專利名稱：一種雞腿菇菌株及制備方法
技術領域：
本發(fā)明屬微生物技術領域，具體涉及雞腿菇菌株KMSX-978及制備方法。
背景技術：
雞腿COffiaiw1S營養(yǎng)豐富、味道鮮美，口感極好,經常食用有助于增進食欲、消化、增強人體免疫力，具有很高的營養(yǎng)價值。雞腿蘑還是一種藥用蕈菌，味甘性平，有益脾胃、清心安神、治痔等功效，經常食用有助消化、增進食欲和治療痔瘡的作用。20世紀70年代西方國家已開始人工栽培，中國于80年代人工栽培成功。由于雞腿菇袋生長周期短，生物轉化率較高，易于栽培，特別適合中國農村種植。近年來種植規(guī)模迅猛擴大，已成為傘菌目中國大宗栽培的食用菌之一
在雞腿菇栽培技術中，優(yōu)良菌種的獲得是關鍵技術環(huán)節(jié)。雞腿菇菌株的獲得通常是利用子實體或孢子進行分離、純化，直接應用于雞腿菇的栽培或菌絲體生產?，F有技術的不足 在于其生物學特性目前仍處于試驗研究階段，生物轉化率較低，而且還要用熟料栽培，生產工藝及技術要素要求較高，因而制約了雞腿菇商品經濟的發(fā)展。另外只能根據菌絲形態(tài)及分離物來初步確定是否為雞腿菇純培養(yǎng)物；生產的菌種一般用固體菌種。目前在國內采用液體菌種進行雞腿菇資源的保護應用不廣泛。

發(fā)明內容
本發(fā)明的主要目的就是克服現有技術不足，利用云南原產地雞腿菇子實體篩選出優(yōu)良菌株，采用生物技術進行菌種鑒定，制備雞腿菇液體及固體優(yōu)良菌種，為雞腿菇資源保護提供優(yōu)良菌種
本發(fā)明采用的真菌是雞腿comatus KMSX-978 ;保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；地址中國北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學院微生物研究所；保藏日期=2012年10月11日；保藏登記入冊的編號CGMCC No. 6702
雞腿菇的子實體為中大型，群生，菇蕾期菌蓋圓柱形，后期鐘形。高7 20厘米，菌蓋幼時近光滑，后有平伏的鱗片或表面有裂紋。幼嫩子實體的菌蓋、菌肉、菌褶菌柄均白色，菌柄粗達I 2. 5厘米，上有菌環(huán)。菌蓋由圓柱形向鐘形伸展時菌褶開始變色，由淺褐色直至黑色，子實體也隨之變軟變黑，完全喪失食用價值本發(fā)明的技術方案
①采集野生雞腿菇子實體；
②組織分離或孢子分離；
③純化菌株及菌株鑒定；
④生物學特性比較及生產性狀比較；
⑤確定優(yōu)良菌株；
⑥菌種生產及菌種應用；
經過反復篩選，獲得菌絲體產量高、抗污染的雞腿菇液體菌種專用菌株KMSX-978本發(fā)明真菌Copyinds comatus培養(yǎng)方法(以下為重量百分比):
菌種分離純化培養(yǎng)基2%雞腿菇下腳料、O. 001%VB1、2%葡萄糖、2%瓊脂；
雞腿菇菌株分離及鑒定方法
1、將雞腿菇子實體組織塊或孢子液接種到上述試管瓊脂培養(yǎng)基斜面上，于18-24°C下培養(yǎng)5-10天，對分離培養(yǎng)的試管每天觀察記錄，及時剔除已污染的試管，挑選出無污染、長勢良好的菌株，獲得雞腿燕分尚試管種
2、將分離試管種菌絲塊接種到上述瓊脂培養(yǎng)基的平板培養(yǎng)皿上進行菌種純化，2天后取尖端菌絲塊接種在培養(yǎng)基斜面上，于18-24°C下培養(yǎng)5-7天，獲得雞腿菇純化試管種
3、采用供試子實體與對應菌絲分離物，分別按SDS方法提取總DNA，進行PCR擴增及ITS序列測定,通過Blast對比樣品的ITS序列與GENBANK中的雞腿燕(Copyinds comatus)Identities=539/567 (95%)，Gaps=8/567 (1%)，分析確定分離得到的純培養(yǎng)物為雞腿菇菌絲 體
