專利名稱：杏鮑菇菌株kqh-1及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及杏鮑菇菌株KQH-1及制備方法。
背景技術(shù)：
杏鮑菇/7Zetfrote1S erpgii是近年來開發(fā)栽培成功的集食用、藥用、食療于一體的珍稀食用菌新品種。菇體具有杏仁香味，肉質(zhì)肥厚，口感鮮嫩，味道清香，營養(yǎng)豐富，能烹飪出幾十道美味佳肴。還具有降血脂、降膽固醇、促進(jìn)胃腸消化、增強(qiáng)機(jī)體免疫能力、防止心血管病等功效，極受人們喜愛
在杏鮑菇栽培技術(shù)中，優(yōu)良菌種的獲得是關(guān)鍵技術(shù)環(huán)節(jié)。杏鮑菇菌株的獲得通常是利用子實(shí)體或孢子進(jìn)行分離、純化，直接應(yīng)用于杏鮑菇的栽培或菌絲體生產(chǎn)?，F(xiàn)有技術(shù)的不足 在于其生物學(xué)特性目前仍處于試驗(yàn)研究階段，生物轉(zhuǎn)化率一般為60%_80%，而且還要用熟料栽培，生產(chǎn)工藝及技術(shù)要素要求較高，因而制約了杏鮑菇商品經(jīng)濟(jì)的發(fā)展。另外只能根據(jù)菌絲形態(tài)及分離物來初步確定是否為杏鮑菇純培養(yǎng)物；生產(chǎn)的菌種一般用固體菌種。目前在國內(nèi)采用液體菌種進(jìn)行杏鮑菇資源的保護(hù)應(yīng)用不廣泛。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的主要目的就是克服現(xiàn)有技術(shù)不足，利用云南原產(chǎn)地杏鮑菇子實(shí)體篩選出優(yōu)良菌株，采用生物技術(shù)進(jìn)行菌種鑒定，制備杏鮑菇液體及固體優(yōu)良菌種，為杏鮑菇資源保護(hù)提供優(yōu)良菌種
本發(fā)明采用的真菌是杏鮑燕/7Zetfroiw1S eryngii KQH-1 ;保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心；地址中國北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學(xué)院微生物研究所；保藏日期=2012年10月11日；保藏登記入冊的編號(hào)CGMCC No. 6701
杏鮑菇的子實(shí)體單生或群生，菌蓋寬2 - 12cm，初呈拱圓形，后逐漸平展，成熟時(shí)中央淺凹至漏斗形，表面有絲狀光澤，平滑、干燥、細(xì)纖維狀，幼時(shí)蓋緣內(nèi)卷，成熟后呈波浪狀或深裂；菌肉白色，具有杏仁味，無乳汁分泌；菌褶延生，密集，略寬，乳白色，邊緣及兩側(cè)平，有小菌褶；菌柄2 — 8cm至O. 5 — 3cm，偏心生或側(cè)生。杏鮑菇屬于中低溫結(jié)實(shí)性菌類本發(fā)明的技術(shù)方案
①采集野生杏鮑菇子實(shí)體；
②組織分離或孢子分離；
③純化菌株及菌株鑒定；
④生物學(xué)特性比較及生產(chǎn)性狀比較；
⑤確定優(yōu)良菌株；
⑥菌種生產(chǎn)及菌種應(yīng)用；
經(jīng)過反復(fù)篩選，獲得菌絲體產(chǎn)量高、抗污染的杏鮑菇液體菌種專用菌株KQH-1 本發(fā)明真菌/7Zetfrote1S eryngii培養(yǎng)方法(以下為重量百分比)
菌種分離純化培養(yǎng)基2%杏鮑菇下腳料、O. 001%VB1、2%葡萄糖、2%瓊脂；杏鮑菇菌株分離及鑒定方法
1、將杏鮑菇子實(shí)體組織塊或孢子液接種到上述試管瓊脂培養(yǎng)基斜面上，于18-24°c下培養(yǎng)5-10天，對分離培養(yǎng)的試管每天觀察記錄，及時(shí)剔除已污染的試管，挑選出無污染、長勢良好的菌株，獲得杏鮑菇分離試管種
2、將分離試管種菌絲塊接種到上述瓊脂培養(yǎng)基的平板培養(yǎng)皿上進(jìn)行菌種純化，2天后取尖端菌絲塊接種在培養(yǎng)基斜面上，于18-24°C下培養(yǎng)5-7天，獲得杏鮑菇純化試管種
3、采用供試子實(shí)體與對應(yīng)菌絲分離物，分別按SDS方法提取總DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增及ITS序列測定，通過Blast對比樣品的ITS序列與GENBANK中的杏鮑菇ipieurotuseryngii) Identities=510/536 (95%), Gaps=9/536 (I%),分析確定分離得到的純培養(yǎng)物為杏鮑菇菌絲體
