?jīng)]有顯著改變。(J-M)當(dāng)BMMSC經(jīng)皮下植入免疫受損小鼠時(shí)，IFN- Y、TNF- α、IL_4、IL-6和IL-17A水平?jīng)]有顯著改變(J)。當(dāng)在免疫受損小鼠中輸注泛T細(xì)胞或⑶4+⑶25-細(xì)胞(I X IO6)時(shí)，B麗SC植入物中的IFN- Y和TNF- α的水平升高，而IL-4、IL-6和IL-17A的水平?jīng)]有顯著改變(K、L)。Tregs的輸注似乎對(duì)免疫受損小鼠中的BMMSC植入物中的IFN- Y、TNF- α、IL-4、IL-6和IL-17A水平?jīng)]有影響(M)。(N-T)將IFN- Y ,TNF- α、IL-4、IL-6 和 IL-17A (200ng)與 250 μ L 含 BMMSC (4 X IO6)水凝膠混合，并隨后利用HA/TCP作為載體植入免疫受損小鼠中。如同預(yù)期，BMMSC/HA/TCP陽(yáng)性對(duì)照組顯示出植入后8周時(shí)在HA/TCP(HA)周?chē)@著的骨形成⑶(N)。經(jīng)IL-4和IL-6處理的BMMSC顯示出新的骨形成的減少(O、P)，而IL-17處理對(duì)BMMSC介導(dǎo)的骨形成沒(méi)有抑制作用(Q)。此外，IFN-Y處理導(dǎo)致新的骨形成被完全阻斷(R)，而TNF-α處理導(dǎo)致BMMSC植入物中非常有限的骨形成(S)。圖像J半定量分析顯示出各組中的新的骨形成的量(T)。(U-W)當(dāng)在BMMSC植入前2天起將IFN- Y和TNF- α中和抗體(300pg/小鼠)經(jīng)腹膜內(nèi)(1.P.)注射至C57BL6小鼠三次后，在植入后8周觀察到BMMSC植入物中的新的骨形成(U、V)。新的骨形成的量由圖J分析的半定量分析示出(**P〈0.01, N=5)。
[0010]圖2顯示出調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)改善了 C57BL6小鼠中BMMSC介導(dǎo)的骨形成。(A-C) C57BL6小鼠中的皮下BMMSC植入未能產(chǎn)生任何骨㈧，僅觀察到了 HA/TCP (HA)周?chē)慕Y(jié)締組織(CT)。然而，在BMMSC/HA/TCP植入前2天經(jīng)尾靜脈輸注⑶4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(I X IO6)導(dǎo)致植入后8周在BMMSC植入物中的HA/TCP顆粒(HA)和結(jié)締組織(CT)周?chē)@著的新的骨形成(B) (B)。圖J半定量分析表明了 BMMSC植入物中的骨形成的相對(duì)量(C)。(D)ELISA分析顯示，與未經(jīng)處理的對(duì)照組相比，Treg輸注降低了在植入后7至14天的BMMSC植入物中IFN- Y和TNF- α的水平。在這些組中，IL-4和IL-10的水平?jīng)]有明顯變化。另外，Treg輸注分別降低了植入后I至2天和4至7天的BMMSC植入物中的嗜中性粒細(xì)胞數(shù)量和 IL-6 水平(*Ρ〈0.05，#Ρ〈0.01，Ν=5)。
[0011]圖3顯示了 IFN- Y抑制了 BMMSC的成骨分化。⑷當(dāng)將BMMSC與200ng/ml的IL-4、IL-6、IL-17A和IFN-Y在成骨培養(yǎng)基中共培養(yǎng)14天后，茜素紅染色顯示出，與成骨誘導(dǎo)劑(成骨)、IL-4、IL-6和IL-17A組相比，IFN- Y處理顯著地抑制了礦化結(jié)節(jié)的形成。似乎IL-4處理減少了礦化結(jié)節(jié)的形成。但是IL-6和IL-17A處理對(duì)礦化結(jié)節(jié)的形成不具有抑制作用。⑶當(dāng)使用50ng/ml的IFN- Y處理BMMSC時(shí)，據(jù)茜素紅染色證明，與成骨誘導(dǎo)組相比，沒(méi)有顯著的對(duì)礦化結(jié)節(jié)形成的抑制作用。然而，200ng/ml IFN-Y處理顯示出礦化結(jié)節(jié)形成的顯著減少。(C)蛋白印跡分析顯示,200ng/ml的IFN-Y提高了 Smad6表達(dá)并抑制了成骨基因Runx2、ALP和OCN的表達(dá)水平，這些在50ng/ml IFN- Y處理組中沒(méi)有觀察到。在經(jīng)IFN- Y處理的BMMSC中，Smad7的表達(dá)水平?jīng)]有改變。(D、E)分別據(jù)茜素紅染色和蛋白印跡評(píng)估，IFN- Y處理沒(méi)有阻斷源自Ipr小鼠的Fas+BMMSC?)和通過(guò)siRNA的Fas敲低BMMSC(E)中的成骨也沒(méi)有改變其中的Smad6和Runx2的表達(dá)水平(*P〈0.05，#P〈0.01，N=5)。[0012]圖4顯示出IFN- Y協(xié)同性增強(qiáng)了經(jīng)由Fas凋亡途徑的TNF- α誘導(dǎo)的BMMSC凋亡。(A)將不同濃度的 IL-4、IL-6、IL-17A、TGF-β 1、IFN-Y 和 TNF-a (lng/ml、10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml)與BMMSC—起培養(yǎng)3天。通過(guò)甲苯胺藍(lán)染色評(píng)估BMMSC活力。僅TNF-α誘導(dǎo)了劑量依賴(lài)性的細(xì)胞死亡，而其它細(xì)胞因子未顯示出對(duì)BMMSC死亡的影響。(B)據(jù)甲苯胺藍(lán)染色評(píng)估，TNF-a (50ng/ml~200ng/ml)誘導(dǎo)的BMMSC凋亡被 IFN-Y 處理(50ng/ml)協(xié)同性增強(qiáng)。(C)IFN-y (lng/ml ~200ng/ml)不能誘導(dǎo) BMMSC凋亡。通過(guò)添加TNF-a (50ng/ml),從lng/ml~50ng/ml IFN- Y組觀察到劑量依賴(lài)性的BMMSC死亡。當(dāng)IFN-Y達(dá)到高于100ng/ml時(shí)，培養(yǎng)物中沒(méi)有任何BMMSC存活。⑶代表圖顯示出，經(jīng)7AAD/膜聯(lián)蛋白染色證實(shí)，與TNF-α處理組TNF-a (20ng/ml)相比，IFN-Y (50ng/ml)促進(jìn)了經(jīng) TNF-a (20ng/ml)誘導(dǎo)的 BMMSC 凋亡(三角，TNF- a 20ng/ml/IFN- y 50ng/ml)。(E)當(dāng)BMMSC(4X106)與含TNF_a (50ng/ml)的基質(zhì)膠一同經(jīng)皮下植入免疫受損小鼠時(shí)，顯示出在植入30天后與未經(jīng)處理的對(duì)照組相比存活BMMSC數(shù)目的顯著減少。此外，TNF-a(50ng/ml)和IFN_y (200ng/ml)的組合處理導(dǎo)致在植入后30天時(shí)完全沒(méi)有BMMSC存活。(F)IFN-Y在TNF-α誘導(dǎo)的凋亡中的協(xié)同作用是通過(guò)Fas途徑實(shí)現(xiàn)的。IFN-Y (50ng/ml)處理誘導(dǎo)了野生型BMMSC中的Fas表達(dá)的上調(diào)，同時(shí)沒(méi)有激活半胱天冬酶3和半胱天冬酶8。據(jù)蛋白印跡分析證實(shí),TNF-a (20ng/ml)處理顯示出Fas表達(dá)和半胱天冬酶3活性的略微提高。當(dāng)受到IFN-Y和TNF-α的共同刺激時(shí)，與TNF-α處理組相比，F(xiàn)as、經(jīng)切割的半胱天冬酶8和3的表達(dá)水平顯著提高。引人關(guān)注的是，就經(jīng)切割的半胱天冬酶8和3的表達(dá)而言，源自Fas+lpr小鼠的BMMSC未顯示出對(duì)于IFN-Y和TNF-α處理的響應(yīng)。(G、H)當(dāng)Fas表達(dá)受siRNA部分阻斷時(shí)，蛋白印跡分析顯示出經(jīng)切割的半胱天冬酶8和3的表達(dá)水平在IFN-Y/TNF-α處理組中降低(G)，并且經(jīng)甲苯胺藍(lán)染色評(píng)估的細(xì)胞死亡顯著減少(H) (*Ρ〈0.05，**Ρ〈0.01，Ν=5)。
[0013]圖5顯示了 IFN-Y通過(guò)抑制TNFR2/NF K B途徑和Fas內(nèi)化而協(xié)同性增強(qiáng)了 TNF-α誘導(dǎo)的BMMSC凋亡。(A)免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示，F(xiàn)as和肌動(dòng)蛋白分別位于BMMSC表面上和細(xì)胞質(zhì)中(Oh) ο IFN-y (50ng/ml)和TNF-a (20ng/ml)處理導(dǎo)致BMMSC中的Fas內(nèi)化和聚簇，如指定的時(shí)間點(diǎn)所示(0.5h~4h)。在IFN- Y /TNF- α處理2h~4h時(shí)，觀察到顯著的BMMSC凋亡。(B)當(dāng)將胞吞抑制劑Lnt A用于處理BMMSC3小時(shí)后，如甲苯胺藍(lán)染色和蛋白印跡分析所評(píng)估，IFN-Y/TNF-α誘`導(dǎo)的細(xì)胞死亡以及經(jīng)切割的半胱天冬酶8和3的激活顯著降低。(C)半胱天冬酶8抑制劑能夠降低經(jīng)IFN- Y /TNF- α處理的BMMSC中的經(jīng)切割的半胱天冬酶8和3的水平，這與挽救IFN- Y /TNF- α誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡相關(guān)，如甲苯胺藍(lán)染色所示。半胱天冬酶3抑制劑也能挽救IFN- Y /TNF- α誘導(dǎo)的BMMSC死亡，且部分地抑制經(jīng)切割的半胱天冬酶3而對(duì)經(jīng)切割的半胱天冬酶8沒(méi)有抑制作用。(D)與對(duì)照組(a)相t匕，利用泛半胱天冬酶(pan caspase)抑制劑(b)、半胱天冬酶8抑制劑(C)或半胱天冬酶3抑制劑(d)對(duì)半胱天冬酶活性的阻斷減少了 Fas內(nèi)化的數(shù)量。