專利名稱：花鰻鱺生長(zhǎng)激素及其編碼基因和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于水產(chǎn)學(xué)基因工程技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種花鰻鱺生長(zhǎng)激素及其編碼基因和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
生長(zhǎng)激素(Growth hormone, GH)是包括魚(yú)類在內(nèi)的所有脊椎動(dòng)物腦垂體分泌的一種單鏈多肽激素。GH是一種具有廣泛生理功能的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)素，能影響幾乎所有的組織類型和細(xì)胞，包括免疫組織、腦組織及造血系統(tǒng)，其主要生理作用是刺激骨、軟骨細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)、糖和脂肪的代謝。GH發(fā)揮作用主要通過(guò)兩種方式一是誘導(dǎo)肝細(xì)胞等產(chǎn)生GH介質(zhì)(又稱胰島素樣生長(zhǎng)因子，IGFs)，再由IGFs間接起作用；二是直接作用于靶細(xì)胞產(chǎn)生生理效應(yīng)。無(wú)論哪一種方式GH都需要首先與GH結(jié)合蛋白結(jié)合，通過(guò)GH結(jié)合蛋白與細(xì) 胞表面特異性受體結(jié)合，再由受體介導(dǎo)產(chǎn)生生物效應(yīng)。目前對(duì)GH的研究主要集中于鳥(niǎo)類和哺乳類，近年來(lái)對(duì)魚(yú)類的研究也日趨增多。GH能增強(qiáng)食欲、提高飼料轉(zhuǎn)化率、加速魚(yú)體生長(zhǎng)發(fā)育，被認(rèn)為是最有效的促進(jìn)生長(zhǎng)因子。然而，魚(yú)類體內(nèi)天然激素含量極低，分離純化比較困難，成本較高，不可能大規(guī)模應(yīng)用于生產(chǎn)。近年來(lái)，基因工程技術(shù)的飛速發(fā)展和完善為大量生產(chǎn)廉價(jià)的魚(yú)類激素提供了保證。生長(zhǎng)激素在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)有重大作用，越來(lái)越得到人們的重視。魚(yú)類生長(zhǎng)激素基因的克隆及表達(dá)無(wú)論在科學(xué)研究還是生產(chǎn)應(yīng)用上都有重要意義?；狑~在分類學(xué)上隸屬于硬骨魚(yú)綱、鰻鱺目、鰻鱺科、鰻鱺屬，廣泛分布于全球熱帶、亞熱帶和溫帶地區(qū)，是鰻鱺屬魚(yú)類中分布最廣的種類。我國(guó)的福建、廣東、臺(tái)灣、海南等省的河流海域可見(jiàn)到花鰻鱺，但由于人為捕撈嚴(yán)重及江河中修建水利水電工程對(duì)河道的破壞，花鰻鱺的自然資源顯著下降，已被列為我國(guó)二級(jí)保護(hù)動(dòng)物?；狑~品味鮮美，其肉和肝的維生素A含量特別高，營(yíng)養(yǎng)豐富，具有相當(dāng)高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，但價(jià)格昂貴，歷來(lái)被視為上等滋補(bǔ)食品，稱之為“水中人參”。近年來(lái)，在我國(guó)養(yǎng)殖花鰻鱺已經(jīng)逐步形成規(guī)?；?，但是花鰻鱺的養(yǎng)殖者普遍認(rèn)為該魚(yú)野性大，馴化難，低齡階段不易長(zhǎng)大；逃走能力特別強(qiáng)，可以跳躍式逃走；養(yǎng)殖過(guò)程中苗種生長(zhǎng)速度是制約其發(fā)展的主要原因。在工廠化養(yǎng)殖花鰻鱺的生產(chǎn)周期中，II齡前苗種的生長(zhǎng)速度較慢，II齡后生長(zhǎng)速度才顯著提高，這種現(xiàn)象一直困擾養(yǎng)殖戶及企業(yè)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的首要目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，提供一種花鰻鱺生長(zhǎng)激素。本發(fā)明的另一目的在于提供上述花鰻鱺生長(zhǎng)激素的編碼基因。本發(fā)明的再一目的在于提供所述的花鰻鱺生長(zhǎng)激素的應(yīng)用。本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)一種花鰻鱺生長(zhǎng)激素，其氨基酸序列如SEQN0. I 所示；編碼所述的花鰻鱺生長(zhǎng)激素的核苷酸序列如SEQN0. 2所示；
