專利名稱：一種快速鑒定篩選香蕉枯萎病抗病種苗的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)植物保護技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種快速鑒定篩選香蕉枯萎病抗病種苗的方法。
背景技術(shù)：
香蕉枯萎病是分布于世界各主要香蕉產(chǎn)區(qū)的重要病害。由于香蕉枯萎病是典型的土傳病害，其防治非常困難，應用抗病品種防治香蕉枯萎病是目前最經(jīng)濟有效的方法。目前，我國普遍使用的香蕉枯萎病抗病種苗鑒定一般采用以土壤、細砂或基質(zhì)為載體的盆栽接種的方法，如應用最廣泛的盆栽灌根法和浸根后移栽法等，上述盆栽接種方法主要存在以下問題1、由于土壤微生物的交互作用會影響試驗結(jié)果的準確性，必須事先 進行大規(guī)模的土壤消毒，操作不便，不利于抗病種苗的大量篩選；2、鑒定周期長，通常鑒定一次需要30天以上；3、種苗與土壤接觸可能遭受其他土傳病害的干擾，影響試驗結(jié)果的準確性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述不足，提供一種通過在水培條件下對香蕉苗進行苗期接種，提高香蕉枯萎病育種的效率，同時為香蕉與病原菌互作機制、病原菌致病性分化、寄主抗性遺傳、植物抗病機制、抗病種質(zhì)資源篩選及抗病品種選育等研究提供便利的快速鑒定篩選香蕉枯萎病抗病種苗的方法。本發(fā)明一種快速鑒定篩選香蕉枯萎病抗病種苗的方法，通過如下步驟實現(xiàn)
(I)、建立香蕉苗水培系統(tǒng)
選取一定容積的水培容器，所述水培容器為水培箱、水培種植槽或水培池，水培容器內(nèi)加入香蕉苗水培營養(yǎng)液，水培容器內(nèi)嵌置有定植板，所述定植板為厚度2-3cm的輕質(zhì)聚苯乙烯泡沫板，所述定植板上開設(shè)有若干直徑為5-6 cm的開孔，開孔內(nèi)匹配置放有培養(yǎng)杯，所述培養(yǎng)杯壁上開設(shè)有若干孔洞，所述培養(yǎng)杯內(nèi)放置有香蕉苗；將培養(yǎng)杯置放于開孔內(nèi)后，培養(yǎng)杯接觸香蕉苗水培營養(yǎng)液深度為0. 5-2. Ocm,以避免香蕉苗整個球莖浸沒入香蕉苗水培營養(yǎng)液中；所述水培容器通過管道連通有小型電動加氧泵，以用于提供香蕉苗水培營養(yǎng)液循環(huán)及加氧；電動加氧泵上設(shè)置有定時控制器，定時控制器控制電動加氧泵啟動和關(guān)閉來調(diào)節(jié)香蕉苗水培營養(yǎng)液中含氧量。(2)、接種體制備及接種
制備濃度為105-108cfU/ml的香蕉枯萎病病原菌孢子懸浮液作為接種體，選取葉齡為5-12葉期，株高為8-35cm的健康組培香蕉苗；采用傷根浸菌液法進行接種，將組培香蕉苗自苗床撥出，用自來水沖洗干凈，再分別浸在配制好的香蕉枯萎病病原菌孢子懸浮液中，以清水作對照，浸泡30-60 min后，將接種后的香蕉苗放置于培養(yǎng)杯內(nèi)，并進行固定，移栽到盛有香蕉苗水培營養(yǎng)液的水培容器中；所述香蕉枯萎病病原菌為尖孢鐮孢菌古巴?；?Fusarium oxysporum f. sp. cubense),包括 4 號生理小種(Foc4)、I 號生理小種(Foci )、2號生理小種或大蕉枯萎病菌等。(3)、香蕉苗的日常管理