使用免疫細(xì)胞化學(xué)染色來(lái)鑒定具有Fas內(nèi)化的BMMSC的數(shù)量。(E)蛋白印跡分析顯示，與經(jīng)TNF- α處理的BMMSC相比，IFN- Y /TNF- α處理導(dǎo)致TNFR2、磷酸化NF κ B (pNF κ B) ,FLIP和XIAP的表達(dá)降低。(F)利用 siRNA 對(duì) TNFR2、IKK、FLIP 和 XIAP 的抑制導(dǎo)致對(duì)經(jīng) IFN- y (25ng/ml) /TNF- a (lOng/ml)處理的BMMSC中的經(jīng)切割的半胱天冬酶8和3的上調(diào)。(G)蛋白印跡驗(yàn)證了 siRNA在抑制 TNFR2、IKK、FLIP 和 XIAP 中的功效(*Ρ〈0.05，**Ρ〈0.01，Ν=5)。[0014]圖6顯示了 Treg輸注改善了用于修復(fù)C57BL6小鼠中的頭蓋骨(calvarial bone)缺陷的BMMSC介導(dǎo)的骨形成。(A)頭冠MicroCT圖像(上圖)、矢狀MicroCT (中圖)和頭冠H&E染色(下圖)的頭蓋骨和縫合圖。(B)在未經(jīng)處理的對(duì)照小鼠中產(chǎn)生了 7X8mm的顯著尺寸的頭蓋骨缺陷，且在術(shù)后12周僅鑒定出極為有限量的骨形成(箭頭)。(C)在使用凝膠泡沫作為載體植入4X IO6BMMSC后，在植入后12周存在一定量的骨形成，但未能完全修復(fù)頭蓋缺陷(箭頭)。(D)在BMMSC (4X IO6)/凝膠泡沫植入前2天經(jīng)尾靜脈對(duì)受體小鼠輸注IXlO6的Treg，在植入后12周觀察到頭蓋缺陷的完全修復(fù)(箭頭)。(E)MicroQCT定量分析顯示了各組中骨形成的量。(F)圖像J半定量分析表明，采用全身性Treg輸注的BMMSC/凝膠泡沫植入組與正常頭蓋骨具有相似的骨厚度(*P〈0.01，N=5 ；G:凝膠泡沫；B:骨)。
[0015]圖7顯示出阿司匹林處理通過(guò)抑制IFN-Y和TNF-α顯著改善了基于BMMSC的骨再生。(A)ELISA分析顯示出，與植入后2天至14天的未處理對(duì)照組相比，阿司匹林降低了BMMSC植入物中的IFN-Y和TNF-α水平，但不降低IL-1O水平。(B-1)免疫組織化學(xué)染色顯示，與免疫受損小鼠中的BMMSC植入物相比，C57BL6小鼠中的BMMSC植入物中的IFN- Y和TNF-α陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)目更高。與C57BL6小鼠中的未處理對(duì)照組相比，阿司匹林處理的組中的IFN-Y和TNF-α水平顯著下降。(J-N)將4X IO6BMMSC與50 μ g/ml的阿司匹林一起培養(yǎng)2天，隨后利用凝膠泡沫作為載體(含IOOyg阿司匹林)接種至7X8mm的頭蓋骨缺陷區(qū)域。在接種后12周，MicroQCT分析顯示頭蓋缺陷被完全修復(fù)(K)。然而，BMMSC植入組顯示頭蓋骨缺陷被部分修復(fù)(J)。矢狀MicroQCT圖像和頭冠H&E染色顯示出被修復(fù)的骨結(jié)構(gòu)(L、M)。圖像J半定量分析顯示出頭蓋缺陷區(qū)域中的骨形成的相對(duì)量(N) (*P〈0.01，N=5)。
[0016]圖8顯示了自體同源BMMSC無(wú)法在C57BL6小鼠中使骨再生。(A)當(dāng)利用羥磷灰石/磷酸三鈣(HA/TCP)作為載體將BMMSC經(jīng)皮下植入免疫受損的小鼠時(shí)，骨(B)和骨髓(BM)在HA/TCP(HA)周?chē)偕?B)當(dāng)將自體同源的BMMSC經(jīng)皮下植入C57BL6時(shí)，沒(méi)有骨形成。僅在HA/TCP(HA)周?chē)l(fā) 現(xiàn)結(jié)締組織(CT)。
[0017]圖9顯示出IFN-Y缺乏性T細(xì)胞不能阻斷免疫受損小鼠中的BMMSC介導(dǎo)的骨形成。(A)在BMMSC(2XlO6，帶40mg HA/TCP)植入前2天對(duì)免疫受損小鼠輸注泛T細(xì)胞(I XlO6)，沒(méi)有骨形成。H&E染色顯示出在HA/TCP (HA)周?chē)慕Y(jié)締組織(CT)。(B)輸注源自無(wú)IFN- Y小鼠的IFN- Y缺乏性泛T細(xì)胞不能阻斷BMMSC介導(dǎo)的骨形成。H&E染色顯示出在HA/TCP(HA)周?chē)滦纬傻墓?B)。(C)圖像J半定量分析顯示出骨形成的量(*P〈0.01，N=5)。
[0018]圖10顯示了 IFN-Y協(xié)同性增強(qiáng)了體外TNF-α誘導(dǎo)的BMMSC凋亡。⑷流式細(xì)胞術(shù)分析證實(shí)了 0、5ng/ml、50ng/ml、100ng/ml的TNF-α導(dǎo)致了劑量依賴(lài)性的BMMSC凋亡。額外的IFN-Y (50ng/ml)能協(xié)同增強(qiáng)TNF-α誘導(dǎo)的凋亡。(B)統(tǒng)計(jì)分析顯示,50ng/ml的IFN- Y 顯著增強(qiáng)了 TNF- α 誘導(dǎo)的 BMMSC 凋亡(*P〈0.01，N=4)。
[0019]圖11 顯示了在 IFN- Y /TNF- α 處理的 BMMSC 中 Fas L、Trail 和 TNFRl 的表達(dá)水平。蛋白印跡分析顯示，IFN-Y/TNF-α處理不影響Fas L、TNFRl和Trail的表達(dá)水平。
[0020]圖12顯示了 IFN- Y誘導(dǎo)的非凋亡途徑(A)和IFN- Y /TNF- α誘導(dǎo)的⑶95凋亡途徑(B)的示意圖。
[0021]圖13顯示了阿司匹林處理改善了在體內(nèi)的BMMSC存活和骨再生。(A)當(dāng)GFP陽(yáng)性BMMSC經(jīng)皮下植入30天，與植入后4至30天的未經(jīng)處理的對(duì)照組相比，阿司匹林處理組(50 μ g/ml阿司匹林預(yù)處理2天，100μg阿司匹林共同植入)顯示出存活細(xì)胞數(shù)目顯著增加。(B-G)用50 μ g/ml阿司匹林將BMMSC處理2天，然后與HA/TCP顆粒組合以經(jīng)皮下植入免疫受損的小鼠。與未處理對(duì)照組相比，阿司匹林處理組中的新骨形成量增加(B、C) JOOngIFN-y和TNF-α與BMMSC的共植入抑制了免疫受損小鼠中的皮下骨形成(D、E)。然而，用50 μ g/ml阿司匹林對(duì)BMMSC預(yù)處理并與100 μ g阿司匹林共植入顯著地挽救了 BMMSC介導(dǎo)的骨形成(F、G)。圖像J半定量分析顯示了骨形成的相對(duì)量(H) (*P〈0.05，**P〈0.01,N=5)。
[0022]圖14顯示了 BMMSC/阿司匹林植入對(duì)頭蓋缺陷修復(fù)的示意圖。(a)生成BMMSC/水凝膠/阿司匹林和BMMSC/凝膠泡沫/阿司匹林用于植入。(b)在C57BL6小鼠中沿黃色點(diǎn)產(chǎn)生頭蓋缺陷。(c)將BMMSC/水凝膠/阿司匹林復(fù)合物植入C57BL6小鼠中的頭蓋骨缺陷處。(d)用BMMSC/凝膠泡沫/阿司匹林覆蓋。(e)將頭蓋骨缺陷縫合。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0023]本發(fā)明公開(kāi)了通過(guò)抑制IFN- Y和TNF- α、優(yōu)選通過(guò)位點(diǎn)特異性處理且更優(yōu)選通過(guò)用阿司匹林處理來(lái)改善基于BMMSC的組織工程化的方法和組合物。
[0024]促炎性T細(xì)胞有助于抑制基于BMMSC的骨形成。本發(fā)明的發(fā)現(xiàn)在于，細(xì)胞因子IFN-y和TNF-α在由促炎性T細(xì)胞介導(dǎo)的對(duì)基于BMMSC的骨形成的抑制中起著主要作用。特別地，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，BMMSC植入物中的高水平的IFN-Y和TNF-α與骨形成負(fù)相關(guān)。相比之下，以IFN-Y和TNF-a的對(duì)應(yīng)中和抗體對(duì)其的阻斷可有效挽救BMMSC介導(dǎo)的骨形成。例如，向BMMSC植入物添加如阿司匹林(例如，100 μ g)等促炎性細(xì)胞因子減少劑恢復(fù)了被IFN-Y和TNF-α抑制的骨形成。
[0025]因此，本發(fā)明的一個(gè)方面涉及一種待應(yīng)用至需要組織再生的位點(diǎn)的組織工程化用復(fù)合組合物或組織再生裝置。根據(jù)本發(fā)明的該方面的組合物或裝置通常包含BMMSC和可降低促炎性細(xì)胞因子水平的有效量的促炎性細(xì)胞因子減少劑。在某些實(shí)施方式中，所述組合物或裝置還可以包含基質(zhì)(substrate)。在另一些實(shí)施方式中，所述組合物或裝置還可以包含至少一種載體。
[0026]在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)“促炎性細(xì)胞因子減少劑”和“抗炎劑”可互換使用。它們可以是能夠直接或間接地減小促炎性細(xì)胞因子IFN-Y和/或TNF-α的影響的試劑。例如，可以將能夠中和這些細(xì)胞因子的抗體用作抗炎劑。任何其它已知的或?qū)?lái)開(kāi)發(fā)出的能夠抑制或下調(diào)這些細(xì)胞因子的試劑也可以用作本發(fā)明的抗炎劑。在優(yōu)選實(shí)施方式中，促炎性細(xì)胞因子是阿司匹林。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，阿司匹林的量?jī)?yōu)選為約50 μ g/ml至約100 μ g/ml，更優(yōu)選 50 μ g/ml。
[0027]適用于本發(fā)明的組合物或裝置中的載體優(yōu)選為液體，如ExtraccKR水凝膠。