本發(fā)明杏鮑燕菌種的制備方法分為液體培養(yǎng)和固體培養(yǎng)兩種
液體菌種制備方法
液體培養(yǎng)基配方為5-10%麩皮、O. 5-1%黃豆粉、O. 5-1%麥芽糖、1-3%玉米粉，余下為水，pH自然
1、將杏鮑菇的菌絲體接種到試管瓊脂培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)基配方為PDA培養(yǎng)基，于18-24°C下培養(yǎng)5-7天，獲得試管菌種
2、將試管種接種到500ml三角瓶(每瓶裝200ml)液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基配方為前述液體培養(yǎng)基配方，于20-26°C下?lián)u床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為120-160r/min，培養(yǎng)時(shí)間5_7天
3、將搖瓶菌種接種到25L自動(dòng)發(fā)酵生產(chǎn)線的發(fā)酵罐中，通氣量為1:0. 8ν/(ν ·π η);攪拌轉(zhuǎn)速為120-160r/min ;接種量為5-10% ;罐壓0. 04Mpa ； pH為6. O ;溫度為20-26°C ;通氣培養(yǎng)72-96小時(shí)，獲得杏鮑菇液體菌種
固體菌種制備方法
固體培養(yǎng)基配方為木屑75-90%、麩皮5-20%、磷肥1%、石膏1%、杏鮑菇生長地腐殖土3%，含水量60%、pH自然
1、將杏鮑菇的菌絲體接種到試管瓊脂培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)基配方為PDA培養(yǎng)基，于18-24°C下培養(yǎng)5-7天，獲得試管菌種
2、將試管種接種到500ml三角瓶(每瓶裝200ml)液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基配方為前述液體培養(yǎng)基配方，于20-26°C下?lián)u床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為120-160 r/min，培養(yǎng)時(shí)間5_7天
2、采用前述固體培養(yǎng)基配方。將培養(yǎng)料混合后，加水拌均勻后，裝入750ml的大口瓶中，壓緊封口后在120°C滅菌60分鐘，接入液體菌種，于20-26°C培養(yǎng)15-20天，直到菌絲長滿
具體實(shí)施例方式 實(shí)施例一
1、將杏鮑菇子實(shí)體組織塊接種到上述菌種分離純化培養(yǎng)基斜面上，于18°C下培養(yǎng)10天，對分離培養(yǎng)的試管每天觀察記錄，及時(shí)剔除已污染的試管，挑選出無污染、長勢良好的菌株，獲得杏鮑菇分離試管種
2、將分離試管種菌絲塊接種到上述瓊脂培養(yǎng)基的平板培養(yǎng)皿上進(jìn)行菌種純化，2天后取尖端菌絲塊接種在培養(yǎng)基斜面上，于18°C下培養(yǎng)7天，獲得杏鮑菇純化試管種
3、采用供試子實(shí)體與對應(yīng)菌絲分離物，分別按SDS方法提取總DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增及ITS序列測定，通過Blast對比樣品的ITS序列與GENBANK中的杏鮑菇{PI euro tuseryngii) Identities=531/535 (99%)，Gaps=2/535 (0%)，分析確定分離得到的純培養(yǎng)物為杏鮑菇菌絲體
\、、塔Pleurotus eryngii KQH-1的菌絲體接種到試管瓊脂培養(yǎng)基斜面上,培養(yǎng)基配方為PDA培養(yǎng)基，18°C下培養(yǎng)7天，獲得試管種
5、將試管種接種到500ml三角瓶中(每瓶裝200ml)液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基配方為5%麩皮、O. 5%黃豆粉、O. 5%麥芽糖、1%玉米粉，余下為水，pH自然。于20°C下?lián)u床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為120rpm,培養(yǎng)時(shí)間7天，獲得一級(jí)液體菌種