將接種后的香蕉苗置于溫度為2(T32°C、光照的環(huán)境中進行觀察，光照提供方式可為自然光或人造光，保持水培容器內(nèi)的香蕉苗水培營養(yǎng)液每小時通電加氧10-20min，并定期對香蕉苗水培營養(yǎng)液進行補充，記錄植株的生長情況。(4)、病情調(diào)查與分級
接種香蕉枯萎病病原菌大約10天后病癥初顯，開始按照病害評價等級對香蕉苗進行病害等級鑒定，記錄香蕉苗的發(fā)病率及病情指數(shù)，每隔3-5天調(diào)查一次，共調(diào)查3-5次，根據(jù)發(fā)病率和病情指數(shù)判斷植株抗病能力。其中葉片病情調(diào)查方法為0級無癥狀；1級葉片黃化或萎蔫面積不超過葉片總 面積的50% ;2級葉片黃化或萎蔫面積超過葉片總面積的50% ;3級葉片萎蔫或枯死，僅生長點存活；4級整株枯死。同時，如僅對香蕉品種抗性進行鑒定不需保留抗性的香蕉苗，在最后一次調(diào)查時同時切開球莖調(diào)查球莖危害狀況。其中球莖內(nèi)部癥狀病情調(diào)查方法為0級球莖全部干凈，維管束不變色；1級球莖全部干凈，維管束有零星小點變色；2級維管束組織變色小于1/3 ；3級維管束組織變色在1/3至2/3之間；4級維管束組織變色大于2/3 ；5級維管束組織全部變色。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)比較具有以下有益效果
(1)能直接觀察不同發(fā)病時期香蕉苗根系及假莖、球莖的變化情況，為香蕉枯萎病病原菌侵染過程及寄主與病原互作機制等研究提供便利；
(2)可在較短時間內(nèi)連續(xù)鑒定較大數(shù)量的組培香蕉苗，有利于大規(guī)模篩選香蕉枯萎病抗病種苗；
(3)經(jīng)鑒定為具有抗性的香蕉苗可不傷根系移栽至田間繼續(xù)生長；
(4)采用香蕉苗水培營養(yǎng)液為香蕉苗提供生長載體，可減少其他土傳病害的干擾，提高試驗結(jié)果準確性；
(5)香蕉枯萎病抗病鑒定時容易進行人工控制，滿足不同試驗需要。綜上所述，本發(fā)明一種快速鑒定篩選香蕉枯萎病抗病種苗的方法，通過香蕉苗期接種及水培鑒定方法，在較小面積上連續(xù)鑒定大量組培香蕉苗，一年可進行多次鑒定，提高了試驗結(jié)果的可靠性、縮短了鑒定周期、節(jié)省場地及試驗成本；能有效排除土壤的結(jié)構(gòu)、營養(yǎng)、微生物等物理化學生物性差異，病原菌量差異及其他病害對香蕉枯萎病抗病性鑒定的干擾。
具體實施例方式為能進一步了解本發(fā)明的特征、技術(shù)手段以及所達到的具體目的、功能，下面結(jié)合附圖
與具體實施方式
對本發(fā)明作進一步詳細描述。本發(fā)明一種快速鑒定篩選香蕉枯萎病抗病種苗的方法，通過對巴西(感病品種)、農(nóng)科I號(中抗品種)、抗枯5號(高抗品種)3個不同抗性的香蕉品種的抗病性鑒定中，并與田間病害評價進行對照。I.準備接種體?；谇捌诘闹虏×z測試驗，采用致病力較強的供試致病菌株尖孢鐮孢菌古巴?；?號生理小種(Foc4)。4號生理小種菌株接種于無菌馬鈴薯乳糖產(chǎn)孢子培養(yǎng)液中(馬鈴薯200g，乳糖20g，水IOOOmL, 121 °C高溫滅菌20min)，在溫度為25_28°C、轉(zhuǎn)速為150r/min恒溫條件下振蕩培養(yǎng)5_7天后，4號生理小種菌液用無菌水配成濃度為106cfu/ml的香蕉枯萎病病原菌孢子懸浮液。2.選取葉齡為5-6葉期，株高約IOcm的健康組培香蕉苗。3.