[0028]適用于本發(fā)明的組合物或裝置中的基質(zhì)優(yōu)選是水不溶性、非彈性、多孔、易彎折的并且能夠吸收或吸附BMMSC和抗炎劑。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，基質(zhì)是海綿，如GEL-FOAM?,.也可以使用本領(lǐng)域中已知的具有相當(dāng)性質(zhì)的其它材料。用于該目的的一個(gè)實(shí)例是吸收性明膠海綿。
[0029]本發(fā)明的另一方面涉及形成如上所述的組合物或裝置的方法。根據(jù)本發(fā)明該方面的方法通常包括將有效量的一種或多種抗炎劑添加至BMMSC的步驟。在某些實(shí)施方式中，可以包括將抗炎劑和/或BMMSC添加至載體的步驟。在某些其它實(shí)施方式中，還可以包括將抗炎劑和/或BMMSC沉積至基質(zhì)的步驟。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，為形成所述組合物/裝置，可以以合適量的時(shí)間(優(yōu)選約3天)用阿司匹林處理BMMSC，并與水凝膠混合。可以將這樣的水凝膠-BMMSC與阿司匹林一起移植到新產(chǎn)生的頭蓋骨缺陷處。另一部分BMMSC可以接種至GEL-FOAM?并與阿司匹林一起培養(yǎng)合適量的時(shí)間(優(yōu)選約3天)?？梢詫⑺玫暮⑺酒チ值哪z泡沫-BMMSC用來(lái)覆蓋頭蓋骨缺陷區(qū)域中此前植入的BMMSC-水凝膠復(fù)合物。
[0030]本發(fā)明的另一方面涉及改善需要新組織的位點(diǎn)處的組織再生。根據(jù)本發(fā)明該方面的方法通常包括將如上所述的復(fù)合組合物或裝置應(yīng)用于所述位點(diǎn)。需要組織再生的位點(diǎn)可以是直接或間接可及的任何位點(diǎn)。例如，其可為離體位點(diǎn)或體內(nèi)位點(diǎn)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述位點(diǎn)是人工生長(zhǎng)的組織/器官。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述位點(diǎn)是頭蓋缺陷位點(diǎn)。
[0031]本發(fā)明的另一方面涉及改善受試對(duì)象中BMMSC介導(dǎo)的骨組織形成的方法。根據(jù)本發(fā)明該方面的方法通常包括以下步驟:在對(duì)受試對(duì)象應(yīng)用基于BMMSC的組織再生誘導(dǎo)物之前，以預(yù)定的持續(xù)時(shí)間對(duì)所述受試對(duì)象全身性輸注Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)。在某些實(shí)施方式中，基于BMMSC的組織再生誘導(dǎo)物可以是種子BMMSC。在其它實(shí)施方式中，基于BMMSC的組織再生誘導(dǎo)物可以是處于載體中的BMMSC。在另一些實(shí)施方式中，基于BMMSC的組織再生誘導(dǎo)物可以是如上所述的組織再生組合物或裝置。
[0032]盡管上述實(shí)施方式概述了本發(fā)明的一般步驟和要素，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解可能存在各種變化。通過(guò)以下具體說(shuō)明和后附權(quán)利要求，本發(fā)明的其它方面和優(yōu)點(diǎn)將變得顯而易見(jiàn)。
【具體實(shí)施方式】
[0033]縮寫(xiě):
[0034]如本文所用，縮寫(xiě)“BMMSC”代表“骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞”。
[0035]如本文所用，縮寫(xiě)“Thl”代表“T輔助細(xì)胞I”。
[0036]如本文所用，縮寫(xiě)“Runx-2”代表“Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2”。
[0037]如本文所用，縮寫(xiě)“TNF-α ”代表“腫瘤壞死因子α ”。
[0038]如本文所用，縮寫(xiě)“NFk B”代表“核因子κ B”。
[0039]如本文所用，縮寫(xiě)“Treg”代表“調(diào)節(jié)性T細(xì)胞”。
[0040]骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMMSC)是非造血性多能干細(xì)胞，其能夠分化為間充質(zhì)和非間充質(zhì)細(xì)胞類(lèi)型，包括成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和軟骨細(xì)胞。當(dāng)被植入體內(nèi)后，BMMSC能形成骨并誘導(dǎo)受體細(xì)胞形成造血骨髓成分。
[0041]本發(fā)明的一個(gè)發(fā)現(xiàn)在于，IFN-Y和TNF-a在控制體內(nèi)的基于BMMSC的骨形成方面起著關(guān)鍵作用。在BMMSC植入物中IFN-Y和TNF-α的增加與BMMSC介導(dǎo)的骨形成負(fù)相關(guān)，IFN-y協(xié)同性增強(qiáng)了 TNF-a誘導(dǎo)的BMMSC凋亡并抑制了 BMMSC成骨。[0042]不受限于理論，本發(fā)明的數(shù)據(jù)表明，IFN- Y對(duì)TNF- α誘導(dǎo)的BMMSC凋亡的協(xié)同效應(yīng)需要Fas信號(hào)傳導(dǎo)。顯然地，F(xiàn)as內(nèi)化和聚簇(clustering)通過(guò)在IFN-gamma和TNF-α的存在下使半胱天冬酶8/3激活促進(jìn)協(xié)同性BMMSC凋亡。IFN- Y處理激活了 BMMSC中的Fas表達(dá)水平以啟動(dòng)非凋亡途徑，在該非凋亡途徑中骨形成受到Smad6的激活和Runx2的減少的抑制。然而，用IFN-Y和TNF-α —起對(duì)BMMSC的處理能通過(guò)對(duì)TNFR2/NF κ B替代性信號(hào)傳導(dǎo)途徑的抑制將非凋亡性Fas信號(hào)傳導(dǎo)轉(zhuǎn)化為死亡途徑。
[0043]簡(jiǎn)言之，對(duì)IFN- Y和TNF- α的抑制改善了基于BMMSC的骨再生。Treg處理也改善了用于修復(fù)頭蓋缺陷的基于BMMSC的組織工程化。在BMMSC植入前對(duì)接受者的Treg輸注導(dǎo)致缺陷被完全修復(fù)，如MicroQCT所評(píng)估(圖6D和6Ε)。據(jù)MicroQCT和組織學(xué)分析評(píng)估，再生的骨結(jié)構(gòu)與原始的頭蓋結(jié)構(gòu)相同(圖6A、6D和6F)。位點(diǎn)特異性阿司匹林處理通過(guò)抑制IFN-Y和TNF-α而改善了基于BMMSC的頭蓋缺陷修復(fù)。位點(diǎn)特異性藥理學(xué)處理方法抑制了 IFN- Y和TNF- α的表達(dá)并改善了基于BMMSC的頭蓋缺陷修復(fù)。向BMMSC植入物添加阿司匹林(IOOyg)恢復(fù)了被IFN-Y或TNF-α阻遏的骨形成。
[0044]因此，本發(fā)明的一個(gè)方面涉及用于BMMSC介導(dǎo)的組織再生的改進(jìn)方法。根據(jù)本發(fā)明該方面的方法優(yōu)選包括對(duì)有需要的受試對(duì)象施用有效量的組合物，其量足以降低或抑制選自由IFN- Y和/或TNF- α組成的組的促炎性細(xì)胞因子。
[0045]本發(fā)明的另一方面涉及改進(jìn)的骨再生方法，其包括降低選自IFN-Y和/或TNF-a組成的組的抗炎劑的水平。根據(jù)本發(fā)明該方面的方法優(yōu)選包括:將BMMSC沉積(或安置)于特定的位點(diǎn)或環(huán)境，并在BMMSC所沉積的位點(diǎn)或環(huán)境處局部施用組合物。
[0046]本發(fā)明的再一方面涉及復(fù)合組合物或裝置。根據(jù)本發(fā)明該方面的復(fù)合組合或裝置通常包括能夠降低IFN- Y、TNF- α或優(yōu)選兩者的水平(更優(yōu)選在BMMSC沉積位點(diǎn)處的水平)的試劑或藥物組合物。復(fù)合組合物還可以是藥物組合物，優(yōu)選包含阿司匹林的藥物組合物。更優(yōu)選地,所述藥物組合物包含Treg和阿司匹林中的至少一種。
[0047]阿司匹林的局部施用降低了植入位點(diǎn)中的IFN-Y和TNF-a的水平，且顯著改善了基于BMMSC的頭蓋缺陷修復(fù)。這些數(shù)據(jù)綜合起來(lái)揭示了受體T細(xì)胞在基于BMMSC的組織工程化中此前未得到認(rèn)識(shí)的作用，并提出了用于通過(guò)對(duì)局部細(xì)胞因子的藥物性控制而增強(qiáng)骨再生的實(shí)際方法的啟示。本發(fā)明應(yīng)該被理解為包括阿司匹林和其它已知可降低IFN-Y和TNF-a的水平的結(jié)構(gòu)性或功能性相關(guān)的化合物。
[0048]換言之，發(fā)明人開(kāi)發(fā)了一種通過(guò)位點(diǎn)特異性阿司匹林處理而抑制IFN-Y和TNF-a從而改善基于BMMSC的組織工程化的實(shí)際方法。通過(guò)將T細(xì)胞過(guò)繼轉(zhuǎn)移至免疫受損的小鼠，我們確定了促炎性T細(xì)胞有助于抑制基于BMMSC的骨形成。發(fā)明人進(jìn)而鑒定出IFN-y和TNF-a在促炎性T細(xì)胞介導(dǎo)的對(duì)基于BMMSC的骨形成的抑制中的主要作用。不想受任何特定理論所限，本發(fā)明的發(fā)現(xiàn)可以由以下發(fā)現(xiàn)所解釋=BMMSC植入物中的高水平IFN-Y和TNF-α與骨形成負(fù)相關(guān)，且用IFN-Y和TNF-α的各自中和抗體阻斷IFN-Y和TNF- α可有效挽救BMMSC介導(dǎo)的骨形成。