本發(fā)明雞腿燕菌種的制備方法分為液體培養(yǎng)和固體培養(yǎng)兩種 液體菌種制備方法
液體培養(yǎng)基配方為10 20%麩皮、10 20% 土豆、O. 5 1%蔗糖、10%玉米粉，余下為水，pH
自然
1、將雞腿菇的菌絲體接種到試管瓊脂培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)基配方為PDA培養(yǎng)基，于18-24°C下培養(yǎng)5-7天，獲得試管菌種
2、將試管種接種到500ml三角瓶(每瓶裝200ml)液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基配方為前述液體培養(yǎng)基配方，于20-26°C下搖床培養(yǎng)，轉速為120-160r/min，培養(yǎng)時間5_7天
3、將搖瓶菌種接種到25L自動發(fā)酵生產線的發(fā)酵罐中，通氣量為1:0. 8ν/(ν ·π η);攪拌轉速為120-160r/min ;接種量為5-10% ;罐壓0. 04Mpa ； pH為6. O ;溫度為20-26°C ;通氣培養(yǎng)72-96小時，獲得雞腿菇液體菌種
固體菌種制備方法
固體培養(yǎng)基配方為棉籽殼90%、麩皮9%、碳酸鈣1%、ρΗ自然
1、將雞腿菇的菌絲體接種到試管瓊脂培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)基配方為PDA培養(yǎng)基，于18-24°C下培養(yǎng)5-7天，獲得試管菌種
2、將試管種接種到500ml三角瓶(每瓶裝200ml)液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基配方為前述液體培養(yǎng)基配方，于20-26°C下搖床培養(yǎng)，轉速為120-160 r/min，培養(yǎng)時間5_7天
2、采用前述固體培養(yǎng)基配方。將培養(yǎng)料混合后，加水拌均勻后，裝入750ml的大口瓶中，壓緊封口后在120°C滅菌60分鐘，接入液體菌種，于20-26°C培養(yǎng)15-20天，直到菌絲長滿
具體實施例方式 實施例一
1、將雞腿菇子實體組織塊接種到上述菌種分離純化培養(yǎng)基斜面上，于18°C下培養(yǎng)10天，對分離培養(yǎng)的試管每天觀察記錄，及時剔除已污染的試管，挑選出無污染、長勢良好的菌株，獲得雞腿燕分離試管種
2、將分離試管種菌絲塊接種到上述瓊脂培養(yǎng)基的平板培養(yǎng)皿上進行菌種純化，2天后取菌絲塊接種在培養(yǎng)基斜面上，于18°C下培養(yǎng)7天，獲得雞腿菇純化試管種
3、采用供試子實體與對應菌絲分離物，分別按SDS方法提取總DNA，進行PCR擴增及ITS序列測定,通過Blast對比樣品的ITS序列與GENBANK中的雞腿燕(Copyinds comatus)Identities=560/565 (99%)，Gaps=2/565 (0%)，分析確定分離得到的純培養(yǎng)物為雞腿菇菌絲體
4、將CbAFiflifecomatus KMSX-978的菌絲體接種到試管瓊脂培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)基配方為PDA培養(yǎng)基，18°C下培養(yǎng)7天，獲得試管種
5、將試管種接種到500ml三角瓶中(每瓶裝200ml)液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基配方為10%麩皮、10% 土豆、O. 5%蔗糖、10%玉米粉，余下為水，pH自然。于20°C下搖床培養(yǎng)，轉速為120rpm,培養(yǎng)時間7天，獲得一級液體菌種 將一級液體菌種接種到25L自動發(fā)酵生產線的發(fā)酵罐中，通氣量為1:0. 8v/(v *min)；攪拌轉速為120r/min ;接種量為5% ;罐壓0. 04Mpa ； pH為6. O ;溫度為22°C ;通氣培養(yǎng)96小時，獲得雞腿菇液體菌種
