專利名稱：椰子成熟合子胚離體培養(yǎng)體細(xì)胞胚胎發(fā)生方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種椰子成熟合子胚離體培養(yǎng)體細(xì)胞胚胎發(fā)生方法。
背景技術(shù)：
椰子(Cocos nucifera L.)屬棕櫚科椰子屬單子葉植物,是一種具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值高、產(chǎn)品利用率高的熱帶木本油料與食品能源作物。椰子多數(shù)品種為異花授粉植物，生長周期長，繁殖系數(shù)低，雜種后代性狀分離嚴(yán)重，個(gè)體差異較大，很難獲得同一性狀后代群體，且椰果個(gè)大、易萌發(fā)、不耐貯藏、運(yùn)輸，這些特性對椰子的種質(zhì)資源收集、交換和保存帶來很大困難。利用組織培養(yǎng)技術(shù)可固定椰子某些優(yōu)良性狀，繼而進(jìn)行培養(yǎng)繁殖，在生產(chǎn)上能夠大量繁殖高產(chǎn)、抗寒、抗風(fēng)等椰子優(yōu)良品種，同時(shí)可使椰子種質(zhì)資源的收集和保存簡便化，提高椰子種質(zhì)資源交流的安全性。
椰子組織培養(yǎng)技術(shù)的研究工作始于二十世紀(jì)50年代，世界各國先后用花的分生組織、葉外植體、椰子成熟合子胚進(jìn)行體外培養(yǎng)，都在不同程度上獲得成功。80年代末菲律賓利用軟肉椰果的胚進(jìn)行組培獲得了成功，已有植株移栽大田。90年代初斯里蘭卡椰子研究所組培室采用未成熟的椰子胚進(jìn)行組織培養(yǎng)也取得了新的進(jìn)展。90年代中期，歐洲與生產(chǎn)國合作開展椰子組織培養(yǎng)技術(shù)攻關(guān)，研究項(xiàng)目已被列入歐洲科技發(fā)展計(jì)劃，該項(xiàng)目由歐共體資助，目的在于加深對椰子體細(xì)胞胚胎發(fā)生的技術(shù)研究。Branton和Blake首次報(bào)道可通過未成熟花序組織進(jìn)行體細(xì)胞胚胎發(fā)生，Verdeil J L等以椰子未成熟花序?yàn)橥庵搀w，經(jīng)間接體細(xì)胞胚胎途徑實(shí)現(xiàn)植株再生，Adkins S W等以椰子未成熟合子胚為外植體，誘導(dǎo)出愈傷組織和體細(xì)胞胚胎發(fā)生，Karunaratne S等利用6 7個(gè)月的椰子堅(jiān)果切離的胚為離體培養(yǎng)材料，研究了椰子未成熟胚的培養(yǎng)、愈傷組織增殖及體細(xì)胞胚胎發(fā)生。而有關(guān)利用椰子成熟合子胚為外植體誘導(dǎo)體細(xì)胞胚胎發(fā)生的研究，目前國內(nèi)外均未見相關(guān)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足而提供一種椰子成熟合子胚離體培養(yǎng)體細(xì)胞胚胎發(fā)生方法，解決了利用椰子未成熟花序或幼胚等獲得體細(xì)胞胚的外植體采集時(shí)間受季節(jié)限制的問題，為深入開展椰子的基因工程、遺傳轉(zhuǎn)化、品種改良等方面的研究提供了一條有效途徑。一種椰子成熟合子胚離體培養(yǎng)體細(xì)胞胚胎發(fā)生方法，包括胚的采集與預(yù)培養(yǎng)過程、胚性愈傷組織的誘導(dǎo)過程、體細(xì)胞胚胎發(fā)生過程，其步驟如下I、胚的采集與預(yù)培養(yǎng)過程選取10 11月齡的成熟椰果，取出內(nèi)有完整胚的固體胚乳塊，清洗后取出胚消毒，然后接種到預(yù)培養(yǎng)基中，置于相對濕度為70 80%、溫度25 29°C的條件下進(jìn)行暗培養(yǎng)12 17天，使胚膨大。所述預(yù)培養(yǎng)基是以Y3培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，并添加活性炭2. 5g/L、鹿糖 60g/L。
2、胚性愈傷組織的誘導(dǎo)過程取經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)的膨大的胚，將其吸器切除并縱切成兩半，切面朝上接種到愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，置于相對濕度為70 80%、溫度25 29°C的條件下進(jìn)行暗培養(yǎng)170 200天產(chǎn)生淡黃色顆粒狀的胚性愈傷組織。所述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基是以Y3培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，并添加 2，4-D 25mg/L、活性炭 2. 5g/L、PVP 5g/L、瓊脂 4. 5g/L、蔗糖 30g/L。3、體細(xì)胞胚胎發(fā)生過程將胚性愈傷組織轉(zhuǎn)接到體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，置于相對濕度為70 80%、溫度25 29°C、光照強(qiáng)度1500 25001x、光照12h/d的條件下培養(yǎng)80 100天形成體細(xì)胞胚。所述體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基是以Y3培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，并添加6-BA 10mg/L、2，4-D 2mg/L、活性炭2.5g/L、PVP 5g/L、瓊脂 4. 5g/L、蔗糖 30g/L。本發(fā)明工藝簡單，利用椰子成熟合子胚為外植體誘導(dǎo)體細(xì)胞胚胎發(fā)生，解決了利用椰子未成熟花序或幼胚等獲得體細(xì)胞胚的外植體采集時(shí)間受季節(jié)限制的問題，為深入開展椰子的基因工程、遺傳轉(zhuǎn)化、品種改良等方面的研究提供了一條有效途徑。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例，對本發(fā)明的具體實(shí)施方式