[0049]IFN- Y如何提高BMMSC中的Fas表達(dá)水平是未知的，這似乎就是發(fā)生在骨肉瘤細(xì)胞系中的情形(6)。令人感興趣的是，IFN-Y誘導(dǎo)的Fas表達(dá)與IFN-Y介導(dǎo)的通過(guò)激活Smad-6途徑對(duì)BMMSC的成骨分化的阻斷相關(guān)。已知的是，Smad-6通過(guò)BMP和runx2信號(hào)傳導(dǎo)而抑制成骨分化(7，8)。然而，有效抑制BMMSC的成骨需要相對(duì)較高的IFN-Y濃度。因此，IFN-Y在BMMSC介導(dǎo)的骨形成中的抑制功能可能是由于其與TNF-α的協(xié)同效應(yīng)，這通過(guò)激活由Fas信號(hào)傳導(dǎo)介導(dǎo)的死亡途徑而提高BMMSC凋亡。就此而言，單獨(dú)IFN- Y處理能上調(diào)Fas表達(dá)，但不能誘導(dǎo)BMMSC凋亡，這可歸因于該級(jí)聯(lián)中與TNFR2相關(guān)的NFk B、XIAP和FLIP的抗凋亡功能(9，10)。然而，通過(guò)添加TNF-α處理，IFN-y誘導(dǎo)的非凋亡Fas信號(hào)傳導(dǎo)由于抗凋亡因子NFk B、XIAP和FLIP的減少而被轉(zhuǎn)化為凋亡級(jí)聯(lián)，這由死亡介導(dǎo)物半胱天冬酶3和8的Fas內(nèi)化或激活所證明。
[0050]當(dāng)經(jīng)皮下植入時(shí)，包括自體同源BMMSC在內(nèi)的BMMSC不能使C57BL6小鼠中的骨結(jié)構(gòu)再生，這可能與Thl細(xì)胞因子IFN-Y和TNF-α相關(guān)。同樣的BMMSC植入在缺乏T細(xì)胞的免疫受損小鼠中容易地使骨再生。與這一觀察相一致的是，輸注Treg降低了 IFN-Y和TNF-α水平并增強(qiáng)了 BMMSC介導(dǎo)的骨形成。重要的是，使用頭蓋骨缺陷模型來(lái)驗(yàn)證基于BMMSC的組織工程化的效力，因其代表臨床相關(guān)的骨缺陷模型并且易于評(píng)估新再生的骨的數(shù)量和質(zhì)量(11，12) O
[0051]阿司匹林是廣泛使用的非甾體抗炎劑(NSAID)。其通過(guò)影響多個(gè)生物途徑(例如，抑制C0X2、C0X1和PGE2活性)來(lái)抑制破骨細(xì)胞形成并且改善成骨(13-15)。在本發(fā)明中，發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)阿司匹林抑制IFN-Y和TNF-a水平并逆轉(zhuǎn)了促炎性細(xì)胞因子誘導(dǎo)的BMMSC的成骨缺陷。發(fā)明人還利用了皮下植入和頭蓋骨缺陷修復(fù)模型顯示出，阿司匹林處理是可通過(guò)抑制IFN-Y和TNF-a而改善基于BMMSC的組織再生的合適方法。
[0052]特定發(fā)現(xiàn)和實(shí)施方式的說(shuō)明
[0053]受體T細(xì)胞(recipient T cell)通過(guò)IFN-Y和TNF-α調(diào)節(jié)BMMSC介導(dǎo)的骨再生。不限于任何特定理論，我們假定T細(xì)胞調(diào)節(jié)植入的供體BMMSC。利用已建立的體內(nèi)BMMSC植入體系，其中4X IO6BMMSC與載體羥磷灰石磷酸三鈣(HA/TCP)被經(jīng)皮下植入C57BL6或免疫受損小鼠(圖1A)，我們指出源自同窩生仔畜的BMMSC不能在植入后8周在C57BL6小鼠中生成骨結(jié)構(gòu)(圖1B)。對(duì)于自體同源MMSC植入觀察到相同的結(jié)果(圖8)。相比之下，當(dāng)BMMSC被植入T細(xì)胞缺乏的免疫受損小鼠時(shí)，其形成骨和相關(guān)造血骨髓(圖1C)。為了檢驗(yàn)受體T細(xì)胞是否影響了 BMMSC介導(dǎo)的骨形成，在皮下B麗SC植入前`2天將I XlO6泛T細(xì)胞輸注到免疫受損小鼠中。在這些輸注了 T細(xì)胞的免疫受損小鼠中，BMMSC介導(dǎo)的骨形成被完全阻斷(圖1D)。在BMMSC植入物中僅觀察到HA/TCP顆粒周?chē)慕Y(jié)締組織，與C57BL6小鼠中的BMMSC植入物類(lèi)似(圖1B)。這些數(shù)據(jù)表明，受體T細(xì)胞可能在抑制BMMSC介導(dǎo)的骨形成中起著關(guān)鍵作用。
[0054]接著，發(fā)明人檢驗(yàn)了特定的T細(xì)胞亞類(lèi)是否阻斷了基于BMMSC的股再生。據(jù)發(fā)現(xiàn)，向免疫受損小鼠經(jīng)靜脈內(nèi)輸注I X IO6的⑶4+或⑶4+⑶25-T細(xì)胞阻斷了 BMMSC介導(dǎo)的骨形成(圖1E和圖1F)。然而，施用⑶4+⑶25+FOXp3+T細(xì)胞(Treg)沒(méi)有顯示出對(duì)免疫受損小鼠中的BMMSC介導(dǎo)的骨形成的抑制作用(圖1G和圖1H)，從而表明非Treg細(xì)胞抑制了 BMMSC介導(dǎo)的骨形成。
[0055]為了研究受T細(xì)胞調(diào)節(jié)的基于BMMSC的骨形成的機(jī)制，發(fā)明人評(píng)估了 BMMSC植入物中的包括IFN-Y、TNF-a、IL_4、IL_6和IL-17A在內(nèi)的各種細(xì)胞因子的水平(圖11-M)。令人感興趣的是，在C57BL6小鼠和接受泛T細(xì)胞或CD4+CD25-T細(xì)胞的免疫受損小鼠中植入BMMSC后的7至14天，BMMSC植入物中的IFN- 和TNF-α的水平顯著升高(圖1I，1K，1L)。具有高水平的IFN- Y和TNF- α的BMMSC植入物與植入后8周新的骨形成的缺乏相關(guān)(圖1B、1D、1E、1F、1H)。相反，在植入2至21天后在源自免疫受損小鼠和輸注了 Treg的免疫受損小鼠的BMMSC植入物中，上述細(xì)胞因子的水平?jīng)]有改變(圖1J和1M)。這些植入物顯示出顯著量的新骨形成(圖1C和1G)。因此，IFN-y和TNF-α的增加與BMMSC植入物中的BMMSC介導(dǎo)的骨形成負(fù)相關(guān)。
[0056]為進(jìn)一步評(píng)估細(xì)胞因子在BMMSC介導(dǎo)的骨形成中的作用，將200ng的IFN-y、TNF-α、IL-4、IL-6或IL-17A經(jīng)皮下與BMMSC共同植入免疫受損小鼠中(圖1N-T)。IFN-y或TNF-a處理減少了植入后8周時(shí)的骨形成(圖1R和IS)。同時(shí)，當(dāng)與未經(jīng)處理的對(duì)照組比較時(shí)(圖1N和IT)，IL-4或IL-6處理輕微抑制了 BMMSC介導(dǎo)的骨形成(圖10和1P)，而IL-17A處理對(duì)BMMSC介導(dǎo)的骨形成沒(méi)有抑制作用(圖1Q)。相比之下，IFN- Y和TNF- a中和抗體的注入顯著地挽救了 C57BL6小鼠中的BMMSC介導(dǎo)的骨形成(圖1U-W)。因此，IFN-y和TNF-a兩者都在監(jiān)管體內(nèi)基于BMMSC的骨形成中起著關(guān)鍵作用。
[0057]CD4+CD25+Foxp3+Treg抑制了 T細(xì)胞激活并減少了 IFN-Y和TNF-a生成。因此，發(fā)明人在BMMSC植入前2天將1\1061'代8輸注至05781^6小鼠，并發(fā)現(xiàn)在輸注了 Treg的BMMSC植入物中具有顯著量的骨形成，而在對(duì)照BMMSC植入物中沒(méi)有骨形成(圖2A-2C)。為了檢驗(yàn)Treg在基于BMMSC的骨形成中的保護(hù)性作用是否可歸因于對(duì)C57BL6小鼠中的促炎性細(xì)胞因子的抑制，我們測(cè)定了 Treg處理的小鼠中的細(xì)胞因子水平。我們觀測(cè)到，Treg輸注降低了 BMMSC植入物中的IFN-Y和TNF-α的水平，但沒(méi)有降低IL-4和IL-10的水平(圖2D)。因此，對(duì)IFN-Y和TNF-a的抑制改善了基于BMMSC的骨再生。
[0058]IFN-Y抑制了 BMMSC的成骨。當(dāng)將IFN-Y+T細(xì)胞全身性輸注至免疫受損小鼠時(shí)，其未能阻斷BMMSC介導(dǎo)的骨形成(圖9)，從而表明IFN-Y為T(mén)細(xì)胞介導(dǎo)的成骨抑制所需(圖1D和1K)。進(jìn)一步的分析表明，在體外，與未經(jīng)處理的對(duì)照組相比，IFN-Y (200ng/ml)處理而非IL-6或IL-17A處理抑制了 BMMSC中的成骨分化，如茜素紅染色所證實(shí)(圖3A)。IL-4處理(200ng/ml)充當(dāng)陽(yáng)性對(duì)照，其顯示出對(duì)BMMSC成骨分化的部分抑制(24;圖3A)。令人感興趣的是，50ng/ml的IFN- Y處理對(duì)BMMSC成骨分化沒(méi)有抑制作用(圖3B)。IFN-y的這種劑量依賴(lài)性成骨抑制與Smad6 (成骨分化的負(fù)調(diào)節(jié)劑)的表達(dá)上調(diào)有關(guān)，且與200ng/ml IFN-y組中成骨基因(Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2 (Runx2)、骨鈣蛋白和堿性磷酸酶(ALP))的表達(dá)下調(diào)有關(guān)(50ng/ml IFN-y組中未觀測(cè)到)(圖3C)。
[0059]此外，發(fā)明人還揭示了 IFN- Y處理激活了 BMMSC中的Fas表達(dá)(圖4F)，而IFN- Y處理未能減少成骨分化并改變Fas+BMMSC (圖3D)和以siRNA敲低Fas的BMMSC (圖3E)中的Smad6和Runx2表達(dá)水平。