將一級(jí)液體菌種接種到25L自動(dòng)發(fā)酵生產(chǎn)線的發(fā)酵罐中，通氣量為1:0. 8v/(v *min)；攪拌轉(zhuǎn)速為120r/min ;接種量為5% ;罐壓0. 04Mpa ； pH為6. O ;溫度為22°C ;通氣培養(yǎng)96小時(shí)，獲得杏鮑菇液體菌種
實(shí)施例二
菌種制備的步驟與實(shí)施例一相同
1、將杏鮑菇子實(shí)體組織塊接種到上述菌種分離純化培養(yǎng)基斜面上，于22°C下培養(yǎng)6天，對分離培養(yǎng)的試管每天觀察記錄，及時(shí)剔除已污染的試管，挑選出無污染、長勢良好的菌株，獲得杏鮑菇分離試管種
2、將分離試管種菌絲塊接種到上述瓊脂培養(yǎng)基的平板培養(yǎng)皿上進(jìn)行菌種純化，2天后取尖端菌絲塊接種在培養(yǎng)基斜面上，于22°C下培養(yǎng)6天，獲得杏鮑菇純化試管種
3、采用供試子實(shí)體與對應(yīng)菌絲分離物，分別按SDS方法提取總DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增及ITS序列測定，通過Blast對比樣品的ITS序列與GENBANK中的杏鮑菇(PI euro tuseryngii) Identities=531/535 (99%)，Gaps=2/535 (0%)，分析確定分離得到的純培養(yǎng)物為杏鮑菇菌絲體
\、、塔Pleurotus eryngii KQH-1的菌絲體接種到試管瓊脂培養(yǎng)基斜面上,培養(yǎng)基配方為PDA培養(yǎng)基，22°C下培養(yǎng)6天，獲得試管種
5、將試管種接種到500ml三角瓶中(每瓶裝200ml)液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基配方為6%麩皮、O. 6%黃豆粉、O. 6%麥芽糖、1. 2%玉米粉，余下為水，pH自然。于22°C下?lián)u床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為140rpm，培養(yǎng)時(shí)間6天，獲得一級(jí)液體菌種
將一級(jí)液體菌種接種到25L自動(dòng)發(fā)酵生產(chǎn)線的發(fā)酵罐中，通氣量為1:0. 8v/(v *min)；攪拌轉(zhuǎn)速為140r/min ;接種量為8% ;罐壓0. 04Mpa ； pH為6. O ;溫度為24°C ;通氣培養(yǎng)84小時(shí)，獲得杏鮑菇液體菌種
實(shí)施例三
1、將杏鮑菇子實(shí)體組織塊接種到上述菌種分離純化培養(yǎng)基斜面上，于24°C下培養(yǎng)5天，對分離培養(yǎng)的試管每天觀察記錄，及時(shí)剔除已污染的試管，挑選出無污染、長勢良好的菌株，獲得杏鮑菇分離試管種
2、將分離試管種菌絲塊接種到上述瓊脂培養(yǎng)基的平板培養(yǎng)皿上進(jìn)行菌種純化，2天后取尖端菌絲塊接種在培養(yǎng)基斜面上，于24°C下培養(yǎng)5天，獲得杏鮑菇純化試管種
3、采用供試子實(shí)體與對應(yīng)菌絲分離物，分別按SDS方法提取總DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增及ITS序列測定，通過Blast對比樣品的ITS序列與GENBANK中的杏鮑菇(PI euro tuseryngii) Identities=531/535 (99%)，Gaps=2/535 (0%)，分析確定分離得到的純培養(yǎng)物為杏鮑菇菌絲體
\、、塔Pleurotus eryngii KQH-1的菌絲體接種到試管瓊脂培養(yǎng)基斜面上,培養(yǎng)基配方為PDA培養(yǎng)基，24°C下培養(yǎng)5天，獲得試管種
5、將試管種接種到500ml三角瓶中(每瓶裝200ml)液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基配方為10%麩皮、O. 5%黃豆粉、O. 5%麥芽糖、1%玉米粉，余下為水，pH自然。于26°C下?lián)u床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為160rpm，培養(yǎng)時(shí)間5天，獲得一級(jí)液體菌種