所述的花鰻鱺生長(zhǎng)激素可應(yīng)用于花鰻鱺的養(yǎng)殖，特別是花鰻鱺的規(guī)?；B(yǎng)殖。本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果本發(fā)明首次通過(guò)對(duì)花鰻鱺的GH基因進(jìn)行克隆、測(cè)序及分析，并進(jìn)行表達(dá)獲得同源生長(zhǎng)激素，將其應(yīng)用于解決養(yǎng)殖生產(chǎn)中出現(xiàn)的問(wèn)題，實(shí)現(xiàn)產(chǎn)學(xué)研結(jié)合，為花鰻鱺人工養(yǎng)殖和可持續(xù)發(fā)展提供新的理論依據(jù)。本發(fā)明提供的花鰻鱺生長(zhǎng)激素有利于大規(guī)模的推廣應(yīng)用，具有較好的經(jīng)濟(jì)效益。


圖I是GH cDNA序列擴(kuò)增凝膠電泳圖，其中M為Marker，1、2為目的片段。圖2是瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)菌液PCR結(jié)果圖，其中編號(hào)1-5為菌液鑒定PCR產(chǎn)物;M 為 Marker DL2000。·圖3是15wt%SDS_PAGE電泳檢測(cè)純化結(jié)果圖，其中A為Marker，B為空載對(duì)照，C為未加IPTG誘導(dǎo)的蛋白，D為總蛋白，E為上清液，F(xiàn)為沉淀物，G為最初洗脫物，H為洗脫液I，I為洗脫液II，J為洗脫液III。圖4是同源生長(zhǎng)激素浸泡花鰻鱺苗的生長(zhǎng)情況比較圖。圖5是同源生長(zhǎng)激素浸泡花鰻鱺苗的增重率比較圖。圖6是同源生長(zhǎng)激素浸泡花鰻鱺苗的特定生長(zhǎng)率比較圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。實(shí)施例I(一)花鰻鱺生長(zhǎng)激素編碼基因根據(jù)已知魚(yú)類GH基因的保守序列，設(shè)計(jì)合成簡(jiǎn)并引物，采用同源克隆的方法，從花鰻鱺腦垂體基因組DNA中擴(kuò)增得到GH基因的中間片段；利用已克隆的中間片段，設(shè)計(jì)特異引物，獲得了 GH基因cDNA ;通過(guò)序列拼接，最終得到花鰻鱺生長(zhǎng)激素編碼基因。I、總RNA提取提取花鰻鱺的腦垂體總RNA (提取方法參考Trizol Reagent RNA提取試劑盒的使用說(shuō)明書(shū))。2、反轉(zhuǎn)錄PCR :取上述提取得到的總RNA,使用購(gòu)自TAKALA公司的Fermentas反轉(zhuǎn)錄試劑盒，參考說(shuō)明書(shū)中的操作步驟，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR，獲得總cDNA (I)在超凈工作臺(tái)中，取DEPC處理的200μ I PCR管置冰上，依次加入總RNA2y I、引物(O. 5 μ g/ μ I) I μ g、無(wú)菌去RNA水10 μ I定容至總體積13 μ I (如表I),輕輕混勻；表I反轉(zhuǎn)錄PCR反應(yīng)體系I
RNA2^
oligo (d'T) η primerI μ Watei'. nuclease-free10μ1 總體積 Μ(2) 65 °C 反應(yīng) 5min，重新置于冰上，依次加入 5XRT Buffer 4 μ I、RNaseinhibitor (20U/μ I) I μ I 和 IOmM dNTP Mix 2 μ I,混勻，用微量離心機(jī) 3000rpm 離心 30s。置PCR儀25°C 5min。取出置冰上冷卻。加入M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶(200U/ μ I) I μ I至終體積21 μ I (如表 2)；表2反轉(zhuǎn)錄PCR反應(yīng)體系2