[0060]IFN- Y全身性增強(qiáng)了 TNF- α誘導(dǎo)的BMMSC凋亡。當(dāng)BMMSC與包括IFN- Y ,TNF- α、IL-4、IL-6、IL-17A和TGF-β在內(nèi)的各種細(xì)胞因子一同培養(yǎng)時(shí)，僅TNF-α處理以劑量依賴(lài)性方式導(dǎo)致了顯著的細(xì)胞死亡，如甲苯胺藍(lán)染色所證實(shí)(圖4Α)。為了確定IFN-Y對(duì)經(jīng)TNF-α處理的BMMSC的影響，我們?cè)谟貌煌瑒┝康腡NF-a (lng/ml~200ng/ml)處理的BMMSC 中添加了 50ng/ml IFN-y (圖 4B)。當(dāng) TNF-a 濃度達(dá)到 50ng/ml ~200ng/ml 時(shí)，IFN-y處理顯著增強(qiáng)了 BMMS C凋亡，如甲苯胺藍(lán)染色(圖4B)和膜聯(lián)蛋白V凋亡流式細(xì)胞分析(圖10)所評(píng)估。為進(jìn)一步證實(shí)TNF-a和IFN-Y對(duì)抑制BMMSC凋亡的協(xié)同效應(yīng)，向經(jīng) lng/ml ~200ng/ml IFN- Y 處理的 BMMSC 中添加 50ng/ml TNF- α (圖 4C)。BMMSC 的凋亡量與lng/ml~50ng/ml的IFN-y濃度相關(guān)。當(dāng)IFN-y濃度達(dá)到100ng/ml~200ng/ml時(shí)，觀察到完全的BMMSC凋亡(圖4C)。另外，發(fā)明人利用膜聯(lián)蛋白V免疫細(xì)胞染色證實(shí)，50ng/ml的IFN-y增強(qiáng)了 20ng/ml TNF-a介導(dǎo)的BMMSC凋亡(圖4D)。然后，發(fā)明人利用體內(nèi)皮下GFP+BMMSC植入模型驗(yàn)證了 IFN- Y對(duì)TNF- α誘導(dǎo)的BMMSC凋亡的協(xié)同效應(yīng)(16，17)。植入后30天，經(jīng)50ng/ml TNF- α預(yù)處理的GFP+BMMSC顯示出與來(lái)自未經(jīng)處理的對(duì)照組相比存活細(xì)胞數(shù)的顯著減少(圖4E)。200ng/ml IFN-y和50ng/ml TNF-α的聯(lián)合處理導(dǎo)致植入物中沒(méi)有GFP+BMMSC存活(圖4E)。IFN-gamma能夠協(xié)同性增強(qiáng)由TNF-α誘導(dǎo)的BMMSC凋亡。
[0061]接著，發(fā)明人檢驗(yàn)了 IFN-Y增強(qiáng)由TNF-α誘導(dǎo)的BMMSC凋亡的分子機(jī)制。據(jù)發(fā)現(xiàn)，IFN- Y處理使BMMSC中的Fas表達(dá)上調(diào)而不激活半胱天冬酶3和半胱天冬酶8 (圖4F)，這表明IFN- Y誘導(dǎo)的Fas表達(dá)不能啟動(dòng)凋亡過(guò)程。當(dāng)向經(jīng)50ng/ml IFN- Y處理的BMMSC添加20ng/ml (該濃度無(wú)法誘導(dǎo)顯著的BMMSC凋亡)TNF- α?xí)r，半胱天冬酶3和半胱天冬酶8被激活(圖4F)并伴有顯著的BMMSC凋亡(圖4Η)。然而，20ng/ml TNF-α和50ng/mlIFN- Y處理的組合不能在Fas+BMMSC中使半胱天冬酶3和半胱天冬酶8激活(圖4F)。為了進(jìn)一步證實(shí)Fas信號(hào)傳導(dǎo)有助于加速I(mǎi)FN- Y /TNF- α處理的BMMSC中的凋亡過(guò)程，發(fā)明人利用siRNA敲低了 BMMSC中的Fas表達(dá)，并顯示出在IFN- y /TNF- α處理的BMMSC中激活的半胱天冬酶8和半胱天冬酶3被部分地阻斷(圖4G)并且凋亡BMMSC的數(shù)目顯著減少(圖4Η)。這些數(shù)據(jù)表明，IFN- Y對(duì)TNF- α誘導(dǎo)的BMMSC凋亡的協(xié)同效應(yīng)需要Fas信號(hào)傳導(dǎo)。
[0062]接下來(lái)的問(wèn)題在于，F(xiàn)as凋亡信號(hào)傳導(dǎo)在IFN- Y /TNF- α處理的BMMSC中如何被激活。發(fā)明人揭示出，在IFN- Y /TNF- α處理的BMMSC中利用siRNA將Fas-L水平敲低未能減少凋亡細(xì)胞的數(shù)目(數(shù)據(jù)未示出)，從而排除了 Fas-L作為有助于BMMSC凋亡的潛在因子的可能。因此，發(fā)明人假設(shè)，F(xiàn)as內(nèi)化可能激活I(lǐng)FN- Y /TNF- α處理的BMMSC中的Fas/半胱天冬酶8/3凋亡信號(hào)傳導(dǎo)。利用熒光免疫細(xì)胞染色，顯示出IFN-Y和TNF-α的聯(lián)合處理誘導(dǎo)了 Fas內(nèi)化和聚簇。在未經(jīng)處理的對(duì)照組中，F(xiàn)as在BMMSC表面均勻分布(圖5A)。將BMMSC用IFN-Y處理12小時(shí)然后添加TNF-α，在0.5小時(shí)至I小時(shí)時(shí)顯示出Fas在細(xì)胞質(zhì)中顯著地聚簇和內(nèi)化(圖5A)。在TNF-α處理2小時(shí)至4小時(shí)時(shí)，觀察到更顯著的Fas聚簇和細(xì)胞收縮以及細(xì)胞膜破裂(圖5A)。以胞吞抑制劑Latrunadin A (Lnt A)阻斷Fas內(nèi)化能部分地挽救IFN- Y /TNF- α誘導(dǎo)的凋亡并抑制切割的半胱天冬酶3和8 (圖5Β)。令人感興趣的是，通過(guò)利用半胱天冬酶8或半胱天冬酶3的特異性抑制劑對(duì)其活性進(jìn)行阻斷，IFN-Y/TNF-α處理的BMMSC展示出凋亡細(xì)胞數(shù)目的顯著減少(圖5C)。此外，據(jù)顯示，泛半胱天冬酶、半胱天冬酶3和半胱天冬酶8的抑制能夠部分地阻斷Fas內(nèi)化，如免疫染色所示(圖OT)。這些數(shù)據(jù)表明，F(xiàn)as內(nèi)化和聚簇通過(guò)在IFN-Y和TNF-α的存在下使半胱天冬酶8/3激活而促進(jìn)協(xié)同的BMMSC凋亡。
[0063]發(fā)明人接著研究了 IFN- Y和TNF- a如何共同導(dǎo)致BMMSC中的Fas內(nèi)化和聚簇。首先，我們指出IFN- Y /TNF- α處理不能誘導(dǎo)TNFRl、TRAIL和Fas L蛋白的表達(dá)顯著上調(diào)(圖11)。其后我們發(fā)現(xiàn)，當(dāng)與IFN- Y處理組或TNF- α處理組相比時(shí)，IFN- Y /TNF- α處理降低了 TNFR2及其下游信號(hào)傳導(dǎo)的磷酸化NK κ B、XIAP和FLIP的水平(圖5E)，從而表明IFN- Y和TNF- α組合處理選擇性地抑制了提供抗凋亡效應(yīng)的TNFR2途徑。為證實(shí)TNFR2途徑在IFN- Y /TNF- α誘導(dǎo)的BMMSC凋亡中的作用，發(fā)明人指出siRNA對(duì)TNFR2、IKK、XIAP和FLIP的減少進(jìn)一步激活半胱天冬酶8和3 (圖5F)。TNFR2、IKK、XIAP和FLIP被其特異性siRNA的敲低為蛋白印跡分析所證實(shí)(圖5G)。
[0064]這些發(fā)現(xiàn)綜合起來(lái)揭示出，IFN- Y處理激活了 BMMSC中的Fas表達(dá)水平，從而啟動(dòng)了其中成骨受到Smad6的激活和Runx-2的減少的抑制的非凋亡途徑(圖12A)。然而，用IFN- Y和TNF- α共同對(duì)BMMSC的處理能夠通過(guò)抑制TNFR2/NK κ B替代性信號(hào)傳導(dǎo)途徑而將非凋亡Fas信號(hào)傳導(dǎo)轉(zhuǎn)化為死亡途徑(圖12Β)。
[0065]Treg處理改善了用于修復(fù)頭蓋缺陷的基于BMMSC的組織工程化。由于Treg的輸注抑制了 C57BL6小鼠的植入位點(diǎn)中IFN- Y和TNF- α的水平(圖2D)，發(fā)明人假設(shè)Treg處理能改善基于細(xì)胞的組織工程化。為了檢驗(yàn)這一假設(shè)，在C57BL6小鼠中我們生成臨界尺寸的頭蓋骨缺陷(7\8臟)(圖6八和68)。在手術(shù)后12周的未經(jīng)處理的組中，觀察到極少量的骨形成(圖6Β)。以凝膠泡沫作為載體植入BMMSC顯示出中等骨再生，但未能完全修復(fù)缺陷(圖6C)。然而，在BMMSC/凝膠泡沫植入前2天向接受者輸注Treg致使缺陷得到完全修復(fù)，如MicroQCT所評(píng)估(圖6D和6E)。再生的骨結(jié)構(gòu)與原始頭蓋結(jié)構(gòu)相同，如MicroQCT和組織學(xué)分析所評(píng)估(圖6A、6D和6F)。這些數(shù)據(jù)表明，Treg處理改善了 BMMSC介導(dǎo)的組織工程化。
[0066]位點(diǎn)特異性阿司匹林處理通過(guò)抑制IFN-Y和TNF-α而改善了基于BMMSC的頭蓋缺陷修復(fù)。由于阿司匹林可以抑制TNF-a和IFN-Y的功能(14)，發(fā)明人檢測(cè)了植入后2至14天阿司匹林處理對(duì)BMMSC植入物中的IFN-Y和TNF-a水平的影響。據(jù)顯示，阿司匹林處理降低了 IFN-Y和TNF-a水平，而不影響IL-1O水平(圖7A)。免疫組織化學(xué)分析證實(shí)了阿司匹林處理對(duì)BMMSC植入物中的IFN-Y和TNF-a陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)目的抑制效應(yīng)(圖7B-1)。為了確定BMMSC植入物中阿司匹林介導(dǎo)的IFN-Y或TNF-a的減少是否影響了 BMMSC的凋亡，發(fā)明人利用GFP+BMMSC植入模型顯示了植入后4至30天在阿司匹林處理組中BMMSC存活的顯著增加(圖13A)。
[0067]發(fā)明人然后研 究了阿司匹林對(duì)體內(nèi)BMMSC介導(dǎo)的骨形成的外源性IFN-Y和TNF- a的抑制效果。我們用50 μ g/ml的阿司匹林處理BMMSC2天后，利用HA/TCP作為載體經(jīng)皮下將其植入免疫受損小鼠。與未經(jīng)處理的對(duì)照組相比，阿司匹林預(yù)處理增加了 BMMSC介導(dǎo)的骨形成(圖13B、13C)。其后我們植入具有IFN-Y或TNF-a (200ng)的BMMSC，并觀察到骨形成的顯著減少(圖1R-T和圖13D和13E)。但是，向BMMSC植入物添加阿司匹林(IOOyg)挽救了受到IFN-Y或TNF-a抑制的骨形成(圖13F-13H)。此外，發(fā)明人研究了阿司匹林處理是否可應(yīng)用于增強(qiáng)基于BMMSC的頭蓋缺陷修復(fù)。事實(shí)上，與對(duì)照BMMSC/凝膠泡沫組相比，帶有含阿司匹林(IOOyg)的凝膠泡沫的BMMSC(4X IO6)的植入導(dǎo)致頭蓋缺陷修復(fù)的顯著改善(圖7J和7K)。再生組織的結(jié)構(gòu)與正常頭蓋組織類(lèi)似(圖7L-7N)。
