專利名稱：一種毛柄金錢菌菌株及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及毛柄金錢菌菌株KML-19及制備方法。
背景技術(shù)：
毛柄金錢菌veIutipes別名又稱毛柄小火燕、構(gòu)菌、樸燕、冬燕、樸郝、凍菌、金菇、智力菇等，屬傘菌目白蘑科金針菇屬。毛柄金錢菌營(yíng)養(yǎng)豐富，清香撲鼻。其菌蓋小巧細(xì)膩，黃褐色或淡黃色或白嫩。不僅味道鮮美，而且營(yíng)養(yǎng)豐富，是拌涼菜和火鍋食品的原料之一
在毛柄金錢菌栽培技術(shù)中，優(yōu)良菌種的獲得是關(guān)鍵技術(shù)環(huán)節(jié)。毛柄金錢菌菌株的獲得通常是利用子實(shí)體或孢子進(jìn)行分離、純化，直接應(yīng)用于毛柄金錢菌的栽培或菌絲體生產(chǎn)?，F(xiàn) 有技術(shù)的不足在于其生物學(xué)特性目前仍處于試驗(yàn)研究階段，生物轉(zhuǎn)化率較低，而且還要用熟料栽培，生產(chǎn)工藝及技術(shù)要素要求較高，因而制約了毛柄金錢菌商品經(jīng)濟(jì)的發(fā)展。另外只能根據(jù)菌絲形態(tài)及分離物來初步確定是否為毛柄金錢菌純培養(yǎng)物；生產(chǎn)的菌種一般用固體菌種。目前在國(guó)內(nèi)采用液體菌種進(jìn)行毛柄金錢菌資源的保護(hù)應(yīng)用不廣泛。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的主要目的就是克服現(xiàn)有技術(shù)不足，利用云南原產(chǎn)地毛柄金錢菌子實(shí)體篩選出優(yōu)良菌株，采用生物技術(shù)進(jìn)行菌種鑒定，制備毛柄金錢菌液體及固體優(yōu)良菌種，為毛柄金錢菌資源保護(hù)提供優(yōu)良菌種
本發(fā)明采用的真菌是毛柄金錢菌Flammulina velutipes KML-19 ;保藏單位中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心；地址中國(guó)北京市朝陽(yáng)區(qū)大屯路，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所；保藏日期2012年10月11日；保藏登記入冊(cè)的編號(hào)CGMCC No. 6704
毛柄金錢菌的子實(shí)體由菌蓋、菌褶、菌柄三部分組成，多數(shù)成束生長(zhǎng)，肉質(zhì)柔軟有彈性。菌蓋呈球形或呈扁半球形，直徑1. 5 7厘米，幼時(shí)球形，逐漸平展，過分成熟時(shí)邊緣皺折向上翻卷。菌蓋表面有膠質(zhì)薄層，濕時(shí)有粘性，色黃白到黃褐，菌肉白色，中央厚，邊緣薄，菌褶白色或象牙色，較稀疏，長(zhǎng)短不一，與菌柄離生或彎生。菌柄中央生，中空?qǐng)A柱狀，稍彎曲，長(zhǎng)
3.5 15厘米，直徑0. 3 1. 5厘米，菌柄基部相連，上部呈肉質(zhì)，下部為革質(zhì)，表面密生黑褐色短絨毛，擔(dān)孢子生于菌褶子實(shí)層上，孢子圓柱形，無色本發(fā)明的技術(shù)方案
①采集野生毛柄金錢菌子實(shí)體；
②組織分離或孢子分離；
③純化菌株及菌株鑒定；
④生物學(xué)特性比較及生產(chǎn)性狀比較；
⑤確定優(yōu)良菌株；
⑥菌種生產(chǎn)及菌種應(yīng)用；
經(jīng)過反復(fù)篩選，獲得菌絲體產(chǎn)量高、抗污染的毛柄金錢菌液體菌種專用菌株KML-19本發(fā)明真菌Flammulina velutipes培養(yǎng)方法(以下為重量百分比)
菌種分離純化培養(yǎng)基2%毛柄金錢菌下腳料、0. 001%VBU2%葡萄糖、2%瓊脂；
毛柄金錢菌菌株分離及鑒定方法
1、將毛柄金錢菌子實(shí)體組織塊或孢子液接種到上述試管瓊脂培養(yǎng)基斜面上，于18-24°C下培養(yǎng)5-10天，對(duì)分離培養(yǎng)的試管每天觀察記錄，及時(shí)剔除已污染的試管，挑選出無污染、長(zhǎng)勢(shì)良好的菌株，獲得毛柄金錢菌分離試管種
2、將分離試管種菌絲塊接種到上述瓊脂培養(yǎng)基的平板培養(yǎng)皿上進(jìn)行菌種純化，2天后取尖端菌絲塊接種在培養(yǎng)基斜面上，于18-24°C下培養(yǎng)5-7天，獲得毛柄金錢菌純化試管種 3、采用供試子實(shí)體與對(duì)應(yīng)菌絲分離物，分別按SDS方法提取總DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增及 ITS序列測(cè)定,通過Blast對(duì)比樣品的ITS序列與GENBANK中的毛柄金錢菌(Flammulinavelutipes) Identities=518/532 (97%), Gaps=8/532 (1%)，分析確定分離得到的純培養(yǎng)物為毛柄金錢菌菌絲體