作進(jìn)一步詳細(xì)描述。以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例一I、胚的采集與預(yù)培養(yǎng)過程選取10 11月齡的成熟椰果90個(gè),去掉椰果外皮并用砍刀將椰果橫向裂開,用直徑為2 cm的打孔器取出內(nèi)有完整胚的固體胚乳塊，用自來水沖洗I 2h，然后在超凈工作臺上取出胚并進(jìn)行胚表面消毒，再接種到預(yù)培養(yǎng)基(Y3培養(yǎng)基+活性炭2. 5g/L+蔗糖60g/L)中，置于相對濕度為75%、溫度26°C的條件下進(jìn)行暗培養(yǎng)15天，使胚膨大。2、胚性愈傷組織的誘導(dǎo)過程取經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)的膨大的胚，將其吸器切除并縱切成兩半，切面朝上接種到愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基(Y3培養(yǎng)基+2，4-D 25mg/L+活性炭2. 5g/L+PVP 5g/L+瓊脂4. 5g/L+蔗糖30g/L)中，置于相對濕度為70%、溫度27°C的條件下進(jìn)行暗培養(yǎng)180天，產(chǎn)生淡黃色顆粒狀的胚性愈傷組織，結(jié)果見表I。3、體細(xì)胞胚胎發(fā)生過程取胚性愈傷組織50個(gè)轉(zhuǎn)接到體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基(Y3培養(yǎng)基+6-BA 10mg/L+2, 4-D2mg/L+活性炭2. 5g/L+PVP 5g/L+瓊脂4. 5g/L+蔗糖30g/L)中，置于相對濕度為75%、溫度25°C、光照強(qiáng)度23001x、光照12h/d的條件下培養(yǎng)90天形成體細(xì)胞胚，結(jié)果見表2。實(shí)施例二I、胚的采集與預(yù)培養(yǎng)過程選取10 11月齡的成熟椰果90個(gè)，去掉椰果外皮并用砍刀將椰果橫向裂開，用直徑為2 cm的打孔器取出內(nèi)有完整胚的固體胚乳塊用自來水沖洗I 2h，然后在超凈工作臺上取出胚并進(jìn)行胚表面消毒，再接種到預(yù)培養(yǎng)基(Y3培養(yǎng)基+活性炭2. 5g/L+蔗糖60g/L)中，置于相對濕度為80%、溫度28°C的條件下進(jìn)行暗培養(yǎng)16天，使胚膨大。
2、胚性愈傷組織的誘導(dǎo)過程取經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)的膨大的胚，將其吸器切除并縱切成兩半，切面朝上接種到愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基(Y3培養(yǎng)基+2，4-D 25mg/L+活性炭2. 5g/L+PVP 5g/L+瓊脂4. 5g/L+蔗糖30g/L)中，置于相對濕度為75%、溫度25°C的條件下進(jìn)行暗培養(yǎng)190天，產(chǎn)生淡黃色顆粒狀的胚性愈傷組織，結(jié)果見表I。3、體細(xì)胞胚胎發(fā)生過程取胚性愈傷組織50個(gè)轉(zhuǎn)接到體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基(Y3培養(yǎng)基+6-BA 10mg/L+2, 4-D2mg/L+活性炭2. 5g/L+PVP 5g/L+瓊脂4. 5g/L+蔗糖30g/L)中，置于相對濕度為70%、溫度27°C、光照強(qiáng)度20001x、光照12h/d的條件下培養(yǎng)80天形成體細(xì)胞胚，結(jié)果見表2。實(shí)施例三
I、胚的采集與預(yù)培養(yǎng)過程選取10 11月齡的成熟椰果90個(gè),去掉椰果外皮并用砍刀將椰果橫向裂開,用直徑為2 cm的打孔器取出內(nèi)有完整胚的固體胚乳塊用自來水沖洗I 2h，然后在超凈工作臺上取出胚并進(jìn)行胚表面消毒，再接種到預(yù)培養(yǎng)基(Y3培養(yǎng)基+活性炭2. 5g/L+蔗糖60g/L)中，置于相對濕度為80%、溫度25°C的條件下進(jìn)行暗培養(yǎng)13天，使胚膨大。2、胚性愈傷組織的誘導(dǎo)過程取經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)的膨大的胚，將其吸器切除并縱切成兩半，切面朝上接種到愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基(Y3培養(yǎng)基+2，4-D 25mg/L+活性炭2. 5g/L+PVP 5g/L+瓊脂4. 