[0068]實(shí)驗(yàn)
[0069]材料與方法
[0070]動(dòng)物:雌性C3H/He J、C57BL/6 J、B6.1 29S7-1 fngtDllTs/J、C57BL/6-Tg (CAG-EGFP) 10sb/J、Β6.MRL-FaslpVJ 小鼠購(gòu)自 Jackson 實(shí)驗(yàn)室(BarHarbor, ME)。雌性免疫受:損小鼠(Beige 裸 / 裸 XIDIII)購(gòu)自 Harlan (Indianapolis, IN)。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均在制度許可的動(dòng)物研究應(yīng)用規(guī)程下進(jìn)行(南加州大學(xué)10874和10941號(hào)規(guī)程)。
[0071 ] 抗體和抑制劑:未綴合的抗TNF- α、抗Fas、抗Smad6和抗Smad7抗體購(gòu)自Santa Cruz Biosciences (Santa Cruz, CA)。未綴合的抗 GFP、抗 0CN、抗 TRAIL、抗TNFRl、抗 FasL、抗 FLIP 和抗 XIAP 抗體購(gòu)自 Abeam Inc.(San Francisco, CA)。未綴合的抗 Runx-2 購(gòu)自 Calbiochem Inc.(La Jolla, CA)?？?TNFR2、抗半胱天冬酶 8、抗抗半胱天冬酶3、抗切割的半胱天冬酶8和抗切割的半胱天冬酶3購(gòu)自Cell SignalingInc.(San Francisco, CA)?？?IFN-y-FITC 抗體購(gòu)自 eBioscience(San Diego, CA)。抗β -肌動(dòng)蛋白抗體購(gòu)自Sigma (St Louis, MO)。LEAF?純化抗小鼠IFN- Y抗體和抗小鼠 TNF-α 抗體購(gòu)自 Biolegend(Danvers, MA)。重組鼠類(lèi) IFN1、TNF-α、IL-6、IL-17A、IL-4 購(gòu)自 PeproTech (Rocky Hill, NJ) ? Alexa Fluor? 488 鬼筆環(huán)妝購(gòu)自 Corporation (Carlsbad, CA)。泛半胱;天冬酶抑制劑 I (Z-VAD(OMe)-FMK)購(gòu)自EMD Chemicals, Inc (Gibbstown, NJ)。用于半胱天冬酶 8 (2-1ETD-FMK)和半胱天冬酶3 (Z-DEVD-FMK)的抑制劑購(gòu)自R&D System (Minneapolis, MN)。內(nèi)化用抑制劑(拉春庫(kù)林(Latrunculin)A)購(gòu)自 Sigma-Aldrich Corporate (St Louis, MO) 0HyStem? 和 Extracel-HP水凝膠購(gòu)自 Glycosan (Salt Lake City, Utah) ? [0072]試劑盒:泛T細(xì)胞分離試劑盒II和CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞分離試劑盒購(gòu)自Miltenyi Biotec (Bergisch Gladbach,德國(guó))。小鼠 IFN-Y、TNF-α、IL-6、IL-17A、IL-4和 IL-10ELISA Ready-SET-GO 試劑盒購(gòu)自 eBioscience (San Diego, CA)。用于 Fas、Smad6、TNFR2、IKK、FLIP 和 XIAP 的 siRNA 試劑盒購(gòu)自 Santa Cruz Biosciences (Santa Cruz, CA) ?
[0073]小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMMSC)的分離:用2%的熱滅活胎牛血清(FBS;Equitech-Bio, Kerrvilie, TX)的PBS溶液將骨髓細(xì)胞從股骨和脛骨的骨腔中閃沖出來(lái)。通過(guò)流經(jīng)70 μ m細(xì)胞過(guò)濾器(BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ)獲得全部核細(xì)胞(ANC)的單細(xì)胞懸浮液。分選出⑶146陽(yáng)性ANC，并以I X IO4接種至IOOmm培養(yǎng)皿(CorningCorporation, Corning, NY),并在37°C和5%C02條件下初始溫育48小時(shí)。為了消除非粘附性細(xì)胞，將培養(yǎng)物用PBS洗滌兩次。將附著的細(xì)胞培養(yǎng)16天。將BMMSC用α最低必需培養(yǎng)基(a -MEM, Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA)培養(yǎng)，該培養(yǎng)基補(bǔ)充有 20%FBS、2mML-谷氨酸胺(Invitrogen Corporation) >55 μ M2-疏基乙醇(Invitrogen Corporation)、100U/ml 青霉素和 100 μ g/ml 鏈霉素(Invitrogen Corporation)。
[0074]免疫熒光和免疫化學(xué)顯微分析:收獲移植物，在4%多聚甲醛中固定，然后用5%乙二胺四乙酸(EDTA，pH7.4)脫鈣，接著用石蠟或最佳切割溫度化合物(OCT，SakuraFineteckInc., Torrance, CA)進(jìn)行包埋。將石臘或冷凍切片用與二抗匹配的正常血清阻斷，與特異性或同種型匹配的小鼠抗體(1:200)在4°C過(guò)夜溫育。對(duì)于免疫熒光染色，將樣品用若丹明 /FITC 綴合的二抗(1:200, Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA; SouthernBiotechnology, Birmingham, AL)處理，然后借助含4’，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)的Vectashield 封固培養(yǎng)基(Vector Laboratories, Burlingame, CA)封固。對(duì)于免疫化學(xué)染色，利用Zymed SuperPicture?試劑盒(Invitrogen Corporation)根據(jù)制造商說(shuō)明對(duì)樣品進(jìn)行染色。
[0075]BMMSC介導(dǎo)的骨形成:將約4.0X IO6BMMSC與作為載體的羥磷灰石/磷酸三鈣(HA/TCP)陶瓷顆粒(40mg, Zimmer Inc., Warsaw, IN)混合,并經(jīng)皮下植入8周至10周齡的免疫受損小鼠或C57BL/6J小鼠的背部表面。在植入后8周，收獲植入物，用4%多聚甲醛固定，然后用59ffiDTA(pH7.4)脫鈣，隨后進(jìn)行石蠟包埋。將6 μ m石蠟切片用蘇木精或曙紅(H&E)染色，并通過(guò)NIH圖像J進(jìn)行分析。選擇5個(gè)視野，并計(jì)算每個(gè)視野中的新形成的礦化組織，以占總組織面積的百分比顯示。[0076]BMMSC介導(dǎo)的骨形成中的細(xì)胞因子:將大約4.0X IO6源自同窩仔畜的或自體同源的 BMMSC 與 HA/TCP 陶瓷粉末(40mg, Zimmer Inc.)混合，并用帶有 200ng IFN- y ,TNF- α、IL-4、IL-6 或 IL-17A 的水凝膠(Glycosan Biosysterms, Salt Lake City, UT)覆蓋植入物的表面作為緩釋體系。在植入后8周，收獲植入物并分析新形成的礦化組織面積。
[0077]成骨分化測(cè)試:在含2πιΜβ -甘油磷酸酯(Sigma-Aldrich)、100 μ ML-抗環(huán)血酸2-磷酸酯和IOnM地塞米松(Sigma-Aldrich)的成骨培養(yǎng)條件培養(yǎng)基下培養(yǎng)BMMSC。每3天向成骨培養(yǎng)條件培養(yǎng)基添加不同劑量的IFN-Y (50ng/ml、200ng/ml)。成骨誘導(dǎo)后，用茜素紅對(duì)培養(yǎng)物染色。通過(guò)蛋白印跡分子檢驗(yàn)Runx2、ALP和OCN的表達(dá)。
[0078]體內(nèi)細(xì)胞輸注:將約1.0 X IO6個(gè)細(xì)胞懸浮在200 μ L PBS中并經(jīng)尾靜脈注入小鼠。
[0079]蛋白印跡分析:利用M-PER哺乳動(dòng)物蛋白提取試劑(Thermo，Rockford, IL)提取總蛋白。利用NE-PER核與細(xì)胞質(zhì)提取試劑(Thermo)獲得核蛋白。將蛋白施加到4%_12%的NuPAGE凝膠(Invitrogen)上并進(jìn)行分離,然后轉(zhuǎn)移至Immobilon?-P膜(Millipore)。將膜用5%脫脂奶粉和0.l%Tween-20阻斷I小時(shí)，接著與一抗(1: 200~1:1000稀釋液)一同在4°C溫育過(guò)夜。使用辣根過(guò)氧化物酶綴合的IgG (Santa Cruz Biosciences; 1:10, 000)處理膜 I 小時(shí)，并用 SupcrSignali? West Pico Chemiluminescent Substrate (Thermo)增強(qiáng)。在BIOMAX MR膜(Kodak, Rochester, NY)上檢測(cè)條帶。每個(gè)膜也用剝離緩沖液(Thermo)進(jìn)行剝離，并用抗β_肌動(dòng)蛋白抗體再檢測(cè)以便對(duì)加載的蛋白量進(jìn)行定量。