本發(fā)明毛柄金錢菌菌種的制備方法分為液體培養(yǎng)和固體培養(yǎng)兩種
液體菌種制備方法
液體培養(yǎng)基配方為10 20%麩皮、10 20% 土豆、0. 5 1%蔗糖、10%玉米粉，余下為水，pH
自然
1、將毛柄金錢菌的菌絲體接種到試管瓊脂培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)基配方為PDA培養(yǎng)基，于18-24°C下培養(yǎng)5-7天，獲得試管菌種
2、將試管種接種到500ml三角瓶(每瓶裝200ml)液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基配方為前述液體培養(yǎng)基配方，于20-26°C下?lián)u床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為120-160r/min，培養(yǎng)時(shí)間5_7天
3、將搖瓶菌種接種到25L自動(dòng)發(fā)酵生產(chǎn)線的發(fā)酵罐中，通氣量為1:0. 8v/(vmin);攪拌轉(zhuǎn)速為120-160r/min ;接種量為5-10% ;罐壓0. 04Mpa ； pH為6. 0 ;溫度為20-26°C ;通氣培養(yǎng)72-96小時(shí)，獲得毛柄金錢菌液體菌種
固體菌種制備方法
固體培養(yǎng)基配方為棉籽殼90%、麩皮9%、碳酸鈣l%、pH自然
1、將毛柄金錢菌的菌絲體接種到試管瓊脂培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)基配方為PDA培養(yǎng)基，于18-24°C下培養(yǎng)5-7天，獲得試管菌種
2、將試管種接種到500ml三角瓶(每瓶裝200ml)液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基配方為前述液體培養(yǎng)基配方，于20-26°C下?lián)u床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為120-160 r/min，培養(yǎng)時(shí)間5_7天
2、采用前述固體培養(yǎng)基配方。將培養(yǎng)料混合后，加水拌均勻后，裝入750ml的大口瓶中，壓緊封口后在120°C滅菌60分鐘，接入液體菌種，于20-26°C培養(yǎng)15-20天，直到菌絲長(zhǎng)滿
具體實(shí)施例方式 實(shí)施例一
1、將毛柄金錢菌子實(shí)體組織塊接種到上述菌種分離純化培養(yǎng)基斜面上，于18°C下培養(yǎng)10天，對(duì)分離培養(yǎng)的試管每天觀察記錄，及時(shí)剔除已污染的試管，挑選出無污染、長(zhǎng)勢(shì)良好的菌株，獲得毛柄金錢菌分離試管種
2、將分離試管種菌絲塊接種到上述瓊脂培養(yǎng)基的平板培養(yǎng)皿上進(jìn)行菌種純化，2天后取菌絲塊接種在培養(yǎng)基斜面上，于18°C下培養(yǎng)7天，獲得毛柄金錢菌純化試管種3、采用供試子實(shí)體與對(duì)應(yīng)菌絲分離物，分別按SDS方法提取總DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增及ITS序列測(cè)定,通過Blast對(duì)比樣品的ITS序列與GENBANK中的毛柄金錢菌(Flammulinavelutipes) Identities=521/525 (97%), Gaps=2/525 (0%)，分析確定分離得到的純培養(yǎng)物為毛柄金錢菌菌絲體
4、將Flammulinavelutipes KML-19的菌絲體接種到試管瓊脂培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)基配方為PDA培養(yǎng)基，18°C下培養(yǎng)7天，獲得試管種
5、將試管種接種到500ml三角瓶中(每瓶裝200ml)液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基配方為10%麩皮、10% 土豆、0. 5%蔗糖、10%玉米粉，余下為水，pH自然。于20°C下?lián)u床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為120rpm,培養(yǎng)時(shí)間7天，獲得一級(jí)液體菌種