5 X Reaction Buffer4μ!
RNase Inhibitor (20μ/μΠI μ IOmM dNTP Mix2μ1 M-MuLV Reverse Transcriptase (200 U /μΙ) Ιμ
總體積2hli(3)置 PCR 儀中按以下條件進(jìn)行25°C /10min，42°C /60min，70°C /5min，立即冰上 冷卻，產(chǎn)物cDNA即用于PCR，保存于_30°C冰箱中。3、GH基因外顯子片段的獲取3. I引物的設(shè)計(jì)參考已報(bào)道的日本鰻鱺及歐洲鰻鱺的GH基因序列(登錄號(hào)分別為M24066. I和AY616666. I)，登錄Genebank下載其序列，分析保守區(qū)域發(fā)現(xiàn)外顯子部分高度保守，在外顯子序列兩端設(shè)計(jì)一對(duì)引物上游引物HMLF :5’ -ATGGCATCAGGGTTCCTTC-3’，下游引物HMLR :5’-CTACAGGGTGCAGTTGCTTTC_3’ ；3. 2PCR 反應(yīng)依次加入表3反應(yīng)物表3PCR反應(yīng)混合體系
cDNA μ
Primer FΟ. μ
Primer R0.1 μ1!丁叫°·1 .u^ dNTP Mix 4.7μ!
QdH2O4μΙ
總體積10μ1PCR 反應(yīng)程序94 °C 3min, (94 °C 30sec, 55 °C 30sec, 72 °C 40sec) 33 個(gè)循環(huán)，72°C 8min, 4°C forever ；3. 3PCR產(chǎn)物檢測(cè)取3. 2PCR反應(yīng)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物2份，每份5 μ I，于I. 0wt%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，Ig瓊脂糖加IOOml蒸餾水，微波爐煮沸熔化后，冷卻至60°C，加入溴化乙啶(EB，IOmg/ml)5l·! I ;電壓150V、時(shí)間為15min ;電泳結(jié)束后，用凝膠成像系統(tǒng)拍照并保存(圖I);由圖I可以看到，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的目的條帶清晰、大小約630bp。3. 4目的片段的回收純化
(I)紫外透照儀下觀察凝膠取3. 3電泳結(jié)束后的瓊脂糖凝膠，從瓊脂糖凝膠上切下含目的片段的凝膠(盡量減少在紫外下曝光時(shí)間)，切碎凝膠塊，稱重，計(jì)算凝膠塊體積(Img 約 I μ I);(2)向凝膠塊中加入等體積的Binding Buffer,沒(méi)過(guò)凝膠塊為宜,置于60°C烘箱中，每隔2min搖勻一次,溶膠8min,得到溶膠；(3)向HiBind DNA柱中加入700 μ I步驟(2)的溶膠，lOOOOrpm、室溫離心Imin ；(4)棄廢液，加 300 μ I Binding Buffer (XP2), lOOOOrpm、室溫離心 Imin ;(5)棄廢液，加入 700 μ I SPff Wash Buffer 溶液，lOOOOrpm、室溫離心 Imin ；(6)重復(fù)步驟(5);