[0080]細(xì)胞凋亡和細(xì)胞存活測(cè)試:將0.5 X IO6BMMSC接種至6孔培養(yǎng)板，并與不同劑量的重組的 IL-4、IL-6、IL-17A、TGF-β 1、TNF-α 和 IFN-y (O、10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml)共同培養(yǎng)3天。為了測(cè)定細(xì)胞活力，使用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒8 (DojindoMolecular Technologies, Gaithersburg, MD)根據(jù)制造商說(shuō)明分析總的細(xì)胞。并將帶有細(xì)胞的培養(yǎng)板用2%甲苯胺藍(lán)O和2%多聚甲醒(Sigma-Aldrich Corporate, St.Louis, MO)進(jìn)行染色。
[0081]對(duì)于細(xì)胞凋亡分析,用膜聯(lián)蛋白V-PE凋亡檢測(cè)試劑盒I (BD Bioscience)按制造商規(guī)程將BMMSC染色，并通過(guò)FACSealibmr (BD Bioscience)進(jìn)行分析。
[0082]IFN- Y和TNF- α對(duì)于凋亡的協(xié)同作用:對(duì)于細(xì)胞凋亡染色，將I X IO4BMMSC接種至雙室玻片，使用IFN-Y (50ng/ml)和TNF-α (20ng/ml)分別地或聯(lián)合地處理BMMSC24小時(shí)，使用膜聯(lián)蛋白V-PE凋亡檢測(cè)試劑盒I (BD Bioscience)按制造商規(guī)程對(duì)BMMSC進(jìn)行染色，并在顯微鏡和FACSealibur (BD Bioscience)下進(jìn)行分析。利用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒分析細(xì)胞活力，并用2%甲苯胺藍(lán)O和2%多聚甲醛將培養(yǎng)板染色。
[0083]siRNA和抑制劑:將0.5 X IO6BMMSC接種至6孔培養(yǎng)板。使用用于Fas、TNFR2、IKK、FLIP和XIAP的siRNA根據(jù)制造商說(shuō)明來(lái)處理BMMSC，并添加IFN- Y和TNF- α 24小時(shí)。使用內(nèi)化用抑制劑(拉春庫(kù)林Α，0.2μ Μ)、泛半胱天冬酶抑制劑(Z-VAD (OMe) -FMK, 50 μ Μ)、半胱天冬酶8抑制劑(2-1ETD-FMK，20 μ Μ)和半胱天冬酶3抑制劑(Z-DEVD-FMK，20 μ Μ)處理BMMSC4小時(shí)，其后添加IFN- Y和TNF- α。通過(guò)免疫熒光染色和FACSealibur (膜聯(lián)蛋白V-PE凋亡檢測(cè)試劑盒I)以及蛋白印跡分析針對(duì)半胱天冬酶8、切割的半胱天冬酶8、半胱天冬酶3和切割的半胱天冬酶3對(duì)細(xì)胞凋亡進(jìn)行分析。
[0084]細(xì)胞存活測(cè)試:將分離自C57BL/6-Tg(CAG-EGFP) 10sb/J小鼠的4X IO6BMMSC與不同濃度的 IFN- y (0、20ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml)和 TNF- a (0、20ng/ml、50ng/ml、IOOng/ml、200ng/ml)組合,經(jīng)皮下植入免疫受損小鼠，使用用水凝膠作為緩釋載體。移植30天后，收獲植入物并在3mg/mL I型膠原酶(Worthington Biochem)和4mg/mL分散酶(Roche)的溶液中在37°C消化I小時(shí)。通過(guò)使細(xì)胞通過(guò)70 μ m過(guò)濾器(BD Bioscience)而獲得單細(xì)胞懸浮液。將1.0X IO6~1.5 X IO6BMMSC接種至100_培養(yǎng)皿(Corning)，并在37°C在5%C02條件下溫育48小時(shí)。為了消除非粘附性細(xì)胞，將培養(yǎng)物用PBS洗滌2次。將粘附的細(xì)胞與α最低必需培養(yǎng)基(α-MEM，Invitrogen) —同培養(yǎng)10天，該培養(yǎng)基補(bǔ)充有20%FBS、2mM L-谷氨酸胺(Invitrogen)、55 μ M2-疏基乙醇(Invitrogen)、100U/ml 青霉素和100 μ g/ml鏈霉素(Invitrogen)。在熒光顯微鏡下對(duì)GFP陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)目進(jìn)行計(jì)數(shù)。
[0085]T淋巴細(xì)胞分離:利用磁性分選器、小鼠泛T細(xì)胞分離試劑盒II和⑶4+⑶25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞分離試劑盒(Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach,德國(guó))根據(jù)制造商說(shuō)明從小鼠總脾細(xì)胞中分離出泛T、⑶4+、⑶4+⑶25-T淋巴細(xì)胞。泛T、⑶4+、⑶4+⑶25_的純度為>95%。
[0086]CD4+CD25+Foxp3+Treg 誘導(dǎo):為了在體外誘導(dǎo) CD4+CD25+Foxp3+Treg，通過(guò) CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞分離試劑盒(Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach,德國(guó))收集了⑶4+CD25-T淋巴細(xì)胞(I X IO6/孔)，并將I X IO6/孔的⑶4+⑶25-T淋巴細(xì)胞在板結(jié)合的抗CD3 ε 抗體(5 μ g/ml)、可溶性抗 CD28 抗體(2 μ g/ml)、重組小鼠 TGF- β I (2 μ g/ml) (R&DSystems)和重組小鼠IL2(2y g/ml) (R&D Systems)在12孔多孔板中培養(yǎng)3天。所有板孔均填充有含Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基(DMEM, Lonza, Walkersville, MD),該培養(yǎng)基具有 10% 熱失活 FBS、50y M2-巰基乙醇、IOmM HEPES (Sigma)、ImM 丙酮酸鈉(Sigma)、1%非必需氨基酸(Cambrex, Charles City, IA) >2mM L-谷氨酰胺、100U/ml 青霉素和 IOOmg/ml鏈霉素。然后，利用磁性分選器和小鼠⑶4+⑶25_調(diào)節(jié)性T細(xì)胞分離試劑盒(MiltenyiBiotec, Bergisch Gladbach,德國(guó))遵循制造商說(shuō)明分離出Q)4+Q)25-T淋巴細(xì)胞。⑶4+CD25+FOXp3+T淋巴細(xì)胞的純度>95%，且其被用于全身性輸注。
[0087]Fas內(nèi)化:將P1BMMSC接種至雙室玻片。添加IFN- y (50ng/ml)以便將BMMSC預(yù)處理24小時(shí)，然后添加TNF-α (20ng/ml)。在添加TNF-α后的0.5小時(shí)、I小時(shí)、2小時(shí)、4小時(shí)，將細(xì)胞用PBS洗滌兩次，并用4%PFA固定15分鐘。在用Triton-X處理15分鐘后，用與二抗匹配的正常血清將細(xì)胞阻斷，與I μ g/ml抗Fas (Santa Cruz)在室溫溫育2小時(shí),并用若丹明綴合的二抗(1:200, Jackson ImmunoResearch)處理。然后將細(xì)胞與β-肌動(dòng)蛋白(1:40; Invitrogen)在室溫溫育20分鐘,并通過(guò)Vectashield封固培養(yǎng)基DAPI (VectorLaboratories)將其封固。
[0088]C57BL/6J小鼠的頭蓋骨缺陷模型:切開(kāi)C57BL/6J小鼠的皮膚并將骨膜拉起。使小鼠頭蓋骨的表面暴露，并建立7_X8_的大尺寸缺陷。該骨缺陷大于通常的直徑為4_的臨界尺寸。
[0089]BMMSC在C57BL/6J小鼠的頭蓋骨缺陷中的植入:將4X IO6BMMSC接種至尺寸為7mmX8mm的凝膠泡沫(Pharmaca, Boulder, CO)并在體外培養(yǎng)3天。將帶有BMMSC的凝膠泡沫置于頭蓋骨缺陷處，并以皮膚完全覆蓋`。對(duì)于阿司匹林處理組，將接種至凝膠泡沫的BMMSC用50 μ g/ml阿司匹林預(yù)處理3天，然后置于頭蓋骨缺陷處。將作為釋放體系的具有100 μ g阿司匹林的另一凝膠泡沫覆蓋在具有BMMSC的凝膠泡沫的表面上(圖14)。
[0090]統(tǒng)計(jì)學(xué):使用SPSS13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。通過(guò)獨(dú)立的雙尾學(xué)生t檢驗(yàn)或者變量分析來(lái)評(píng)估顯著性(ANOVA)。P值小于0.05則認(rèn)為顯著。[0091]小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMMSC)的分離:用2%的熱失活胎牛血清(FBS;Equitech-Bio, Kerrvilie, TX)的PBS溶液將骨髓細(xì)胞從股骨和脛骨的骨腔中閃沖出來(lái)。通過(guò)流經(jīng)70 μ m細(xì)胞過(guò)濾器(BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ)獲得總核細(xì)胞(ANC)的單細(xì)胞懸浮液。分選出⑶146陽(yáng)性ANC，并以I X IO4接種至IOOmm培養(yǎng)皿(CorningCorporation, Corning, NY),并在37°C和5%C02條件下初始溫育48小時(shí)。為了消除非粘附性細(xì)胞，在第2天將培養(yǎng)物用PBS洗滌兩次。將附著的細(xì)胞培養(yǎng)16天。將BMMSC用α最低必需培養(yǎng)基(a-MEM, Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA)培養(yǎng)，該培養(yǎng)基補(bǔ)充有20%FBS、2mM L-谷氨酸胺(Invitrogen Corporation)、55 μ M2-疏基乙醇(InvitrogenCorporation) > 100U/ml 青霉素和 100 μ g/ml 鏈霉素(Invitrogen Corporation)。