將一級(jí)液體菌種接種到固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基配方為木屑75%、麩皮20%、磷肥1%、石膏1%、杏鮑菇生長地腐殖土 3%，含水量60%、pH自然。將木屑、麩皮、磷肥、石膏、腐殖土按比例稱量后混合均勻，加水拌勻后裝入750ml的菌種瓶中，每瓶裝500ml，120°C滅菌60分鐘后，接種后置于26°C培養(yǎng)15天，獲得杏鮑菇固體菌種實(shí)施例四 1、將杏鮑菇子實(shí)體組織塊接種到上述菌種分離純化培養(yǎng)基斜面上，于24°C下培養(yǎng)5天，對分離培養(yǎng)的試管每天觀察記錄，及時(shí)剔除已污染的試管，挑選出無污染、長勢良好的菌株，獲得杏鮑菇分離試管種
2、將分離試管種菌絲塊接種到上述瓊脂培養(yǎng)基的平板培養(yǎng)皿上進(jìn)行菌種純化，2天后取尖端菌絲塊接種在培養(yǎng)基斜面上，于24°C下培養(yǎng)5天，獲得杏鮑菇純化試管種
3、采用供試子實(shí)體與對應(yīng)菌絲分離物，分別按SDS方法提取總DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增及ITS序列測定，通過Blast對比樣品的ITS序列與GENBANK中的杏鮑菇iPleuro tuseryngii) Identities=531/535 (99%)，Gaps=2/535 (0%)，分析確定分離得到的純培養(yǎng)物為杏鮑菇菌絲體
\、、塔Pleurotus eryngii KQH-1的菌絲體接種到試管瓊脂培養(yǎng)基斜面上,培養(yǎng)基配方為PDA培養(yǎng)基，24°C下培養(yǎng)5天，獲得試管種
5、將試管種接種到500ml三角瓶中(每瓶裝200ml)液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基配方為8%麩皮、O. 5%黃豆粉、1%麥芽糖、1%玉米粉，余下為水，pH自然。于26 °C下?lián)u床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為160rpm,培養(yǎng)時(shí)間5天,獲得一級(jí)液體菌種
將一級(jí)液體菌種接種到固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基配方為木屑90%、麩皮5%、磷肥1%、石膏1%、杏鮑菇生長地腐殖土 3%，含水量60%、pH自然。將木屑、麩皮、磷肥、石膏、腐殖土按比例稱量后混合均勻，加水拌勻后裝入750ml的菌種瓶中，每瓶裝500ml，120°C滅菌60分鐘后，接種后置于20°C培養(yǎng)20天，獲得杏鮑菇固體菌種。
權(quán)利要求
1.一種杏鮑燕菌株，其特征在于所述菌株為0°/ Γο 5· eryngii) KQH-1,該菌株的保藏號(hào)為 CGMCC NO. 6701。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的杏鮑菇菌株的制備方法，所述菌株是經(jīng)過常規(guī)的液體和固體發(fā)酵培養(yǎng)獲得的，其特征在于所述液體和固體發(fā)酵培養(yǎng)基配方如下 液體培養(yǎng)基配方為5-10%麩皮、O. 5-1%黃豆粉、O. 5-1%麥芽糖、1-3%玉米粉，余下為水，pH自然; 固體培養(yǎng)基配方為木屑75-90%、麩皮5-20%、磷肥1%、石膏1%、羊肚菌生長地腐殖土3%，含水量60%、pH自然。
全文摘要
本發(fā)明涉及杏鮑菇菌株的篩選及制備方法，屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的菌株P(guān)leurotuseryngiiKQH-1已于2012年10月11日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCCNo.6701。利用該菌株制備的液體及固體優(yōu)良菌種，應(yīng)用于杏鮑菇的促繁有著顯著的社會(huì)、經(jīng)濟(jì)效益和廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)A01H15/00GK102986539SQ201210503870
公開日2013年3月27日 申請日期2012年12月2日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月2日
發(fā)明者郭永紅, 張微思, 羅孝坤, 羅曉莉, 張利菁 申請人:中華全國供銷合作總社昆明食用菌研究所, 云南省供銷合作社科學(xué)研究所, 昆明菌苑食品有限公司