實施例二
菌種制備的步驟與實施例一相同
1、將雞腿菇子實體組織塊接種到上述菌種分離純化培養(yǎng)基斜面上，于22°C下培養(yǎng)6天，對分離培養(yǎng)的試管每天觀察記錄，及時剔除已污染的試管，挑選出無污染、長勢良好的菌株，獲得雞腿燕分離試管種
2、將分離試管種菌絲塊接種到上述瓊脂培養(yǎng)基的平板培養(yǎng)皿上進行菌種純化，2天后取尖端菌絲塊接種在培養(yǎng)基斜面上，于22°C下培養(yǎng)6天，獲得雞腿菇純化試管種
3、采用供試子實體與對應菌絲分離物，分別按SDS方法提取總DNA，進行PCR擴增及ITS序列測定,通過Blast對比樣品的ITS序列與GENBANK中的雞腿燕(Copyinds comatus)Identities=560/565 (99%)，Gaps=2/565 (0%)，分析確定分離得到的純培養(yǎng)物為雞腿菇菌絲體
4、將CbAFiflifecomatus KMSX-978的菌絲體接種到試管瓊脂培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)基配方為PDA培養(yǎng)基，22°C下培養(yǎng)6天，獲得試管種
5、將試管種接種到500ml三角瓶中(每瓶裝200ml)液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基配方為15%麩皮、15% 土豆、O. 6%蔗糖、10%玉米粉，余下為水，pH自然。于22°C下搖床培養(yǎng)，轉速為140rpm,培養(yǎng)時間6天,獲得一級液體菌種
將一級液體菌種接種到25L自動發(fā)酵生產線的發(fā)酵罐中，通氣量為1:0. 8v/(v *min)；攪拌轉速為140r/min ;接種量為8% ;罐壓0. 04Mpa ； pH為6. O ;溫度為24°C ;通氣培養(yǎng)84小時，獲得雞腿菇液體菌種
實施例三
1、將雞腿菇子實體組織塊接種到上述菌種分離純化培養(yǎng)基斜面上，于24°C下培養(yǎng)5天，對分離培養(yǎng)的試管每天觀察記錄，及時剔除已污染的試管，挑選出無污染、長勢良好的菌株，獲得雞腿燕分離試管種
2、將分離試管種菌絲塊接種到上述瓊脂培養(yǎng)基的平板培養(yǎng)皿上進行菌種純化，2天后取尖端菌絲塊接種在培養(yǎng)基斜面上，于24°C下培養(yǎng)5天，獲得雞腿菇純化試管種
3、采用供試子實體與對應菌絲分離物，分別按SDS方法提取總DNA，進行PCR擴增及ITS序列測定,通過Blast對比樣品的ITS序列與GENBANK中的雞腿燕{Copyinds comatus)Identities=560/565 (99%)，Gaps=2/565 (0%)，分析確定分離得到的純培養(yǎng)物為雞腿菇菌絲體
4、將CbAFiflifecomatusmSl-謂的菌絲體接種到試管瓊脂培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)基配方為PDA培養(yǎng)基，24°C下培養(yǎng)5天，獲得試管種
5、將試管種接種到500ml三角瓶中(每瓶裝200ml)液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基配方為20%麩皮、20% 土豆、O. 5%蔗糖、10%玉米粉，余下為水，pH自然。于26°C下搖床培養(yǎng)，轉速為160rpm,培養(yǎng)時間5天,獲得一級液體菌種 將一級液體菌種接種到固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基配方為棉籽殼90%、麩皮9%、碳酸|丐1%、PH自然。將各原料按比例稱量后混合均勻，加水拌勻后裝入750ml的菌種瓶中，每瓶裝500ml，12(TC滅菌60分鐘后，接種后置于26°C培養(yǎng)15天，獲得雞腿菇固體菌種