[0092]BMMSC介導(dǎo)的骨形成:將約4.0X IO6源自同窩仔畜或自體同源的BMMSC與作為載體的輕磷灰石/磷酸三鈣(HA/TCP)陶瓷顆粒(40mg, Zimmer Inc., Warsaw, IN)混合,并經(jīng)皮下植入8周至10周齡的免疫受損小鼠或C57BL小鼠的背部表面。當(dāng)使用阿司匹林時(shí)，將BMMSC用50 μ g/ml阿司匹林處理2天并與HA/TCP顆粒混合以便經(jīng)皮下植入免疫受損小鼠。當(dāng)在皮下植入物中使用IFN- Y和TNF- α?xí)r，將200ngIFN_ y、TNF- α或/和100 μ g阿司匹林與作為緩釋體系的250 μ I水凝膠混合并經(jīng)皮下共同植入8周至10周齡的免疫受損小鼠的背部表面。
[0093]在植入后8周，收獲植入物，用4%多聚甲醛固定，然后用59ffiDTA(pH7.4)脫鈣，隨后進(jìn)行石蠟包埋。將6μπι石蠟切片用蘇木精或曙紅(Η&Ε)染色，并通過(guò)NIH圖像J進(jìn)行分析。選擇5個(gè)視野，并計(jì)算每個(gè)視野中的新形成的礦化組織，以占總組織面積的百分比顯
/Jn ο
[0094]泛T細(xì)胞分離和 輸注:利用磁性分選器、小鼠泛T細(xì)胞分離試劑盒II從小鼠總脾細(xì)胞中分離出泛T淋巴細(xì)胞。將約1.0X IO6個(gè)細(xì)胞懸浮在200 μ I PBS中并經(jīng)尾靜脈注入小鼠。
[0095]蛋白印跡分析:利用M-PER哺乳動(dòng)物蛋白提取試劑(Thermo, Rockford, IL)提取總蛋白。利用NE-PER核與細(xì)胞質(zhì)提取試劑(Thermo)獲得核蛋白。將蛋白施加到4%_12%的NuPAGE凝膠(Invitrogen)上并進(jìn)行分離,然后轉(zhuǎn)移至Immobilon?-P膜(Millipore)。將膜用5%脫脂奶粉和0.l%Tween-20阻斷I小時(shí)，接著與一抗(1: 200~1:1000稀釋液)一同在4°C溫育過(guò)夜。使用辣根過(guò)氧化物酶綴合的IgG (Santa Cruz Biosciences; 1:10, 000)處理膜 I 小時(shí)，并用 SupcrSignal.? West Pico Chemiluminescent Substrate (Thermo)增強(qiáng)。在BIOMAX MR膜(Kodak, Rochester, NY)上檢測(cè)條帶。每個(gè)膜也用剝離緩沖液(Thermo)進(jìn)行剝離，并用抗β_肌動(dòng)蛋白抗體再檢測(cè)以便對(duì)加載的蛋白量進(jìn)行定量。
[0096]IFN- Y和TNF- α對(duì)于凋亡的協(xié)同作用:將0.5 X IO6BMMSC接種至6孔培養(yǎng)板，并與不同劑量的 TNF-α (0、5ng/ml、50ng/ml、100ng/ml)在存在 IFN-Y (50ng/ml)或不存在IFN- Y的情況下共溫育I天。然后，用膜聯(lián)蛋白V-PE凋亡檢測(cè)試劑盒I (BDBioscience)按制造商規(guī)程對(duì)BMMSC進(jìn)行染色,并通過(guò)FACSeallbmr (BD Bioscience)進(jìn)行分析。
[0097]免疫化學(xué)顯微分析:收獲移植物，在4%多聚甲醛中固定，然后用5%乙二胺四乙酸(EDTA，pH7.4)脫鈣，接著用石蠟或最佳切割溫度化合物(OCT，Sakura FineteckInc., Torrance, CA)進(jìn)行包埋。將石臘或冷凍切片用與二抗匹配的正常血清阻斷，與特異性或同種型匹配的小鼠抗體(1:200)在4°C過(guò)夜溫育。利用Zymed SuperPicture?試劑盒(Invitrogen Corporation)根據(jù)制造商說(shuō)明對(duì)樣品進(jìn)行染色。
[0098]雖然上文已就【具體實(shí)施方式】和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了說(shuō)明，但應(yīng)該理解，本文所公開(kāi)的實(shí)施方式僅出于說(shuō)明性目的，本領(lǐng)域技術(shù)人員在不脫離所附權(quán)利要求所述的本發(fā)明的主旨和范圍的情況下可以進(jìn)行各種改動(dòng)和變化。
[0099參考文獻(xiàn)
[0100]本文得到本文引用或下文所列的每一篇參考文獻(xiàn)的全部公開(kāi)內(nèi)容的支持并通過(guò)援引將其并入。
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【權(quán)利要求】
1.一種組織工程化用復(fù)合組合物或組織再生裝置，其包含: 至少一種骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；和 有效量的促炎性細(xì)胞因子減少劑。
2.如權(quán)利要求1所述的組合物或裝置，其中，所述促炎性細(xì)胞因子是TNF-α和/或IFN- Y ο
3.如權(quán)利要求1所述的組合物或裝置，其中，所述促炎性細(xì)胞因子減少劑是阿司匹林。
4.如權(quán)利要求3所述的組合物或裝置，其中，所述量為約50pg/ml以上。
5.如權(quán)利要求1所述的組合物或裝置，其還包含基質(zhì)。
6.如權(quán)利要求5所述的組合物或裝置，其中，所述基質(zhì)為水不溶性、非彈性、多孔、易彎折的材料，該材料能夠吸收或吸附所述BMMSC和所述細(xì)胞因子減少劑。
7.如權(quán)利要求6所述的組合物或裝置，其中，所述基質(zhì)是海綿。
8.一種BMMSC介導(dǎo)的組織工程化方法，其包括: 將權(quán)利要求1所述的復(fù)合組合物或裝置應(yīng)用于需要新組織的位點(diǎn)。
9.一種促進(jìn)局部化組織再生的方法，其包括: 將組織工程化復(fù)合組合物應(yīng)用于需要組織再生的位點(diǎn)， 其中所述組織工程化復(fù)合組合物包含一種或多種抗炎劑，從而為種子骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生長(zhǎng)提供長(zhǎng)期的抗炎性環(huán)境。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其中，所述抗炎劑是選自由TNF-α和/或IFN- Y組成的組的細(xì)胞因子的抑制劑或中和劑。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其中，所述抗炎劑是阿司匹林。
12.如權(quán)利要求9所述的方法，其還包括以下步驟:在將所述復(fù)合物應(yīng)用至所述位點(diǎn)之前，用所述抗炎劑對(duì)多個(gè)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理。
13.一種形成組織工程化復(fù)合組合物或組織再生裝置的方法，其包括: 向基質(zhì)或載體添加預(yù)定量的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和抗炎劑。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，其中，所述抗炎劑是TNF-α和/或IFN-Y的抑制劑。
15.如權(quán)利要求14所述的方法，其中，所述抗炎劑是阿司匹林。
16.一種促進(jìn)受試對(duì)象的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMMSC)植入位點(diǎn)處的組織再生的方法，其包括: 對(duì)所述受試對(duì)象全身性施用Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞；和 對(duì)所述位點(diǎn)應(yīng)用BMMSC介導(dǎo)的組織再生誘導(dǎo)物。
17.如權(quán)利要求16所述的方法，其中，所述BMMSC介導(dǎo)的組織再生誘導(dǎo)物包含一種或多種 MMSC。
18.如權(quán)利要求17所述的方法，其中，所述組織再生誘導(dǎo)物還包含抗炎劑。
19.如權(quán)利要求18所述的方法，其中，所述抗炎劑是阿司匹林。
20. 一種用于增強(qiáng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMMSC)介導(dǎo)的組織再生的藥物組合物，其包括: 有效量的一種或多種抗炎劑；和 藥學(xué)上可接受的載體。
21.如權(quán)利要求20所述的藥物組合物，其中，所述抗炎劑選自由阿司匹林、Treg及其組合組成的組。
22.如權(quán)利要求20所述的藥物組合物，所述藥物組合物包含阿司匹林和Treg兩者作為所述 抗炎劑。
【文檔編號(hào)】A01N63/00GK103619177SQ201280029953
【公開(kāi)日】2014年3月5日 申請(qǐng)日期:2012年4月25日 優(yōu)先權(quán)日:2011年4月25日
【發(fā)明者】施松濤, 劉怡, 王磊 申請(qǐng)人:南加州大學(xué)