(7)棄廢液，13000rpm、室溫離心 2min ；(8)換一只新的 EP 管，向 HiBind DNA 柱中加入 30μ1 Elution Buffer, 13000rpm>室溫離心Imin ；(9)將離心后的溶液重新加入HiBind DNA柱中，13000rpm、室溫離心lmin，所得沉淀為PCR目的片段；3. 5PCR產(chǎn)物的克隆測(cè)序?qū)⒉襟E3. 4回收的PCR目的片段與PMD18-T載體重組連接依次加入I μ 1PMD18-TVector>5 μ I Ligation Solution I、I μ I 步驟 3. 4 回收的 PCR 產(chǎn)物,加純凈水補(bǔ)至 10 μ I,輕柔離心混勻(3000rpm、室溫離心2min)，置于酶連儀上16°C連接15h，4°C保存。3. 6連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化(I)取5μ1步驟3.5的連接產(chǎn)物，加入2(^1未完全解凍的大腸桿菌0冊(cè)0感受態(tài)細(xì)胞，輕輕混勻，3000rpm、室溫離心2min,冰中放置30min ；(2) 42°C熱激90s后冰浴2min，得混合物；(3)將步驟(2)的混合物加入到800μ I LB培養(yǎng)基中，37°C、220rpm振蕩培養(yǎng)Ih ；(4)室溫2000rpm離心2min，吸掉400 μ I上清液后吹打混勻，得到混合液；(5)取100 μ I步驟(4)的混合液均勻涂布在含LA培養(yǎng)基的平板中，于37°C培養(yǎng)Ih后，倒置培養(yǎng)過(guò)夜；3. 7重組質(zhì)粒的篩選及保種(I)挑取3. 6步驟(5)的平板LA培養(yǎng)基上單個(gè)白色菌落置于含IXf5Amp的800 μ ILB培養(yǎng)基中，37°C、200rpm振蕩培養(yǎng)3h，得菌液；(2)菌液PCR鑒定向0. 2ml PCR管中依次加入I μ I步驟(I)的菌液、5 μ IMix、
0.I μ I M13F (10μΜ)、0· I μ 1M13R (10 μ Μ)和 O. 1μ I Taq 酶，加純凈水補(bǔ)至 50 μ 1，瞬時(shí)離心混勻，3000rpm、室溫離心30s ；(3) PCR 反應(yīng)程序94°C變性 3min ;94°C變性 30s，56°C退火 30s，72°C延伸 30s，33個(gè)循環(huán)，72°C后延伸8min，16°C保存；(4)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)菌液PCR結(jié)果對(duì)菌液PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，記錄陽(yáng)性克隆的編號(hào)，結(jié)果見(jiàn)圖2 ;從圖2中可見(jiàn)PCR產(chǎn)物(1-5)單克隆的條帶大小都在800bp左右，大小均符合測(cè)序要求，3為空載體；(5)超凈工作臺(tái)中取兩個(gè)PCR反應(yīng)呈陽(yáng)性克隆的菌液各200 μ 1，進(jìn)行基因測(cè)序，其核苷酸序列如SEQNO. 2所示；(6)菌液保種取步驟(4) PCR反應(yīng)呈陽(yáng)性克隆的菌液700 μ 1，加入300 μ I甘油，混勻，_80°C保存；所述的花鰻鱺生長(zhǎng)激素基因的完整開(kāi)放閱讀框ORF (open reading frame),共630bp，其中有4個(gè)外顯子，長(zhǎng)度分別為150bp、117bp、162bp、201bp。其核苷酸序列如SEQN0. 2所示；由其推導(dǎo)的GH前體由209個(gè)氨基酸組成，包括長(zhǎng)度為20個(gè)氨基酸的信號(hào)肽和189個(gè)氨基酸成熟肽如SEQN0. I所示。3. 8重組生長(zhǎng)激素表達(dá)載體的構(gòu)建3. 8. I花鰻鱺GH基因ORF片段雙酶切(I)采用50 μ I雙酶切體系(見(jiàn)表4)，將花鰻鱺GH基因ORF片段置于37°C恒溫箱·中酶切3h ；表4雙酶切體系
反應(yīng)物體積
BamHl2.5μ1