實施例四
1、將雞腿菇子實體組織塊接種到上述菌種分離純化培養(yǎng)基斜面上，于24°C下培養(yǎng)5天，對分離培養(yǎng)的試管每天觀察記錄，及時剔除已污染的試管，挑選出無污染、長勢良好的菌株，獲得雞腿燕分離試管種
2、將分離試管種菌絲塊接種到上述瓊脂培養(yǎng)基的平板培養(yǎng)皿上進行菌種純化，2天后取菌絲塊接種在培養(yǎng)基斜面上，于24°C下培養(yǎng)5天，獲得雞腿菇純化試管種
3、采用供試子實體與對應菌絲分離物，分別按SDS方法提取總DNA，進行PCR擴增及ITS序列測定,通過Blast對比樣品的ITS序列與GENBANK中的雞腿燕(Copyinds comatus)Identities=560/565 (99%)，Gaps=2/565 (0%))，分析確定分離得到的純培養(yǎng)物為雞腿菇菌絲體
4、將CbAFiflifecomatusmSl-謂的菌絲體接種到試管瓊脂培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)基配方為PDA培養(yǎng)基，24°C下培養(yǎng)5天，獲得試管種
5、將試管種接種到500ml三角瓶中(每瓶裝200ml)液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基配方為18%麩皮、10% 土豆、1%蔗糖、10%玉米粉，余下為水，pH自然。于26°C下搖床培養(yǎng)，轉速為160rpm，培養(yǎng)時間5天，獲得一級液體菌種
將一級液體菌種接種到固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基配方為棉籽殼90%、麩皮9%、碳酸|丐1%、PH自然。將各原料按比例稱量后混合均勻，加水拌勻后裝入750ml的菌種瓶中，每瓶裝500ml, 120°C滅菌60分鐘后，接種后置于20°C培養(yǎng)20天，獲得雞腿菇固體菌種。
權利要求
1.一種雞腿燕菌株，其特征在于所述菌株為(CbAFifltfe comatus) KMSX-978,該菌株的保藏號為 CGMCC NO. 6702。
2.根據權利要求1所述的雞腿菇菌株的制備方法，所述菌株是經過常規(guī)的液體和固體發(fā)酵培養(yǎng)獲得的，其特征在于所述液體和固體發(fā)酵培養(yǎng)基配方如下 液體培養(yǎng)基配方為5-10%麩皮、O. 5-1%黃豆粉、O. 5-1%麥芽糖、1-3%玉米粉，余下為水，pH自然; 固體培養(yǎng)基配方為木屑75-90%、麩皮5-20%、磷肥1%、石膏1%、羊肚菌生長地腐殖土3%，含水量60%、pH自然。
全文摘要
本發(fā)明涉及雞腿菇菌株的篩選及制備方法，屬于微生物技術領域。本發(fā)明的菌株CopyindscomatusKMSX-978已于2012年10月11日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCCNo.6702。利用該菌株制備的液體及固體優(yōu)良菌種，應用于雞腿菇的促繁有著顯著的社會、經濟效益和廣闊的應用前景。
文檔編號A01G1/04GK103004465SQ20121050384
公開日2013年4月3日 申請日期2012年12月2日 優(yōu)先權日2012年12月2日
發(fā)明者張微思, 郭永紅, 羅孝坤, 羅曉莉, 田永生, 何容 申請人:中華全國供銷合作總社昆明食用菌研究所, 云南省供銷合作社科學研究所, 昆明菌苑食品有限公司