將一級(jí)液體菌種接種到25L自動(dòng)發(fā)酵生產(chǎn)線的發(fā)酵罐中，通氣量為1:0. 8v/ (vmin)；攪拌轉(zhuǎn)速為120r/min ;接種量為5% ;罐壓0. 04Mpa ； pH為6. 0 ;溫度為22°C ;通氣培養(yǎng)96 小時(shí)，獲得毛柄金錢菌液體菌種
實(shí)施例二
菌種制備的步驟與實(shí)施例一相同
1、將毛柄金錢菌子實(shí)體組織塊接種到上述菌種分離純化培養(yǎng)基斜面上，于22°C下培養(yǎng)6天，對(duì)分離培養(yǎng)的試管每天觀察記錄，及時(shí)剔除已污染的試管，挑選出無污染、長(zhǎng)勢(shì)良好的菌株，獲得毛柄金錢菌分離試管種
2、將分離試管種菌絲塊接種到上述瓊脂培養(yǎng)基的平板培養(yǎng)皿上進(jìn)行菌種純化，2天后取尖端菌絲塊接種在培養(yǎng)基斜面上，于22°C下培養(yǎng)6天，獲得毛柄金錢菌純化試管種
3、采用供試子實(shí)體與對(duì)應(yīng)菌絲分離物，分別按SDS方法提取總DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增及ITS序列測(cè)定,通過Blast對(duì)比樣品的ITS序列與GENBANK中的毛柄金錢菌(Flammulinavelutipes) Identities=521/525 (97%), Gaps=2/525 (0%)，分析確定分離得到的純培養(yǎng)物為毛柄金錢菌菌絲體
4、將Flammulinavelutipes KML-19的菌絲體接種到試管瓊脂培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)基配方為PDA培養(yǎng)基，22°C下培養(yǎng)6天，獲得試管種
5、將試管種接種到500ml三角瓶中(每瓶裝200ml)液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基配方為15%麩皮、15% 土豆、0.6%蔗糖、10%玉米粉，余下為水，pH自然。于22°C下?lián)u床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為140rpm,培養(yǎng)時(shí)間6天,獲得一級(jí)液體菌種
將一級(jí)液體菌種接種到25L自動(dòng)發(fā)酵生產(chǎn)線的發(fā)酵罐中，通氣量為1:0. 8v/(vmin)；攪拌轉(zhuǎn)速為140r/min ;接種量為8% ;罐壓0. 04Mpa ； pH為6. 0 ;溫度為24°C ;通氣培養(yǎng)84小時(shí)，獲得毛柄金錢菌液體菌種
實(shí)施例三
1、將毛柄金錢菌子實(shí)體組織塊接種到上述菌種分離純化培養(yǎng)基斜面上，于24°C下培養(yǎng)5天，對(duì)分離培養(yǎng)的試管每天觀察記錄，及時(shí)剔除已污染的試管，挑選出無污染、長(zhǎng)勢(shì)良好的菌株，獲得毛柄金錢菌分離試管種
2、將分離試管種菌絲塊接種到上述瓊脂培養(yǎng)基的平板培養(yǎng)皿上進(jìn)行菌種純化，2天后取尖端菌絲塊接種在培養(yǎng)基斜面上，于24°C下培養(yǎng)5天，獲得毛柄金錢菌純化試管種
3、采用供試子實(shí)體與對(duì)應(yīng)菌絲分離物，分別按SDS方法提取總DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增及ITS序列測(cè)定,通過Blast對(duì)比樣品的ITS序列與GENBANK中的毛柄金錢菌(Flammulinavelutipes) Identities=521/525 (97%), Gaps=2/525 (0%)，分析確定分離得到的純培養(yǎng)物為毛柄金錢菌菌絲體
4、將Flammulinavelutipes KML-19的菌絲體接種到試管瓊脂培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)基配方為PDA培養(yǎng)基，24°C下培養(yǎng)5天，獲得試管種
5、將試管種接種到500ml三角瓶中(每瓶裝200ml)液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基配方為20%麩皮、20% 土豆、0. 5%蔗糖、10%玉米粉，余下為水，pH自然。于26°C下?lián)u床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為160rpm,培養(yǎng)時(shí)間5天,獲得一級(jí)液體菌種·