以容積為40cm X 30cm X 20cm的塑料箱作為水培容器，在水培容器上面置放厚為2 cm定植板,定植板上開有三行、每行兩個直徑為5. 5cm的開孔,開孔內(nèi)放置裝有香蕉苗的多孔洞培養(yǎng)杯，培養(yǎng)杯接觸營養(yǎng)液的部分應有5-20_深。池外放置小型電動加氧泵用于營養(yǎng)液加氧，電動加氧泵接上定時器并接通電源，每小時通電加氧15min。4.營養(yǎng)液的配方參考劉士哲主編的《無土栽培技術(shù)》，采用香蕉沙培營養(yǎng)液配方，大量元素包括Ca(NO3)2.440400 mg/L、KN03200 mg/L、MgS04*7H20220mg/L、KH2PO4120mg/L、NH4N0350mg/L ;微量元素包括EDTA_2NaFe (含 Fe 14. 0%) 20_40mg/L、H3B032. 86mg/L、 MnSO4*4H202. 13mg/L、ZnSO4*7H200. 22 mg/L、CuSO4*5H200. 08mg/L、(NH4) 6Mo7024 . 4H20 0. 02mg/L，該配方一個劑量的EC值為I. 2ms/cm，調(diào)節(jié)培養(yǎng)液的PH至5. 8-6. O。5.選取巴西(感病品種，重病地發(fā)病率70%以上)、農(nóng)科I號(中抗品種，重病地發(fā)病率20-40%)、抗枯5號(高抗品種，重病地發(fā)病率5%左右)3個不同抗性的香蕉品種，采用浸根后移栽法進行接種，將組培香蕉苗自苗床撥出，用自來水沖洗干凈，剪除部分根系，保留根長2-3cm，再分別浸在配制好的香蕉枯萎病病原菌孢子懸浮液中，以清水做對照，浸泡30min后置放于多孔洞培養(yǎng)杯里面,移栽到盛有營養(yǎng)液的水培容器中，置于溫度為25-28°C、自然光或人工光照的環(huán)境中觀察發(fā)病情況，每3天觀察并調(diào)查一次發(fā)病率及葉片病情指數(shù)。每個品種接種組培香蕉苗30株，做3次重復實驗，每個品種均設(shè)置清水對照。鑒定結(jié)果如下
3個不同香蕉品種不同接種時期的發(fā)病情況
權(quán)利要求
1.一種快速鑒定篩選香蕉枯萎病抗病種苗的方法，其特征在于，通過如下步驟實現(xiàn) (1)、建立香蕉苗水培系統(tǒng) 選取一定容積的水培容器，水培容器內(nèi)加入香蕉苗水培營養(yǎng)液，水培容器內(nèi)嵌置有定植板，所述定植板上開設(shè)有若干開孔，開孔內(nèi)匹配置放有培養(yǎng)杯，所述培養(yǎng)杯壁上開設(shè)有若干孔洞，所述培養(yǎng)杯內(nèi)放置香蕉苗； (2)、接種體制備及接種 制備濃度為105-108cfU/ml的香蕉枯萎病病原菌孢子懸浮液作為接種體，選取葉齡為5-12葉期，株高為8-35cm的健康組培香蕉苗；采用傷根浸菌液法進行接種，將組培香蕉苗自苗床撥出，用自來水沖洗干凈，再分別浸在配制好的香蕉枯萎病病原菌孢子懸浮液中，以清水作對照，浸泡30-60min后，將接種后的香蕉苗放置于培養(yǎng)杯內(nèi)，并進行固定，移栽到盛有香蕉苗水培營養(yǎng)液的水培容器中； (3)、香蕉苗的日常管理 將接種后的香蕉苗置于溫度為20-32°C、光照的環(huán)境中進行觀察，保持水培容器內(nèi)的香蕉苗水培營養(yǎng)液每小時通電加氧10_20min，并定期對香蕉苗水培營養(yǎng)液進行補充，記錄植株的生長情況； (4)、病情調(diào)查與分級 香蕉枯萎病病癥初顯后，開始按照病害評價等級對香蕉苗進行病害等級鑒定，記錄香蕉苗的發(fā)病率及病情指數(shù)，每隔3-5天調(diào)查一次，共調(diào)查3-5次，根據(jù)發(fā)病率和病情指數(shù)判斷植株抗病能力。