5g/L+蔗糖30g/L)中，置于相對濕度為75%、溫度26°C的條件下進(jìn)行暗培養(yǎng)200天產(chǎn)生淡黃色顆粒狀的胚性愈傷組織，結(jié)果見表I。3、體細(xì)胞胚胎發(fā)生過程取胚性愈傷組織50個(gè)轉(zhuǎn)接到體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基(Y3培養(yǎng)基+6-BA 10mg/L+2, 4-D2mg/L+活性炭2. 5g/L+PVP 5g/L+瓊脂4. 5g/L+蔗糖30g/L)中，置于相對濕度為78%、溫度28°C、光照強(qiáng)度18001x、光照12h/d的條件下培養(yǎng)100天形成體細(xì)胞胚，結(jié)果見表2。對比及結(jié)果胚性愈傷組織誘導(dǎo)率在培養(yǎng)期間以不同的轉(zhuǎn)接頻率為對照組，其他條件同實(shí)施例一，胚性愈傷組織誘導(dǎo)時(shí)間6個(gè)月(180天)。所得誘導(dǎo)率見表I。表I不同轉(zhuǎn)接頻率的胚性愈傷組織誘導(dǎo)率的比較
權(quán)利要求
1.一種椰子成熟合子胚離體培養(yǎng)體細(xì)胞胚胎發(fā)生方法，其特征在于，包括胚的采集與預(yù)培養(yǎng)過程、胚性愈傷組織的誘導(dǎo)過程、體細(xì)胞胚胎發(fā)生過程，其步驟如下 I)、胚的采集與預(yù)培養(yǎng)過程 選取10 11月齡的成熟椰果，取出內(nèi)有完整胚的固體胚乳塊，清洗后取出胚消毒，然后接種到預(yù)培養(yǎng)基中，置于相對濕度為70 80%、溫度25 29°C的條件下進(jìn)行暗培養(yǎng)12 17天，使胚膨大；所述預(yù)培養(yǎng)基是以Y3培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，并添加活性炭2. 5g/L、蔗糖60g/L ； 2)、胚性愈傷組織的誘導(dǎo)過程 取經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)的膨大的胚，將其吸器切除并縱切成兩半，切面朝上接種到愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，置于相對濕度為70 80%、溫度25 29°C的條件下進(jìn)行暗培養(yǎng)170 200天產(chǎn)生淡黃色顆粒狀的胚性愈傷組織；所述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基是以Y3培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，并添加 2，4-D 25mg/L、活性炭 2. 5g/L、PVP 5g/L、瓊脂 4. 5g/L、蔗糖 30g/L ； 3)、體細(xì)胞胚胎發(fā)生過程 將胚性愈傷組織轉(zhuǎn)接到體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，置于相對濕度為70 80%、溫度25 29°C、光照強(qiáng)度1500 25001x、光照12h/d的條件下培養(yǎng)80 100天形成體細(xì)胞胚；所述體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基是以Y3培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，并添加6-BA 10mg/L、2，4-D 2mg/L、活性炭2.5g/L、PVP 5g/L、瓊脂 4. 5g/L、蔗糖 30g/L。
全文摘要
本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種椰子成熟合子胚離體培養(yǎng)體細(xì)胞胚胎發(fā)生方法，是選取成熟椰果，取出胚接種到預(yù)培養(yǎng)基中進(jìn)行暗培養(yǎng)使胚膨大；取經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)的膨大的胚，將其吸器切除并縱切成兩半，切面朝上接種到愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行暗培養(yǎng)得到胚性愈傷組織；將胚性愈傷組織轉(zhuǎn)接到體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)80～100天形成體細(xì)胞胚。本發(fā)明工藝簡單，利用椰子成熟合子胚為外植體誘導(dǎo)體細(xì)胞胚胎發(fā)生，解決了利用椰子未成熟花序或幼胚等獲得體細(xì)胞胚的外植體采集時(shí)間受季節(jié)限制的問題，為深入開展椰子的基因工程、遺傳轉(zhuǎn)化、品種改良等方面的研究提供了一條有效途徑。
文檔編號A01H4/00GK102715088SQ20121023389
公開日2012年10月10日 申請日期2012年7月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月6日
發(fā)明者喬飛, 周煥起, 楊耀東, 沈雁, 許麗菁, 許小妹, 黃麗云 申請人:中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院椰子研究所, 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所