XhoI2juiIOxFAST BUFFER5μΙ PCR回收產(chǎn)物 30μ1 eld H2O 10μ13. 8. 2花鰻鱺GH基因ORF片段雙酶切產(chǎn)物的過(guò)柱回收按照Biomiga公司的PCR產(chǎn)物純化回收試劑盒使用說(shuō)明操作,步驟如下(I)在雙酶切產(chǎn)物中，加入2倍體積的Buffer GC,渦旋充分混勻；(2)轉(zhuǎn)移700 μ L DNA/Buffer GC混合溶液至離心柱中，室溫13，OOOx g離心lmin,棄廢液，將離心柱放回收集管中；重復(fù)此步驟使剩余的溶液通過(guò)柱子；(3)加入300 μ L of Buffer GC到離心柱中，室溫13，OOOxg離心40s,棄廢液;(4)加入650 μ L DNA Wash Buffer (確保已將乙醇按說(shuō)明書(shū)要求加入DNA WashBuffer中),室溫、13，OOOxg離心30s，棄廢液;重復(fù)步驟4 ；(5) 13，OOOxg開(kāi)蓋再次離心3min，以去除柱中殘余的乙醇；(6)將柱子放入干凈的I. 5mL離心管中，向柱中加入在60°C預(yù)熱的50 μ LElutionBuffer ;在室溫放置Imin ;13，OOOxg離心Imin以洗脫DNA ;將洗脫液重新上柱,再次離心洗脫；離心管中溶液即為回收產(chǎn)物；(7)將回收后產(chǎn)物電泳檢測(cè)(使用新鮮電泳緩沖液)，拍照保存；3. 8. 3雙酶切產(chǎn)物連接上述雙酶切后的PET32a及PCR雙酶切后回收產(chǎn)物按照下述體系在16°C酶連儀上連接過(guò)夜，于4°C保存。表5連接體系
權(quán)利要求
1.一種花鰻鱺生長(zhǎng)激素，其特征在于其氨基酸序列如SEQ NO. I所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的花鰻鱺生長(zhǎng)激素，其特征在于編碼所述的花鰻鱺生長(zhǎng)激素的核苷酸序列如SEQ NO. 2所示。
3.權(quán)利要求I或2所述的花鰻鱺生長(zhǎng)激素的應(yīng)用，其特征在于所述的花鰻鱺生長(zhǎng)激素在花鰻鱺的養(yǎng)殖中進(jìn)行應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種如SEQ NO.1所示花鰻鱺生長(zhǎng)激素及其編碼基因和應(yīng)用。本發(fā)明首次通過(guò)對(duì)花鰻鱺的生長(zhǎng)激素基因進(jìn)行克隆測(cè)序后進(jìn)行相關(guān)分子生物學(xué)分析，通過(guò)基因表達(dá)得到的花鰻鱺生長(zhǎng)激素能夠有效促進(jìn)花鰻鱺魚(yú)苗的生長(zhǎng)，解決了養(yǎng)殖過(guò)程中花鰻鱺苗種生長(zhǎng)速度緩慢的問(wèn)題，為花鰻鱺人工養(yǎng)殖和可持續(xù)發(fā)展提供新的解決方法。本發(fā)明提供的花鰻鱺生長(zhǎng)激素有利于大規(guī)模的推廣應(yīng)用，可用于花鰻鱺的規(guī)模化養(yǎng)殖，具有較好的經(jīng)濟(jì)效益。
文檔編號(hào)A01K61/00GK102838672SQ20121027920
公開(kāi)日2012年12月26日 申請(qǐng)日期2012年8月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月6日
發(fā)明者劉文生, 張細(xì)權(quán), 李夢(mèng)溪, 聶慶華, 尹立路, 龐博, 劉滿清 申請(qǐng)人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)