2.根據(jù)權(quán)利I要求所述的一種快速鑒定篩選香蕉枯萎病抗病種苗的方法，其特征在于所述水培容器為水培箱、水培種植槽或水培池。
3.根據(jù)權(quán)利I要求所述的一種快速鑒定篩選香蕉枯萎病抗病種苗的方法，其特征在于所述水培容器通過管道連通有電動加氧泵，所述電動加氧泵上設(shè)置有定時控制器，電動加氧泵啟動和關(guān)閉通過定時控制器控制。
4.根據(jù)權(quán)利I要求所述的一種快速鑒定篩選香蕉枯萎病抗病種苗的方法，其特征在于所述定植板為厚度2-3cm的輕質(zhì)聚苯乙烯泡沫板。
5.根據(jù)權(quán)利I要求所述的一種快速鑒定篩選香蕉枯萎病抗病種苗的方法，其特征在于所述開孔直徑范圍為5-6 cm。
6.根據(jù)權(quán)利I要求所述的一種快速鑒定篩選香蕉枯萎病抗病種苗的方法，其特征在于所述培養(yǎng)杯接觸香蕉苗水培營養(yǎng)液深度為0. 5-2. Ocm0
7.根據(jù)權(quán)利I要求所述的一種快速鑒定篩選香蕉枯萎病抗病種苗的方法，其特征在于所述香蕉枯萎病病原菌為尖孢鐮孢菌古巴?；?，包括4號生理小種、I號生理小種、2號生理小種或大蕉枯萎病菌。
8.根據(jù)權(quán)利I要求所述的一種快速鑒定篩選香蕉枯萎病抗病種苗的方法，其特征在于，所述香蕉苗的發(fā)病率及病情指數(shù)按照0-4級進行病害評價，其中，香蕉苗葉片病情調(diào)查方法是0級無癥狀；1級葉片黃化或萎蔫面積不超過葉片總面積的50% ；2級葉片黃化或萎蔫面積超過葉片總面積的50% ；3級葉片萎蔫或枯死，僅生長點存活；4級整株枯死。
9.根據(jù)權(quán)利I要求所述的一種快速鑒定篩選香蕉枯萎病抗病種苗的方法，其特征在于，所述香蕉苗的發(fā)病率及病情指數(shù)按照0-5級進行病害評價，其中，香蕉苗內(nèi)部癥狀病情調(diào)查方法為O級球莖全部干凈，維管束不變色；1級球莖全部干凈，維管束有零星小點變 色；2級維管束組織變色小于1/3 ；3級維管束組織變色在1/3至2/3之間；4級維管束組織變色大于2/3 ；5級維管束組織全部變色。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種快速鑒定篩選香蕉枯萎病抗病種苗的方法，包括建立香蕉苗水培系統(tǒng)、接種體制備及接種、香蕉苗的日常管理、病情調(diào)查與分級等步驟，通過香蕉苗期接種及水培鑒定方法能有效控制在香蕉苗期接種鑒定過程中因土壤的結(jié)構(gòu)、營養(yǎng)、微生物等差異造成的干擾，實現(xiàn)對抗香蕉枯萎病種苗快速、準確鑒定，能在較小面積上連續(xù)鑒定大量組培香蕉苗，一年進行多次鑒定，提高了試驗結(jié)果的可靠性、縮短了鑒定周期、節(jié)省場地及試驗成本。
文檔編號A01G1/00GK102771326SQ20121028023
公開日2012年11月14日 申請日期2012年8月8日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月8日
發(fā)明者劉文清, 呂順, 周建坤, 曾莉莎, 李洪波, 王芳 申請人:東莞市香蕉蔬菜研究所