將一級(jí)液體菌種接種到固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基配方為棉籽殼90%、麩皮9%、碳酸|丐1%、PH自然。將各原料按比例稱量后混合均勻，加水拌勻后裝入750ml的菌種瓶中，每瓶裝500ml, 120°C滅菌60分鐘后，接種后置于26°C培養(yǎng)15天，獲得毛柄金錢菌固體菌種
實(shí)施例四
1、將毛柄金錢菌子實(shí)體組織塊接種到上述菌種分離純化培養(yǎng)基斜面上，于24°C下培養(yǎng)5天，對(duì)分離培養(yǎng)的試管每天觀察記錄，及時(shí)剔除已污染的試管，挑選出無污染、長(zhǎng)勢(shì)良好的菌株，獲得毛柄金錢菌分離試管種
2、將分離試管種菌絲塊接種到上述瓊脂培養(yǎng)基的平板培養(yǎng)皿上進(jìn)行菌種純化，2天后取菌絲塊接種在培養(yǎng)基斜面上，于24°C下培養(yǎng)5天，獲得毛柄金錢菌純化試管種
3、采用供試子實(shí)體與對(duì)應(yīng)菌絲分離物，分別按SDS方法提取總DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增及ITS序列測(cè)定,通過Blast對(duì)比樣品的ITS序列與GENBANK中的毛柄金錢菌(Flammulinavelutipes) Identities=521/525 (97%), Gaps=2/525 (0%)，分析確定分離得到的純培養(yǎng)物為毛柄金錢菌菌絲體
4、將Flammulinavelutipes KML-19的菌絲體接種到試管瓊脂培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)基配方為PDA培養(yǎng)基，24°C下培養(yǎng)5天，獲得試管種
5、將試管種接種到500ml三角瓶中(每瓶裝200ml)液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基配方為18%麩皮、10%土豆、1%蔗糖、10%玉米粉，余下為水，pH自然。于26°C下?lián)u床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為160rpm，培養(yǎng)時(shí)間5天，獲得一級(jí)液體菌種
將一級(jí)液體菌種接種到固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基配方為棉籽殼90%、麩皮9%、碳酸|丐1%、PH自然。將各原料按比例稱量后混合均勻，加水拌勻后裝入750ml的菌種瓶中，每瓶裝500ml, 120°C滅菌60分鐘后，接種后置于20°C培養(yǎng)20天，獲得毛柄金錢菌固體菌種。
權(quán)利要求
1.一種毛柄金錢菌菌株,其特征在于所述菌株為velutipes) KML-19,該菌株的保藏號(hào)為CGMCC NO. 6704。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的毛柄金錢菌菌株的制備方法，所述菌株是經(jīng)過常規(guī)的液體和固體發(fā)酵培養(yǎng)獲得的，其特征在于所述液體和固體發(fā)酵培養(yǎng)基配方如下 液體培養(yǎng)基配方為5-10%麩皮、O. 5-1%黃豆粉、O. 5-1%麥芽糖、1-3%玉米粉，余下為水，pH自然; 固體培養(yǎng)基配方為木屑75-90%、麩皮5-20%、磷肥1%、石膏1%、羊肚菌生長(zhǎng)地腐殖土3%，含水量60%、pH自然。
全文摘要
本發(fā)明涉及毛柄金錢菌菌株的篩選及制備方法，屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的菌株FlammulinavelutipesKML-19已于2012年10月11日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCCNO.6704。利用該菌株制備的液體及固體優(yōu)良菌種，應(yīng)用于毛柄金錢菌的促繁有著顯著的社會(huì)、經(jīng)濟(jì)效益和廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)A01H15/00GK102986536SQ20121050382
公開日2013年3月27日 申請(qǐng)日期2012年12月2日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月2日
發(fā)明者張微思, 郭永紅, 羅孝坤, 羅曉莉, 尚陸娥 申請(qǐng)人:中華全國(guó)供銷合作總社昆明食用菌研究所, 云南省供銷合作社科學(xué)研究所, 昆明菌苑食品有限公司